量化睡眠小鼠谱功率与心率的极慢动态变化

摘要

本文介绍了描述小鼠非快速眼动睡眠期间神经和心脏变量时间动态的实验与分析方法，这些变量可调节睡眠对声学刺激的反应性。

摘要

哺乳动物的生命主要由三种警觉状态主导：清醒、非快速眼动（非REM）睡眠和REM睡眠。随着在自由活动动物中发现越来越多与行为相关的神经活动特征，这种三分法显得过于简单。在清醒状态下，全局和局部皮层活动的集合，以及瞳孔直径和交感-迷走平衡等外周生理参数，共同定义了不同程度的觉醒水平。目前尚不清楚睡眠是否也构成一个连续的脑状态谱系，在这一谱系中，对感觉刺激的抵抗能力、唤醒能力以及其他可能的睡眠功能是否逐渐变化，以及外周生理状态如何随之协同变化。推进睡眠期间多参数监测方法的研究，并将这些功能特征组合进行归因，对于深化我们对睡眠作为一种多功能过程的理解至关重要——在此过程中，许多有益效应必须得以实现。识别表征睡眠状态的新参数，将为睡眠障碍的诊断开辟新的途径。

我们介绍了一种通过联合监测和分析脑电图（EEG）/皮层脑电图（ECoG）、肌电图（EMG）和心电图（ECG）信号，结合标准多导睡眠图记录技术，来描述小鼠非快速眼动（non-REM）睡眠状态动态变化的方法。利用该方法，我们发现小鼠的非快速眼动睡眠由一系列协调的神经与心脏振荡周期组成，这些周期产生对外部刺激具有高敏感性和低敏感性的交替阶段，每个阶段持续约25秒。因此，在稳定的非快速眼动睡眠期间，中枢神经系统与自主神经系统协同作用，形成行为上可区分的睡眠状态。本文还介绍了用于多导睡眠图（即， 结合脑电图（EEG）/肌电图（EMG）与心电图（ECG）监测，以追踪自由睡眠小鼠的睡眠周期，分析其动态变化，并采用声学刺激方案评估其对觉醒可能性的影响。该方法已拓展应用于人类睡眠研究，有望揭示哺乳动物非快速眼动（非-REM）睡眠状态的共同组织原则。

引言

哺乳动物的睡眠是一种处于休息状态且对环境刺激具有抵抗性的行为状态。尽管表面上看似一致，多导睡眠图和自主神经参数表明，睡眠在不同时间尺度和空间尺度上会在性质和数量上存在差异的神经和躯体状态之间转换¹。在数分钟至数十分钟的时间范围内，会发生非快速眼动（non-REM）睡眠与快速眼动（REM）睡眠之间的转换。非REM睡眠伴随着脑电图（EEG）中大振幅、低频率的活动，其频谱峰值约为 ~0.5 - 4 Hz；而REM睡眠则表现出规则的θ频段（6 - 10 Hz）脑电活动，并伴有肌肉失张力²。在非REM睡眠内部，人类会循环经历浅睡眠（S2）和深部慢波睡眠（SWS）。正如其名称所示，这两个阶段分别具有较低和较高的觉醒阈值^3,4，主要区别在于低频皮层脑电功率的密度，即所谓的慢波活动（SWA；0.75 - 4 Hz）。即使在单次S2和SWS期间，这种非均一性仍持续存在于分钟到亚秒级的时间尺度上，这不仅表现为慢波活动在一次睡眠片段中出现的可变性^5,6，也体现在更高频率的脑电图和场电位节律上，包括σ频段（10-15 Hz）的纺锤波和γ节律（80 - 120 Hz）（综述见^7,8,9,10）。

