在这里, 我们描述了一种技术, 蛋白质膜红外电化学, 使固定化氧化还原蛋白的研究光谱在直接电化学控制的碳电极。单个蛋白质样品的红外光谱可以在一系列的应用电位和各种溶液条件下记录。
理解氧化还原蛋白的化学需要的方法, 提供精确的控制在蛋白质的氧化还原中心。蛋白质膜电化学技术, 即在电极表面固定蛋白质, 使电极取代生理电子捐献者或受体, 为不同的氧化还原反应提供了功能性洞察蛋白质.充分的化学理解需要电化学控制与其他技术相结合, 可以增加结构和机械的洞察力。在这里, 我们演示了一种技术, 蛋白质膜红外电化学, 它结合了蛋白质膜电化学和红外光谱取样的氧化还原蛋白。该技术采用多反射衰减总反射率几何来探测在高表面积炭黑电极上固定的氧化还原蛋白。将此电极并入流动单元, 可以在测量过程中改变溶液 pH 值或溶质浓度。这是特别强大的解决氧化还原酶, 在那里的快速催化周转可持续和控制的电极, 允许光谱观察长期居住的中间物种的催化机制。我们演示了在营业额 (H2氧化) 和非周转条件下的大肠杆菌氢1的实验技术。
在蛋白质功能研究中的一个关键挑战是发展的原位方法, 允许直接观察的蛋白质进行其生理作用, 无论是在体内或使用分离的蛋白质样本。这就要求将控制或触发过程集成到实验过程中, 并使用组合技术, 既可以评估反应性, 又能同时测量蛋白质功能中的个别化学步骤。在氧化还原蛋白的情况下, 这往往等同于结合电化学技术, 这恰恰控制了应用的潜力, 但没有提供直接的化学信息, 与光谱技术, 对化学特异性敏感与蛋白质功能相关的变化。1,2,3电化学是一系列耦合的电化学和光谱方法的通用术语, 包括各种光谱技术和电化学控制水平。许多蛋白质可以交换电子与人工, 可溶性电子捐助者和受体, 这已被利用的研究, 使用小分子调解电子转移, 包括与紫外可见的耦合,4,5,6, 7 磁性圆形二8及红外线5910111213波谱.在有限的数量的情况下, 它已被证明是可能的利用中介, 扩散控制的电子交换之间的蛋白质和电极。15,16
对于氧化还原酶进行的催化反应, 溶液电化学方法存在明显的缺点。扩散控制电子转移通过氧化还原介质在溶液中很可能成为速率限制。有关酶的动力学和机械信息可能会丢失, 或至少变得难以 deconvolute 从扩散文物产生的实验方法。因此, 直接、中介电化学控制是研究氧化还原蛋白和酶的重要工具。蛋白质膜电化学技术 (PFE) 采用电极固定化的氧化还原蛋白, 在这种方式下, 电子直接转移到或从氧化还原因子在蛋白质内, 因为电极是极化在一系列电位。17,18,19 PFE 对氧化还原酶的催化反应有特别的价值, 因为界面电子的转移可以以极高的速度实现。例如, 从Allochromatium vinosum中的镍铁 ([NiFe]) 氢的电催化周转率由 PFE 测量为ca 1000-1万 s− 1 , 用于 H2氧化。20电极电位作为触发催化 ‘ on ‘ 或 ‘ 关闭 ‘, 以及电催化当前的酶活性报告。因此, PFE 是一个很有价值的方法来分析复杂的酶的反应性密切依赖于潜力, 如反应的 di 铁活性部位的 [FeFe]-hydrogenases 与 CO 和 O2,21或潜在诱发失活反应的 hydrogenases,22一氧化碳脱氢酶,23和其他复杂的氧化还原酶。24
将光谱学技术与 PFE 提供的直接电化学控制相结合的主要障碍来自于氧化还原酶的低表面覆盖, 从A. vinosum中的 [NiFe] 氢的 1-2 pmol cm-2的顺序产生。20相对于原位表面科学研究小分子吸附在大块金属电极上的问题。这对光谱测量的灵敏度提出了挑战。在不同的电极上研究了固定化氧化还原蛋白的几种电化学方法: 透明金属氧化物电极上的紫外可见光谱;25,26,在金电极上的27荧光光谱;28,29表面增强红外吸收 (SEIRA) 在金电极上的光谱学;30,31,32,33和表面增强拉曼光谱技术, 主要是在银电极。34,35
