从一种新型寨卡病毒感染性克隆中拯救与鉴定重组病毒

摘要

本方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中回收具有感染性的寨卡病毒的方法。

摘要

感染性cDNA克隆可实现对病毒的遗传操作，从而促进疫苗、致病机制、复制、传播及病毒进化等方面的研究。本文描述了一种寨卡病毒（ZIKV）感染性克隆的构建方法，该病毒目前在美洲地区引发大规模暴发流行。为避免黄病毒来源质粒在细菌中常见的毒性问题，我们构建了一个双质粒系统，将基因组在NS1基因处分割，其稳定性优于全长构建体；后者若无突变则难以成功回收。经酶切与连接反应将两个片段连接后，可体外转录生成全长病毒RNA 体外 使用T7 RNA聚合酶进行转录。将转录所得RNA通过电穿孔导入细胞后，成功回收到表现出相似特性的病毒 体外 生长动力学和 体内 小鼠和蚊子中的毒力和感染表型

引言

寨卡病毒（ZIKV；黄病毒科 Flaviviridae：黄病毒属 Flavivirus）是一种通过蚊子传播的黄病毒，于2013至2014年间传入巴西，并随后引发了一场大规模发热性疾病暴发，疫情蔓延至整个美洲地区¹。此外，ZIKV还与多种严重疾病结局相关，例如成人中的吉兰-巴雷综合征以及胎儿和新生儿中的小头畸形²。在该病毒于西半球迅速传播之前，人们对ZIKV的了解甚少，包括缺乏可用的分子工具，从而阻碍了对其致病机制的研究。针对病毒的分子工具，例如感染性cDNA克隆，有助于疫苗和抗病毒治疗药物的开发，并可用于评估与病毒致病性差异、免疫应答及病毒进化相关的病毒遗传因素。

黄病毒的感染性克隆由于其基因组中存在隐蔽的原核启动子，已知在细菌中极不稳定³已采用多种方法来改善这一问题，包括在病毒序列上游插入串联重复序列⁴，假定的原核生物启动子序列的突变⁵将基因组分割成多个质粒⁶，低拷贝数载体（包括细菌人工染色体）^7,8 病毒基因组中内含子的插入

方案

1. 感染性克隆质粒的转化与回收

1. 分别使用商业转化试剂盒对两个质粒进行转化（各自独立转化）例如，NEB 5分钟转化方案）并进行部分修改。两种质粒均含有编码氨苄青霉素抗性的基因，因此可使用氨苄青霉素或羧苄青霉素进行筛选。推荐使用羧苄青霉素，因其更为稳定。
   1. 从 -80 °C 中取出细胞（参见材料表） °C 冰箱中冷冻，并在冰上解冻 5-10 分钟。预热含 10 g/L NaCl 和 25 µg/mL 羧苄青霉素；称为 LB-carb）平板以及含有分解代谢抑制物的肉汤（SOC（不含抗生素）——随细胞提供）中，于 37 °C 培养 °C.
   2. 加入 100 pg–10 ng 至 1 µL 质粒 DNA 加入含有 50 的离心管中 µL 感受态细胞；轻轻弹击离心管混匀。
   3. 将离心管置于冰上孵育5分钟。
   4. 42℃热激试管 °30秒，水浴。热激后立即放回冰上2分钟。
   5. 移液 950 µ将1毫升室温的SOC加入每根试管中，用移液器吹打混匀。取100微升涂布于平板 µ将细菌混合物的 L 接种至 LB-羧苄青霉素平板上，37℃过夜培养 °C（约12-14小时）。
2. 从37℃移除培养板 °37°C 培养箱中培养 12-14 小时后，将....