这些变化并非细微，而是会将人类的睡眠皮层状态推向频谱的极端。对于非快速眼动（non-REM）睡眠，其范围从以慢波活动（SWA）为主的状态，到因含有大量高频成分而接近觉醒样活动的状态^11,12。在啮齿类动物和猫中，尽管非快速眼动睡眠未被划分为不同阶段，但在快速眼动（REM）睡眠开始之前会出现一个短暂的中间睡眠期（intermediate sleep, IS）¹³。在IS期间，REM睡眠的特征（如海马θ活动和脑桥-膝状体-枕部波）开始出现，同时非REM睡眠的标志性特征（如纺锤波和SWA）仍然存在，表明两种睡眠状态相互混合^14,15。然而，IS在功能上可能具有独特性，因为它可受抗抑郁药物的调节¹⁶，也可通过先前觉醒期间的新物体呈现而改变¹⁷，并且参与设定觉醒阈值¹⁸。此外，自由活动大鼠的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）参数的状态空间图显示，非REM睡眠、REM睡眠和觉醒之间存在一个连续的点簇分布¹⁴。在未进入觉醒或REM睡眠的情况下，SWA也会出现偶发性下降，导致在一次连续的非REM睡眠过程中，低频与高频成分的相对比例发生显著波动^14,19,20。最后，非REM睡眠期间SWA与较高频率节律的比率变化不仅随时间而变，还在不同皮层区域之间表现出振幅和同步性的区域性差异¹⁹。

哺乳动物的非快速眼动睡眠远非均一。然而，这种非均一性是否会导致在功能和行为特征上不同的睡眠状态，目前尚不明确。在多种类型的睡眠障碍中，持续的睡眠会因自发性觉醒和不适当的运动行为而中断。此外，频谱分析显示脑电图（EEG）中较高频率成分的相对比例发生变化²¹，自主神经参数（如呼吸频率和心率）也出现改变²²。因此，稳定的睡眠状态之间的有序序列受到干扰，皮层和/或自主神经系统的觉醒成分以不受控制的方式侵入睡眠过程。由此可见，理解睡眠状态的连续性变化可能对疾病机制具有重要意义。此外，在城市环境中，环境噪声对睡眠的干扰与总体健康风险相关，因而明确睡眠期间 heightened vulnerability 的关键时段显得尤为关键²³。

在睡眠人类中进行的行为觉醒实验表明，从以慢波活动为主导的非快速眼动睡眠（S3期）中唤醒最为困难，而从浅层非快速眼动睡眠（S2期）和快速眼动睡眠中唤醒则具有相似且较低的觉醒阈值⁴。短声刺激在快速眼动睡眠、S2期和S3期之间的皮层处理存在显著差异^24,25，表明状态特异性的皮层活动模式会调节感觉处理的初始阶段。对于人类的非快速眼动睡眠，个体因噪声而觉醒的可能性随脑电图中纺锤波和α节律的存在而变化^26,27,28。纺锤波期间丘脑-皮层节律性活动伴随着丘脑和皮层水平突触抑制的增强，这被认为有助于感觉信息处理的减弱⁷。

睡眠中抗干扰期与易感期在时间上是如何组织的？其决定因素是什么？我们最近在小鼠和人类中均发现了一种超慢的、频率为0.02 Hz的神经节律振荡。根据这一0.02 Hz振荡的相位不同，小鼠对外部刺激的反应表现出差异：有时会被噪声唤醒，有时则能继续安睡。有趣的是，该振荡与心率变化相关，表明自主神经系统参与了睡眠对外部刺激易感性的调节¹。与记忆相关的海马节律也在此振荡中呈现规律性组织，尤为引人注目的是，其振幅强度与人类记忆巩固的质量呈正相关。因此，0.02 Hz振荡似乎是调控啮齿类和人类非快速眼动睡眠的一个组织性原则，同时调节着对外界环境的敏感性以及内部记忆加工过程。这一发现再次强调了对睡眠状态进行多参数、连续性评估的重要性，以揭示其功能特性并识别潜在的脆弱环节。

本文介绍了一种提取这些动态波形的方法，包括小鼠手术植入以进行联合脑电图（EEG/ECoG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）测量、感官刺激暴露以及数据分析流程。该方法为将睡眠视为一种持续变化但高度有序的警觉状态提供了基础，在此状态下，不同的基本睡眠功能依次执行。更广泛而言，该方法适用于在健康和疾病状态下，旨在提取睡眠期间行为结果 preceding 的频谱和自主神经特征的研究策略。