在这里, 我们描述一种方法的耦合 PFE 与红外光谱, 在一个技术称为蛋白质膜红外电化学 (PFIRE)。36 PFIRE 方法研究了在高表面积碳工作电极上固定的氧化还原酶, 并结合衰减的全反射 ir (ATR-ir) 几何, 利用对碳表面上一系列蛋白质的吸附。红外光谱在氧化还原酶和蛋白质的研究中是有用的, 因为许多小分子, 配体和因子有诊断吸收, 可以用来评估反应性, 结合, 抑制和氧化还原状态。示例包括 NO 对铁硫中心的绑定,37 flavoproteins 的研究,38,39,40小分子绑定到血红素中心等。41 ATR-IR 几何允许构造一个优化的三电极 (分) 电化学电池42 , 从而提供优异的电化学控制。将参考电极置于工作电极附近可使溶液阻力和电位漂移最小化。使用高的表面积计数器电极, 与工作电极上的快速酶周转产生的高电催化电流相兼容。通过电化学细胞的溶液流动, 可以对基板、抑制剂和 pH 值的浓度进行简易控制。36,43,44因此, PFIRE 方法允许在持续酶催化期间将红外光谱记录到原位。36,44 PFIRE 还能够在没有催化电流的情况下提供化学信息,43与 PFE 相比, 在那里很难从氧化还原酶的非催化过程中提取信息。45,46
我们已经证明了 PFIRE 的方法, 研究的电催化 H2氧化的 [NiFe] hydrogenases, 其中含有内在 CO 和 CN 配体协调铁在一个双金属活性位点。36,43,因此, 44 [NiFe] hydrogenases 特别适合于 PFIRE。PFIRE 方法提供了关于在稳态流动期间存在的物种的信息, 因此提供了重要的机械洞察力, 除了在没有实验控制的 hydrogenases 红外光谱的文献的丰富。超过营业额。47,48戴尔和合作人员使用了时间解析的 IR 方法来研究 NiFe hydrogenases、49、50、51用一个轻触发器应用一个小的负电位步骤 (通过使用溶液介质和 “笼” 电子源) 或 photolyse 的束缚氢化物。虽然 PFIRE 方法目前不能提供时间分辨率来匹配这些测量值, 但40允许对还原和氧化催化过程进行研究, 并可在一系列定义良好的电位下访问, 而不需要大量运输限制.
PFIRE 方法有别于氧化还原蛋白的 SEIRA 研究, 它也使用 ATR 红外几何, 并采用纳米粗糙金属电极, 以提高吸附在电极表面的分子的 ir 吸收。30 SEIRA 是一种非常有价值的技术, 用于研究膜蛋白, 特别是在模拟膜体系结构中或在其内吸附,32 , 但对金属电极的需要可以限制由于反应性的基底和抑制剂范围对小分子的电极支持, 如 co、CN–, co2 等质子还原和自组装单分子膜解吸在极负电位的金属表面上可能有问题,1,52 , 尽管已报告无保护金属电极上的酶催化。53,54 PFIRE 相对于 SEIRA 的一个缺点是在本机或模拟膜结构中合并膜蛋白的相对困难。然而, 相对的化学惰性的碳电极的竞争小分子活化反应, 使 PFIRE 一个优秀的技术研究酶催化, 特别是在低电位领域与生物氧化还原过程, 如质子还原 hydrogenases。1,43
本文以 NiFe 氢 1 (Hyd1) 为例, 介绍了 PFIRE 法作为研究电极固定化氧化还原蛋白的技术. 讨论了样品制备、良好衬底流量的要求和数据处理。PFIRE 是一种广泛适用的技术, 非常适合研究任何氧化还原蛋白 (具有特征 IR 吸收), 可以吸附到碳电极上, 直接或使用表面修饰, 这样, 它可以交换电子与电极.