结果

此处描述的实验方案可用于获得感染性克隆来源的寨卡病毒。与全长版本相比（全长版本极不稳定，数据未显示），在谨慎操作下，双质粒感染性克隆系统的操作更为简便。在对两个不同的片段进行酶切与连接后，使用体外转录系统生成带帽的RNA 体外 使用T7聚合酶进行转录，然后通过电穿孔将产物导入Vero细胞（图1）。质粒序列的正确性可通过小量提取质粒后进行限制性酶切消化作为替代方法进行检测（图 2a）以及在通过RCA或质粒大提进行大规模DNA制备后，经Sanger测序验证。在测序确认克隆正确后，仅需进行酶切和连接即可恢复获得具有感染性的病毒， 体外 转录，最后进行电穿孔。这些步骤可在一天内完成。可通过琼脂糖凝胶电泳监测酶切和连接的正确性（图2b），必要时可进行故障排查。

讨论

本文描述了一种寨卡病毒（ZIKV）双组分感染性cDNA克隆系统的构建方法。先前报道的ZIKV克隆系统存在减毒现象，或需插入内含子，导致质粒体积增大，并阻碍在昆虫细胞中拯救病毒。利用该双质粒克隆系统，可在哺乳动物细胞或昆虫细胞中成功拯救出具有感染性的病毒（数据未显示）。此外，从该系统拯救出的病毒在多种细胞系、免疫缺陷小鼠模型以及蚊虫中均表现出与野生型病毒相似的生物学特性。

由于黄病毒基因组中存在隐蔽的细菌启动子³，全长黄病毒克隆难以操作，常导致质粒中出现突变、插入、缺失或重排。为解决这些问题，我们将寨卡病毒（ZIKV）基因组拆分为两个质粒，从而打断病毒NS1基因中存在的毒性序列。该策略获得了一个更稳定的系统，并且易于引入遗传修饰。利用此克隆系统，我们已在ZIKV基因组中引入多个点突变，并在3'非翻译区（UTR）插入外源序列（数据未显示）。该系统还为研究致病性的遗传决定因素、构建疫苗候选株以及开发报告病毒提供了理想的起点。此外，克隆来源的病毒已被证实是研究病毒进化的重要工具²²。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEB Stable 感受态 E. coli	新英格兰生物实验室	C3040H
羧苄青霉素二钠盐	多个供应商
Zyppy 质粒小量提取试剂盒	Zymo 研究公司	D4036
ZymoPURE 质粒大量提取试剂盒	Zymo 研究公司	D4202
SalI-HF	新英格兰生物实验室	R3138S	20,000 单位/毫升
NheI-HF	新英格兰生物实验室	R3131S	20,000 单位/毫升
ApaLI	新英格兰生物实验室	R0507S	10,000 单位/毫升
EcoRI-HF	新英格兰生物实验室	R3101S	20,000 单位/毫升
BamHI-HF	新英格兰生物实验室	R3136S	20,000 单位/毫升
HindIII-HF	新英格兰生物实验室	R3104S	20,000 单位/毫升
illustra TempliPhi 100 扩增试剂盒	GE 医疗生命科学	25640010
NucleoSpin 凝胶与 PCR 产物纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740609.5
虾碱性磷酸酶 (rSAP)	新英格兰生物实验室	M0371S	1,000 单位/毫升
小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)	新英格兰生物实验室	M0290S	10,000 单位/毫升
T4 DNA 连接酶	新英格兰生物实验室	M0202S	400,000 单位/毫升
HiScribe T7 ARCA mRNA 合成试剂盒	新英格兰生物实验室	E2065S
Vero 细胞	ATCC	CCL-81
ECM 630 高通量电穿孔系统	BTX	45-0423	其他设备亦可接受。
含琼脂的 LB 培养基（Miller 配方）	Sigma	L3147	也可自行配制。
优质肉汤（Terrific Broth）	Sigma	T0918	也可自行配制。
培养皿	Celltreat	229693
培养管	VWR 国际公司	60818-576
T75 培养瓶	Celltreat	229340
T182 培养瓶	Celltreat	229350
1× PBS	Corning	21-040-CV
含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基	Corning	10-040-CV
含 L-谷氨酰胺和 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 培养基	Corning	10-017-CV
胎牛血清 (FBS)	Atlas Biologicals	FP-0500-A
刺梧桐胶粉末	MP Bio	MP 104792
结晶紫	Amresco	0528-1006
变性乙醇	VWR 国际公司	BDH1156-1LP
6 孔板	Celltreat	229106
12 孔板	Celltreat	229111
测序引物	IDT	见表 1
Qubit 3.0	赛默飞世尔科技	Qubit 3.0	其他方法亦可接受。
Qubit dsDNA BR 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32850	其他方法亦可接受。
Qubit RNA HS 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32852	其他方法亦可接受。
II 级生物安全柜	不同厂家	不适用	活病毒实验必需。