方案

所有实验操作均遵循洛桑大学动物护理委员会以及沃州消费与兽医事务局的规定进行。

1. 用于脑电图/肌电图-心电图记录的手术

1. 动物饲养与选择
   1. 将动物（C57Bl/6J，7 - 9 周龄，25 - 30 g）单独饲养于标准条件下（40% 湿度，22 °C），保持 12 小时黑暗/12 小时光照循环，并自由供应食物和水 随意摄取.
   2. 仅使用雄性受试者，以避免激素周期对睡眠的所有影响。
2. 电极的制备
   1. 使用约0.5 cm长的金丝（75% Au，13% Ag，12% Cu；直径：0.2 mm）制作脑电图/皮层脑电图（EEG/ECoG）电极（用于步骤1.3.11），将每段金丝焊接到镀金钢螺丝（长度3 mm，基部直径1.1 mm）顶部（参见 图1）。为每只动物准备2个脑电图（EEG）电极，并用70%乙醇清洗。
   2. 使用长度为 3 - 4 cm 的金丝（75% Au，13% Ag，12% Cu；直径：0.2 mm）制备肌电-心电电极。将金丝一端距末端 1 cm 处弯成 90° 角，在另一端制备一个线圈（直径 1 - 2 mm）。图1在两端之间弯曲金属丝，形成一个小的弧度，以匹配小脑与人字缝之间颅骨表面的轮廓。
      1. 每只动物准备2个EMG-ECG电极。
   3. 准备一个6通道雌对雄排针连接器（栅格：2.54 mm × 2.54 mm，尺寸：5 mm × 8 mm × 9 mm，针脚长度：5 mm；参见 图1).
      1. 用胶带覆盖公头和母头针脚底部的连接器。
      2. 向6个雄性针脚中的4个针尖添加少量焊锡丝，以辅助手术过程中脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）电极的焊接（见步骤1.3.16）。

