本研究介绍了一种从野生型新生小鼠中分离神经元的技术。该方法需要从新生小鼠中仔细解剖出脊髓，随后通过机械和酶解消化的方式将神经元从脊髓组织中分离出来。
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本文内容
摘要
摘要
我们介绍一种分离和培养脊髓神经元的实验方案。神经元取自新生C57BL/6小鼠，于出生后第1至第3天进行分离。一次实验通常收集一窝小鼠（一般为同一对亲本繁殖产生的4-10只幼鼠），在使用异氟烷实施安乐死后，分别从每只小鼠个体中取出脊髓。首先解剖出脊柱，随后将脊髓从脊柱中分离出来。接着将脊髓组织切碎，以增加酶解蛋白酶的作用表面积，从而促使神经元及其他细胞从组织中释放。随后通过吹打（trituration）使细胞进入溶液。该溶液继而通过密度梯度离心进行分馏，以分离溶液中的各类细胞，从而获得纯化的神经元。从一窝小鼠中大约可分离出1-2.5 × 106个神经元。分离所得神经元随后接种于预先包被有黏附因子的培养孔中，以支持其正常生长与成熟。神经元在生长和培养培养基中大约需要7天时间达到成熟，之后即可用于处理与分析。
引言
理解脊髓病理需要采用多种模型，涵盖宏观和微观层面。大动物和小动物模型1,2,3被用于脊髓疾病和损伤的体内研究。尽管体内研究具有其优势，但对脊髓的分析通常局限于全脊髓匀浆或组织切片4。这在试图分离脊髓中特定神经元及其周围胶质细胞的特异性反应和靶点时，带来一定模糊性。随着基因修饰小鼠的日益可及，使得在细胞和分子水平上进行更深入的生物学研究成为可能。因此，本文采用新生小鼠模型，以在体外研究脊髓神经元的独特特性和生物学行为。
神经元的分离与培养 体外 并不特别简单。目前已有多种从成年啮齿类动物皮层组织中分离神经元的技术，这些方法似乎能够获得数量可观的分离神经元（即 百万5,6,7相比之下，从脊髓组织中获得的神经元产量较低8,9,
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方案
本实验中动物的护理和处理均按照科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会的指南进行。
1. 溶液的配制
- 按照 表1 所示，将所有溶液在适当的温度下配制并保存。
2. 包被孔板和载玻片
注意：神经元在塑料或玻璃表面不易贴附。
- 在分离神经元的前一天，用0.5 mL多聚-D-赖氨酸（PDL；表2）包被无菌24孔培养板的孔，并将其置于超净工作台中过夜。
注意：推荐使用24孔板，且仅包被中央孔，因为边缘孔的蒸发速度较快，容易导致结果不一致。此外，可在包被前将玻璃盖玻片放入孔内。神经元将附着于包被后的玻璃盖玻片上，后续可取出用于显微成像。 - 在分离当天，从孔中移除PDL，用无菌水洗涤数分钟，随后去除残留水分，并在室温下干燥1小时（见下文）。
- 干燥后，用层粘连蛋白（laminin；表2）对盖玻片进行二次包被。
注意：每个无菌24孔板孔使用约10 μL层粘连蛋白（10 µg/µL）即可。将其与340 μL培养基混合（总体积为350 μL），以完全覆盖整个孔。在培养罩内室温孵育2小时，然后在接种细胞前吸除溶液。
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结果
利用该技术，单窝仔鼠（4-10只）可分离获得1-2.5×10⁶个细胞6 适用于接种到培养板上的神经元。通常，按照上述浓度接种4-8个孔。即 300,000 个细胞/mL 图3 展示了在此浓度下培养一周后低倍镜下的神经元形态a）和高-（b) 放大倍数的光学显微镜观察。然而，我们也成功实现了细胞培养浓度高达500,000个细胞/孔和低至100,000个细胞/孔的条件。使用较高浓度时需要添加更多培养基，并需密切监控环境条件，因为营养物质可能迅速耗尽，导致细胞处于有毒的酸性环境中。而在较低浓度下，细胞往往难以达到完全成熟状态，且支持细胞容易出现过度生长（即 观察到少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞。
细胞通常会在最初几个小时内开始贴附到表面
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讨论
该技术可实现脊髓神经元的可靠培养。掌握该技术后，完成整个操作大约需要3.5小时。我们曾用约4小时成功从两批独立的幼鼠（共16只小鼠）中分离出神经元。该技术可行性的关键步骤在于能否熟练地从小鼠体内提取脊髓。该方法的产量足以接种多个孔板，从而可在不同条件下对神经元进行测试。我们已能够在神经元成熟后对其进行处理，并利用Western blot分析可靠地评估蛋白表达水平。此外，在孔板内使用载玻片以促进神经元贴附，可进一步对神经元进行染色分析。
该方法的优势在于无需使用胚胎组织及其相关的高强度劳动。此外，无需使用成年脊髓即可获取足量组织以实现充分的神经元分离。这避免了年龄因素对神经元生理行为的叠加影响，而这种影响在成年小鼠中是存在的。然而，该技术也存在局限性。如前所述，使用新生小鼠会排除老年神经元，如果研究方向涉及年龄相关的行为与生物学特性，则可能构成限制。该操作技术存在学习曲线，不仅需要优化收获率，还需确保分离得到的神经元处于健康状态。脊髓提取技术需要一定时间才能掌握，尤其是针对新生小鼠的操作。我们注意到，脊髓提取过程耗时过长会导致所获得的神经元体外培养时间显著缩短。将神经元置于冰上可在一.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hibernate A 培养基 - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| 无钙 Hibernate A 培养基 - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 添加剂 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| 木瓜蛋白酶，冻干粉 - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A 培养基 - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| 聚-D-赖氨酸盐酸盐（PDL）- 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| 小鼠层粘连蛋白 - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| 台盼蓝 - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep 密度梯度介质 - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| 二氯二甲基硅烷（DMDCS，Sigma Silicoat） | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| 玻璃移液管 - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| 移液球 - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® 培养皿，玻璃 - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| 无菌 24 孔细胞培养板 | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser 血细胞计数板（玻璃计数室） | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| 玻璃载片 - 12 mm 无菌盖玻片 - 未包被 | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN 兔单克隆抗体 - 100 µL | Abcam | ab177487 | 经多聚甲醛（PFA）固定并用 5% BSA 封闭后，将 12 mm 盖玻片上的细胞在 4 °C 条件下与抗体（1:200 稀释）孵育 18 小时 |
| MAP-2 小鼠单克隆抗体 - 50 µL | Abcam | ab11267 | 经多聚甲醛固定并用 5% BSA 封闭后，将 12 mm 盖玻片上的细胞在 4 °C 条件下与抗体（1:500 稀释）孵育 18 小时 |
参考文献
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
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