一种用于评估可卡因使用障碍大鼠模型中线索反应性的实验方案

摘要

线索反应性被定义为对与吸毒经历相关的线索的敏感性，这种敏感性会导致戒断个体产生渴求和复吸。在大鼠模型中，通过测量其在自给药和强制戒断后的线索反应性测试中对药物相关线索的注意偏向所引发的趋近性摄食行为，来模拟线索反应性。

摘要

可卡因使用障碍（CUD）表现为反复自我给药的过程，在此过程中，原本中性的刺激逐渐获得激励价值。线索反应性（cue reactivity）指个体对既往与用药体验相关联的线索所表现出的敏感性，在戒断期间的人类渴求中起重要作用。线索反应性可表现为对与药物相关线索的注意偏向，在临床前研究和人类研究中均可通过食欲性趋近行为进行测量。本文描述了一种用于评估经训练后自我给药可卡因的大鼠线索反应性的方法。可卡因自我给药过程伴随特定线索的呈现，这些线索作为条件性强化物（即，环境灯、刺激灯、输注泵声音）。在经历一段戒断期后，测量大鼠在曾与可卡因输注配对的特定线索存在下，于可卡因自我给药环境中按压杠杆的行为，以此评估其线索反应性。该模型可用于探究线索反应性背后的神经生物学机制，也可用于评估旨在抑制线索反应性从而降低复吸易感性的药物治疗策略。该模型的优势在于其具有良好的转化相关性，以及表面效度和预测效度。 该模型的主要局限性在于，线索反应性任务只能偶尔进行，且持续时间必须较短（例如，1小时），否则大鼠将开始消退特定线索与可卡因刺激之间的关联。该模型可推广至任何与特定线索配对的正性强化刺激；尽管其特别适用于滥用药物研究，但该模型未来也可能应用于肥胖等领域，其中可口食物奖励可作为正性强化刺激。

引言

可卡因使用障碍（CUD）的发展过程表现为反复自我给药，期间原本中性的刺激逐渐获得奖赏性动机价值¹。线索反应性是指个体对既往与用药体验相关联的线索所表现出的敏感性，其在人类对药物的渴求中起重要作用^2,3,4,5。对于那些对药物相关线索表现出高度敏感性的个体，其发展为CUD以及在戒断期间复吸的风险被认为更高^6,7。环境背景（e.g.，人物、建筑、音乐类型）和离散的药物相关刺激（e.g.，吸毒用具）均可与可卡因的奖赏效应形成关联；接触这些线索可引发外周生理变化（e.g.，心率、皮肤温度和皮肤电阻）、脑可塑性以及脑功能连接的改变^2,8,9,10。换句话说，重新暴露于可卡因相关线索会激活边缘-皮质-纹状体环路，诱发条件化的生理和主观反应，从而驱动趋近性行为（即觅药行为）^{11,12,13,14,15}。

使用功能性脑成像分析测量的线索反应性可预测伴有CUD的个体的复吸易感性¹⁶。在啮齿类动物模型中，线索反应性的测量可作为复吸风险的替代指标，并可用于转化研究。因此，在啮齿类动物中能够降低线索反应性的药物疗法可进一步用于人类临床试验中作为预防复吸的治疗手段。由于目前尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于CUD的药物疗法¹⁷，因此具有必要转化价值和预测效度的临床前模型显得尤为重要。

啮齿类动物自我给药实验程序是具有预测效度的人类药物滥用研究的金标准转化模型¹⁸ 并对于理解物质使用障碍的分子和生理过程至关重要。反应-独立的 可卡因给药相对于反应结果会产生不同的行为、分子和神经化学效应依赖的 可卡因暴露； 例如，反应-独立的 可卡因给药引发显著更高的死亡率¹⁹此外，戒断反应行为后的神经化学后果依赖的 可卡因自我给药所引发的反应与因应答戒断所触发的反应是不同的独立的 可卡因递送^20,21因此，基于反应的CUD模型依赖的 在评估线索反应性及相关作用机制时，可卡因给药模型是更优的转化研究模型。

在下述实验方案中，可卡因通过留置的颈静脉导管进行静脉注射。然而，已有通过口服和吸入途径进行药物自我给药的替代方法被开发出来。重要的是，啮齿类动物通过操作性反应来控制药物的给予，这与人类类似。因此，啮齿类动物与人类自我给予的药物之间具有高度一致性²²。以下临床前药物自我给药实验采用按压杠杆的行为，由药物给予作为强化刺激，以促使动物的反应率高于对照载体组。通过将原本"中性"的线索（例如，刺激灯光或声音，以及可卡因自我给药发生的环境背景）与可卡因输注配对，从而训练出药物寻求行为；这些线索随后成为条件性强化物（综述见： Cunningham & Anastasio, 2014²³）。之后再次暴露于与可卡因相关的线索，会触发啮齿类动物的药物寻求行为（即，试图通过按压先前有效的杠杆来获得可卡因），并在可卡因使用障碍（CUD）个体中引发渴求和复吸^24,25,26,27。