图1。小鼠颅骨上脑电图（EEG）和肌电图（EMG）电极植入位点的示意图。
颅骨开窗#1和#2位于中线外侧约2 mm、前囟（bregma）前方约2 mm处。颅骨开窗#3和#4位于人字缝（lambda）前方约2 mm处，分别位于中线外侧4 mm和2 mm。两个脑电图电极由金丝焊接在镀金钢螺钉（#2和#4）顶部制成，位于右侧半球。左侧两个螺钉（#1和#3）作为支撑。注意：EMG-ECG电极不应与这两个支撑螺钉接触。EMG-ECG电极为长3–4 cm的金丝，其头端约1 cm部分弯成90°角，尾端盘绕成线圈（直径1–2 mm）。两个EEG电极和两个EMG电极通过将每根导线焊接到2×3通道头端连接器的一个角针上进行连接，如虚线所示。有关这些电极及其植入方法的更多详细信息，见文献 ²⁹。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 植入手术。
   1. 将动物置于异氟烷诱导室中进行麻醉（4 - 5% 异氟烷 + O₂，流速 1 - 2 L/min，持续 3 - 4 分钟）。从诱导室取出小鼠、准备进行立体定位固定前，腹腔注射（i.p.）5 µg/g 卡洛芬。
   2. 按照标准操作流程将小鼠固定在立体定位仪上。通过气体面罩维持异氟烷麻醉（固定期间使用 3% 异氟烷 + O₂，流速 1 L/min）。在整个手术过程中使用加热垫维持动物体温在 37 °C。
      1. 使用维生素 A 软膏涂抹眼睛以防止角膜干燥。通过测试足爪回缩反射来检查动物的外科麻醉深度。
   3. 将耳杆以其钝端而非尖端置于颅骨上（不插入耳道），以固定头部²⁹。按常规方式调整门齿杆位置，确保头部处于水平状态。
      注：此固定方式可最大限度减少对耳部的损伤，对于后续听觉唤醒实验至关重要（见本方案第 4 节）。
   4. 在手术过程中持续监测动物呼吸频率，应维持在约每 2 秒 2 - 3 次。必要时调整气体挥发罐中的异氟烷浓度；手术过程中应逐步降低浓度，从固定时的 3% 逐渐降至手术结束时的 1.0 - 1.5%。
   5. 每小时使用超细胰岛素注射器腹腔注射 100 µL 0.9% NaCl，以维持动物体液平衡。
   6. 确保动物头部被明亮光源充分照射。
   7. 使用 70% 乙醇和含碘消毒剂清洁手术区域（湿润毛发可防止毛发进入手术视野）。
   8. 用 Adson 镊子提起颅骨中线处的皮肤，使用精细剪刀沿中线方向从颈部顶端至眼睛水平处剪开所提起的皮肤。去除头皮组织（前后方向约 1 cm，左右方向约 0.5 - 0.8 cm）。
      1. 确保开窗范围足够宽（向两侧延伸），以便清晰观察颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）裂隙。使用止血夹将两侧皮肤固定，以充分暴露颅骨。
   9. 用手术刀小心刮除结缔组织（骨膜）。使用含碘消毒剂清洁该区域，并用无菌消毒棉签擦干颅骨表面。
   10. 使用锋利的手术刀片（15 号）刮擦颅骨，获得清洁且无光泽的骨面。仅使用刀尖以约 1 - 2 mm 间距刮出网格状划痕。
       注：此步骤有助于在第 1.3.15 步中增强双组分环氧胶与颅骨的粘附力。
   11. 使用微型钻头（1/005 规格）在颅骨特定位置钻出 4 个颅骨开孔（直径约 0.7 mm）（图 1；另见第 1.3.11.3 步）。用巴斯德移液管吹走骨屑，并用无菌消毒棉签清除出血。
       1. 若发生出血，必须确保完全止血后方可继续操作。可使用止血海绵加速止血。
       2. 使用右侧半球的两个开孔插入螺钉电极（开孔 #2 和 #4）。
       3. 使用左侧半球的两个开孔插入固定螺钉，用于稳定植入物（开孔 #1 和 #3）。
          注：为增强稳定性，最多可使用 4 枚固定螺钉²⁹。
          注：精确的立体定位坐标如下：双侧半球距中线 2 mm，前囟前 2 mm（开孔 #1 和 #2）；后囟前 2 mm，中线左侧 4 mm（开孔 #3）；后囟前 2 mm，中线右侧 2 mm（开孔 #4）。参见 图 1。
   12. 在左侧半球，将两个镀金螺钉穿过开孔旋入颅骨以提供支撑。
       1. 用止血钳夹住螺钉并垂直置于开孔上方。小心地将螺钉底部对准开孔位置，在保持垂直状态下旋转旋入。
          注：仅需旋转 1.5 圈即可获得良好的机械稳定性与高质量信号，同时最大限度减少对下方组织的压力²⁵。
       2. 在右侧，将此前制备好的电极（见第 1.2.1 步）旋入对应的开孔中。
   13. 借助镊子小心提起颈部肌肉处的皮肤边缘。将 EMG-ECG 导线以线圈端分别插入左右侧肌肉内。将导线中段粘附于颅骨上，使左侧 EMG-ECG 导线从后侧左固定螺钉旁引出，右侧 EMG-ECG 导线从前侧左固定螺钉旁引出。
   14. 为在睡眠期间有效检测心脏 ECG 信号，应确保 EMG-ECG 导线插入肌肉深度约为 0.8 - 1 cm，且其环形末端尽可能远离彼此。
   15. 使用涂有双组分环氧胶的刮刀，在螺钉之间及周围区域均匀涂抹胶体。在光照下使其干燥，但需保护动物眼睛免受强光刺激。
       注：螺钉基部必须完全被胶覆盖，仅导线部分应暴露于胶外。
   16. 确保胶体填充于两根 EMG-ECG 电极引线之间的空隙，防止其与支撑螺钉之间产生电接触。务必仔细操作，避免将皮肤粘连至颅骨；皮肤应可在胶体周围自由活动。
   17. 剪裁 EEG 和 EMG-ECG 导线，使其从胶体中伸出约 0.5 mm。将第 1.2.3 步中准备好的连接器四角的引脚分别焊接到从胶体中引出的四根导线上（图 1）。
       1. 尽量将连接器引脚贴近排列，以降低植入物高度；可使用连接至立体定位支架的小型鳄鱼夹固定连接器位置。尽量减少烙铁接触时间，以免迅速加热螺钉。
   18. 用牙科水泥填充胶体与连接器之间的空隙，覆盖所有焊接部位。修整表面使其平滑，避免产生可能损伤动物的锐利边缘。此外，避免接触皮肤，以防引起瘙痒。
   19. 移除止血夹。必要时，在连接器前后使用无菌缝合线（可吸收缝合纤维）进行间断缝合，每处打两个方结（5-0 FS-3 针，45 cm 缝线），关闭切口。
   20. 持续监测动物直至完全清醒。术后称量动物体重，并将其放回原饲养笼中恢复。
4. 术后护理及系统连接。
   1. 术后每天监测动物一次，持续一周。观察是否有体重下降、活动减少或异常行为、感染迹象等。遵循本单位兽医主管部门制定的评分标准进行评估。
   2. 术后 5 - 6 天，将记录电缆连接至动物头部的连接器，让动物留在其原饲养笼中。再等待 4 - 5 天后开始记录，以确保动物充分适应该状态并能自然睡眠。