PFIRE 是一种广泛应用的红外光谱技术, 用于解决电极固定化的氧化还原蛋白。特别是, 在快速周转条件下, 可以探测氧化还原酶的电催化反应。PFIRE 方法是建立在直接电化学控制的基础上提供的 PFE 技术, 它提供没有直接的结构信息, 并与红外光谱在碳电极。因此, PFIRE 的方法增加了化学的洞察力, 仅从电化学中获得的信息, 非常适合研究氧化还原蛋白和参与小分子结合和活化的酶。此外, PFIRE 可以提供信息的潜在依赖性结构变化的蛋白质在没有催化周转。这种非周转的电子转移事件往往难以检测使用 “标准” 的应用 PFE, 虽然 PFE 扩展到傅里叶变换交流伏安法已成功地使用.45,46
PFIRE 方法, 原则上, 适合研究任何氧化还原蛋白, 可以研究使用 PFE。因此, 与 PFE, 蛋白质吸附是一个关键的步骤, 成功的 PFIRE 实验。在本协议中, 我们描述了一个应用的 PFIRE 技术使用大肠杆菌Hyd1 作为个案研究。36,43但是, 我们还将 PFIRE 技术应用于R. eutropha、44和黄素单吸附在炭黑上的细胞质调节氢。40在所有这些情况下, 对未被修改的高表面积炭黑的简单物理吸附 (如本协议所述) 提供了足够高的蛋白质表面覆盖率, 以记录高信噪比的高质量红外光谱。在无法达到如此高的吸附水平的情况下, 可能需要修改碳粒子的表面, 例如允许蛋白质与电极表面共价附着。60,61,62在研究必须处理厌氧的样本时, 仅严格需要使用手套进行 PFIRE 测量。然而, 在实践中, 极端恒定和低 (< 80 ° c 露点) 的水汽提供的手套大气的水平, 使高信号噪声水平, 允许提取非常小的吸收。44在许多情况下, 如手套提供的厌氧环境, 也需要电化学测量 (PFIRE 技术的积分), 以避免由于工作电极上的 O2减少而导致电流。
IR 吸收由于散装水, 实验缓冲器和碳粒子的样品被吸附所有贡献显着的实验谱, 并可能重叠的波段的兴趣, 特别是在酰胺 I, II 和 III 地区谱.63该酰胺区域还包含来自有机物种的信息, 如黄素或烟酰因子, 以及许多氧化和还原反应的基体和产品。在 NiFe hydrogenases 的情况下, 活动站点的νCO和νCN条带属于光谱中相对清晰的区域, 因此 PFIRE 技术非常适合于这些酶的研究。然而, 在其他情况下, 可能需要用不同的光谱和同位素标记方法来隔离由于固定化蛋白所引起的变化。类似的方法已被用来确定, 例如, 质子变化, 结构重和研究蔑氏配合使用红外光谱。64,65,因此, 66 PFIRE 不限于对 hydrogenases 的研究, 但可以应用于包含 (或其基质、产品或抑制剂含有) 具有诊断 IR 活性振动的组的任何氧化还原蛋白;例如, 一氧化碳 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40和甲酸脱氢。
SEIRA 的相关技术非常适合于仿生环境中膜相关蛋白的研究。32 SEIRA 是红外光谱的一种适应, 它也使用 atr-ir 配置, 并利用表面增强效应, 使位于靠近 (几 nm) 的分子的 ir 吸收度放大到 atr 棱镜 (愤怒) 的表面。因此, SEIRA 对在吸附的蛋白质和膜结构内发生的光谱变化非常敏感, 并且相对不受溶剂和基体/抑制剂在溶液中存在的竞争信号的影响。这与这里所描述的 PFIRE 技术相比是有些不同的, 它依赖于愤怒表面上明显更大的穿透深度 (〜1µm), 这意味着 PFIRE 对溶液中的基板、产品或抑制剂更敏感。这增加了对 ‘ 散装 ‘ 溶剂的敏感性可以是有利的;如果基材或产品可以直接通过 IR 观察, PFIRE 光谱报告的长期活种的稳态动力学和相关的产品形成在催化。69观察底物和产品的稳态浓度对诸如一氧化碳脱氢酶 (即催化 co 至 co 的可逆氧化反应的2、强 IR 吸收体) 的能力将特别有价值, 或甲酸脱氢酶 (催化甲酸可逆氧化为 CO2)。
目前, PFIRE 是有限的稳态动力学研究的酶催化由于宏观碳电极用于 ‘ 集中 ‘ 酶的表面上的愤怒的数据收集和 ATR-IR 几何。在这方面, PFIRE 对 NiFe hydrogenases 的研究是与戴尔和 co 工作者的工作互补的,49,50使用光触发瞬态吸收红外光谱来研究次周转动力学。正在进行的工作是小型化电化学单元格,40 , 并使用电极时间分辨率对微秒的顺序应该是可以实现的。这将有助于研究与营业额频率高达ca 100-500s-1的酶的次周转动力学, 并将有助于研究还原和氧化过程。