2. 基于脑电图/肌电图-心电图数据的基本评分以确定警觉状态

1. 使用商用多导睡眠图软件连续记录48小时的脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）数据例如， Somnologica、SleepSign 或 Sirenia。使用典型设置，例如 2,000 倍增益；采集时采样率为 2,000 Hz，采集后下采样至 200 Hz；脑电图（EEG）采用 0.7 Hz 高通滤波器，肌电图-心电图（EMG-ECG）采用 10 Hz 高通滤波器。
2. 以“.edf”文件格式导出数据。
3. 使用自定义编写的程序打开“.edf”文件（例如， 使用Matlab软件对每4秒时段进行半自动分类，判断其为清醒状态、非快速眼动睡眠（non-REM sleep）、快速眼动睡眠（REM sleep）及相应伪迹。
   注意：此外，目前已有多种半自动评分软件可供使用。本流程描述了使用此处所用评分软件进行评分设置时必须完成的一些基本步骤；其他半自动评分系统可能基于不同的参数。
4. 使用软件将“.edf”文件分割为4段，每段12小时的记录。
   1. 去除脑电图信号中由肌电-心电活动产生的伪迹或无法归因于特定行为状态的伪迹^1,29.
   2. 计算绝对脑电图（EEG）的平均值_平均值）以及肌电图（EMG_平均值脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）记录信号在12小时内的数值。
   3. 确定每个4秒时段的EEG/EMG平均值（EEG_时期/肌电图_时期).
   4. 将脑电图（EEG）记录的时段分类为“清醒”状态_时期<脑电图_平均值 和肌电图（EMG）_时期>肌电图_平均值 以及当脑电图显示为“非快速眼动睡眠”时_时期>脑电图_平均值 和肌电图（EMG）_时期<肌电图_平均值
   5. 根据前一个和后一个时段，使用校正算法对不满足这些标准的时段进行分类。
   6. 当脑电图显示为REM睡眠时，将该时期分类为REM睡眠_时期<脑电图_平均值 和肌电图（EMG）_时期<肌电图_平均值.
   7. 优化关键点，例如从非快速眼动睡眠到清醒的转换、快速眼动睡眠时段，以及非快速眼动睡眠期间的微觉醒。通过视觉检查评分结果，确保警觉状态判断准确^29,30.
      注意：务必对评分结果进行最终的视觉检查与验证。

3. 脑电与心跳的超慢振荡分析

1. 进行此分析时，仅选择持续时间 ≥ 96 s 的非快速眼动睡眠（non-REM）片段（即 至少 24 个 4 s 的时段）；参见 图 2。
   注意：定制化分析程序可根据要求提供¹。

图2．在无干扰的非快速眼动睡眠期间确定σ波功率动态变化。
（A）上方，一只小鼠在光照期前100分钟内的脑电图（黑色）和肌电图-心电图（灰色）记录。警觉状态由原始记录上方的彩色条形标注。中间，一个典型的连续（>96秒）非快速眼动睡眠片段示例。下方，随机选取的一个16秒时间段，显示其被划分为4个4秒的时段。后续分析步骤仅针对这四个时段展示，但该方法适用于该睡眠片段中包含的所有时段。（B）上方，由A图底部面板所示的四个4秒时段生成的四个连续快速傅里叶变换（FFT）频谱。σ频带（10–15 Hz）以红色阴影标出。右上角，最后一个时段中1秒的放大图，显示平方处理后的肌电图-心电图信号中存在的R波。下方，从上方对应频谱中提取的σ波功率随时间的变化过程。虚线表示所选四个非快速眼动睡眠时段之前和之后的功率值延续情况。（C）归一化的σ波功率（红色）和心率（以每分钟心跳次数BPM表示）（灰色）的时间过程，其中（B）图所示部分位于两条垂直虚线之间。下方为相应σ频带（10–15 Hz）滤波后的脑电图信号。（D）对（C）图所示σ波功率时间过程进行快速傅里叶变换（FFT）分析的结果，显示在0.016 Hz处存在一个主导峰。请点击此处查看该图的高清版本。

2. 使用快速傅里叶变换（FFT）计算，提取σ频段（10-15 Hz）在4秒时间窗内的谱功率值（图2A 和 B）¹。
3. 通过计算所有非快速眼动（non-REM）睡眠片段中各频率段谱功率的平均值，确定non-REM睡眠的基线谱功率（排除伪迹以及警觉状态转换期间的片段）。将每个片段的σ波功率值相对于感兴趣时间段内non-REM睡眠期间σ频段的平均功率进行归一化处理，并绘制随时间变化的曲线（图2C）。
4. 对σ波功率的时间序列进行快速傅里叶变换（FFT），采用汉明窗（Hamming windowing），以揭示功率动态中的振荡频率成分（图2D）¹。
5. 注意，由于non-REM睡眠片段的持续时间不同，所得FFT具有不同的频率分辨率。需进行插值处理，将所有片段的分辨率调整至最长non-REM睡眠片段所获得的最高分辨率，然后对所有片段的FFT结果进行平均。
6. 继续开展此类分析，以描述脑电图（EEG）与心电图（ECG）信号动态之间的相位关系。
7. 对平方后的EMG-ECG信号进行30 Hz高通滤波后，使用适当的R波峰值检测程序提取心跳数据。
   注意：将连续两个R波之间的最短时间间隔限制为80 ms，有助于避免因肌肉抽搐引起的偶发性伪迹峰被误检¹。
8. 测量RR间期，并计算每4秒时间窗内的平均心率（单位：每分钟心跳次数，BPM）（图2B 和 C）。

4. 噪声暴露

1. 生成噪声 即， 通过自行编写的软件生成白噪声，持续时间为 20 秒，强度为 90 dB SPL（在笼内测量）。通过标准有源扬声器播放噪声¹.
2. 手术后，在适应记录条件期间，全天随机播放实验噪声，每日多次，且在不同时间点进行¹.
3. 在实验条件下（记录脑电图/肌电图/心电图数据时），在光照开始（ZT0）后的前100分钟内随机播放噪声。播放噪声时需满足以下条件¹:
   1. 确保小鼠已处于非快速眼动睡眠阶段 > 40 秒。
   2. 确保前一次曝光发生在4分钟以上。
      注：这将导致每次会话约15次暴露。
4. 标记记录时间的起点以及每次噪声暴露的开始时刻。在实验过程中，保持实验操作者对非快速眼动睡眠期间的频谱成分处于盲态。
5. 使用多导睡眠图软件采集所有数据^1,29.

5. 基于噪声暴露期间行为结果的睡眠回顾性分析

1. 以4秒为分辨率，手动对EEG/EMG-ECG信号进行分期评分，且评分时不知晓噪声暴露时间¹。
2. 使用自定义脚本提取EEG/EMG-ECG/噪声暴露数据¹。
3. 当噪声暴露期间EEG和EMG信号均无变化时，评分为“持续睡眠”（图3A）；当EEG振幅降低、EEG频率升高，并伴随EMG-ECG电极检测到肌肉活动时，判定为“觉醒”（图3B）。
4. 剔除动物在刺激前阶段或噪声暴露最初4秒内发生觉醒的试验数据（图3D）。
5. 将觉醒成功率定义为所有纳入试验中觉醒试验所占的比例（“觉醒”与“持续睡眠”）。
6. 在所有纳入的试验中，分析刺激前阶段σ波功率的动态变化（图3E）¹。