总的来说, PFIRE 是一种光谱学技术, 它允许在稳态条件下对氧化还原酶的电催化反应进行化学表征。PFIRE 方法允许在相同的酶样品上进行多种化学和电化学滴定, 因为所使用的高表面积电极提供了对蛋白质的强力吸附, 而 ATR-IR 几何允许简单的溶液交换。在酵素作用期间, 收集这样结构信息的能力在原位是一个可贵的工具为更加宽广的 bioelectrochemistry 社区。
The authors have nothing to disclose.
K.A.V. 和 P.A.A. 的工作得到了欧洲研究理事会 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600)、工程和自然科学研究理事会 IB 催化剂奖 EP/N013514/1、生物技术和生物科学研究理事会 (BB/L009722/1 和 BB/N006321/1)。右侧得到了 Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, 哥斯达黎加大学和林肯学院, 牛津。作者承认 Mr. 查理-琼斯, Mr. 查理. 埃文斯和机械车间 (化学系) 的工作人员, 协助设计和制造用于这项工作的电化学细胞。
Spectrometer | Agilent | 680-IR | with an external MCT detector |
ATR accessory | Pike Technologies | GladiATR | Customised for use with a 5-reflection Si IRE |
Glovebox | Glove Box Technology Ltd. | N/A | Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement |
KBr window | Crystran | Custom | To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer |
Additional optics | Agilent | N/A | Components from a PM-IRRAS accessory |
Silicon IRE | Crystal GmbH | Custom | Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle |
Potentiostat | Metrohm | Autolab PGSTAT 128N | |
Nova 10.1 | Metrohm | Software for controlling the potentiostat | |
Peristaltic pump | Williamson Manufacturing Company Ltd | QL-1000-024-300 | |
Pt wire | Surepure Chemetals | 3272 | 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter |
Carbon rod | WH Smith | 30729209 | 0.7 mm HB pencil lead |
Carbon black | Cabot Corporation | Black Pearls 2000 | |
Ultrasonic bath | Ultrawave | U100 | 35 W |
Centrifugal filter | Merck Millipore | UFC5050BK | Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5452000018 | MiniSpin |
NaCl | Sigma | 71376 | |
H2SO4 | Fisher | S/9240/PB17 | |
HNO3 | Fisher | N/2300/PB17 | |
silicone sealant | Cow Corning Toray Co., Ltd. | SE 4486 | |
Carbon paper | Toray | TGP-H-030 | |
H2 gas | BOC | ||
N2 gas | BOC | ||
OriginPro 2015 | OriginLab | Data analysis/graphing software | |
Resolutions Pro 4.0 | Varian | Software for controlling FTIR spectrometer |