图3。对噪声起始的行为反应：被保留或排除在分析之外的代表性结果。
(A-D) 噪声起始前40秒及噪声持续20秒期间的脑电图（EEG，黑色）和相应的肌电图-心电图（EMG-ECG，灰色）信号的原始轨迹，蓝色阴影区域表示噪声时段。警觉状态以颜色编码标示。为说明被纳入分析的数据，展示了典型的“持续睡眠”(A) 和“觉醒”(B) 事件。被剔除的结果包含向快速眼动（REM）睡眠的转换(C) 以及过早的“觉醒”反应(D)。插图显示了REM睡眠特征性的EEG和EMG-ECG轨迹的放大片段。(E) 在“持续睡眠”（左）和“觉醒”（右）事件中，噪声起始前40秒时间窗内σ波功率动态的典型示例。上方显示的是针对σ频段进行带通滤波后的原始EEG轨迹。蓝色区域表示噪声起始。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

图2A （上图）显示了通过多导睡眠图电极记录的100分钟自发睡眠-觉醒行为，电极植入方法如前所述（见 图1). 非快速眼动睡眠（non-REM）开始时，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）振幅的升高与降低清晰可见。间歇出现的快速眼动睡眠（REM）以EEG振幅下降及EMG张力进一步降低为特征，但由于时间尺度压缩，此变化在此图中不可见。放大观察一次非快速眼动睡眠片段，可清晰看到EEG中的高振幅慢波，以及EMG-ECG轨迹中较低的肌肉活动，心率的RR间期以垂直偏转形式叠加于其上。图2A，中图和下图）。快速傅里叶变换（FFT）显示，在所有4秒时间段内，慢波活动（SWA）均占主导地位（图2B）。绘制每个时段的平均sigma功率（10 - 15 Hz...

讨论

本文展示了如何建立整合脑电图（EEG）、肌电图（EMG）和心电图（ECG）变量的非快速眼动睡眠（non-REM sleep）连续时间谱型。这是构建小鼠睡眠整合性描述的第一步，有助于识别在非快速眼动睡眠期间对噪声具有高或低恢复力的先前未被认知的时间尺度¹。通过类似的分析方法，人类非快速眼动睡眠中也已描述了相似的时间结构¹。

本文介绍的方法实现了两个目标。首先，我们指出，多导睡眠图技术能够可靠地在整个小鼠非快速眼动（non-REM）睡眠期间同步获取脑电图（EEG）和肌电图-心电图（EMG-ECG）信号。在快速眼动（REM）睡眠期间，由于肌肉张力消失，心跳信号在肌电图（EMG）记录中最为明显；而在非快速眼动睡眠期间，由于肌肉张力增加以及偶尔出现的肌肉抽动，心跳信号则变得较为隐蔽。将EMG-ECG电极更深地插入肌肉组织，并尽可能增大电极间距，可增强心电R波的振幅，使其能够清晰地从背景肌张力中显现出来。随后，通过峰值检测算法从非快速眼动睡眠期间的EMG-ECG信号中提取心率，并进一步量化其变异性。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双组分环氧胶	Henkel	Loctite EA 3450
可吸收缝合线（Prolene）	Ethicon	5-0 FS-3
Adson镊子	FST	11006-12
消毒棉片	VWR	149-0332
Attane异氟烷	Piramal	Isoflurane 250mL
3 x 2通道连接器	ENA AG	2.316	栅距2.54 x 2.54 mm；尺寸5 x 8 x 9 mm；针脚长度5 mm；http://www.ena.ch/
Dragonfly换向器	Dragonfly	型号#SL-10
EMBLA放大器	EMBLA	A10放大器
精细剪刀	FST	14108-09
平头镀金钢螺丝	J.I. Morris	FF00CE125	https://jimorrisco.com/
金丝	CMSA	T.69 5gr	http://www.cmsa.ch/en/
止血海绵	Pfizer	Gelfoam
碘类消毒剂（Betadine）	Mundipharma	标准溶液 60mL
Komet钻头 1/005PM104	UNOR AG	22310
Matlab分析软件	MathWorks	R2016b	https://ch.mathworks.com/products/matlab.html
微型钻头	Fine Science Tools	96758
小动物气体麻醉头固定装置	Kopf Instruments	型号923-B	http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/
眼用软膏	Pharmamedica	VITA-POS
Paladur（液体）	UNOR AG	2260215	用于牙科水泥
Palavit（粉末）	UNOR AG	5410929	用于牙科水泥
小动物立体定位仪	Kopf Instruments	型号930	http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/
焊锡丝	Stannol	593072
温度控制器 - 微型直肠探头	Phymep	4090502	http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
温度控制器 - 加热垫	Phymep	4090205	http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/