通常，可卡因自我给药后对药物寻求行为的临床前啮齿类动物研究，会利用在药物相关环境中进行的消退训练和/或药物复吸实验^{28,29,30,31,32}。在无药物和/或无线索呈现的情况下，对先前有效杠杆的按压次数通常作为消退后复吸程度的衡量指标^33,34,35。相反，线索反应性药物寻求行为则在强制戒断后进行评估，且不进行前期的消退训练^{28,36,37,38,39}。

结局指标和实验变量经过精心选择和验证，以解析药物寻求行为和类似复吸行为的神经生物学不同方面。已有充分证据表明，在有或无消退训练的模型之间，神经适应存在差异^40,41,42,43。此外，从转化医学的角度来看，啮齿类动物的消退训练在临床可卡因使用障碍（CUD）治疗中并无对应实践，因为与药物相关的线索包括情绪状态、地点和人物⁴⁴；这些线索的独特组合在临床环境中很可能无法重现^45,46,47。因此，本文所述的啮齿类动物模型相较于目前许多可用模型，更能准确模拟人类的实际情况。

以下介绍一种经过验证的大鼠可卡因自我给药训练、强制戒断及线索反应性测试方案。简言之，大鼠植入颈静脉导管后，通过按压“主动”杠杆来自我给予可卡因或生理盐水，每次给予可卡因或生理盐水刺激时均伴随特定的灯光和声音线索，这些线索作为条件性强化因子。在持续14天的可卡因自我给药训练后，大鼠经历30天的强制戒断期，随后进行为期60分钟的线索反应性测试，记录其杠杆按压行为。该线索反应性测试可作为评估人类可卡因复吸易感性的替代指标。

方案

所有动物操作均按照 实验动物护理和使用指南 （2011）并经机构动物护理和使用委员会批准。

1. 动物

1. 将约8-9周龄（250-260 g）的雄性Sprague Dawley大鼠置于温度为21-23 °C、相对湿度为45-50%的动物房中，按照12 h光照-黑暗循环（光照时间：6:00-18:00）适应环境至少7天。
2. 每笼饲养两只大鼠，研究期间每天进行日常处理。提供食物和水 随意摄取 在整个研究的各个阶段，均在动物的居住笼内进行。
   注意：食物限制会增强可卡因奖赏的显著性⁴⁸，增强可卡因诱导的运动活动⁴⁹，并作为复吸的应激因素⁵⁰ 因此也可能影响线索反应性。
3. 将大鼠随机分配至生理盐水或可卡因处理组。

2. 手术

1. 使用含有8.6 mg/kg的赛拉嗪、1.5 mg/kg的乙酰丙嗪和43 mg/kg的氯胺酮溶于抑菌生理盐水中的混合物对大鼠进行麻醉。通过夹捏其脚趾并监测运动反射和呼吸来确认大鼠是否已充分麻醉。将眼用软膏直接涂抹于眼睛表面，以防止角膜干燥。
   注意：如果大鼠未充分麻醉，则会对脚趾夹捏产生运动反应，且呼吸频率可能迅速增加。
   1. 在大鼠麻醉状态下采用无菌技术，将连接至背部固定装置并带有导管的静脉导管植入颈静脉。手术植入后，让大鼠恢复5–7天^28,36,37,51。
      注意：在人类中，通过静脉途径自我使用可卡因会导致脑内可卡因浓度迅速升高^52,53。因此，在一种最常见的临床前模型中，大鼠被训练通过颈静脉导管自我给予可卡因。
2. 每天使用含有肝素钠（10 U/mL）、链激酶（0.67 mg/mL）和替卡西林二钠（66.67 mg/mL）的抑菌生理盐水溶液0.1 mL冲洗导管，以维持导管通畅。从术后第二天开始导管冲洗，并在每次自我给药实验结束后持续每日冲洗。
   1. 用上述溶液填充注射器，并通过聚乙烯管将背部固定装置与注射器连接，进行冲洗。
   2. 在整个实验过程中定期通过静脉注射10 mg/kg的甲己烯巴比妥钠来验证导管功能是否正常。
      注意：该剂量仅在静脉注射时足以使动物短暂麻醉。

3. 自我给药

1. 使用软件编程生成以下所述的4个独立程序。
   1. 编写两个在固定比率（FR）1程序下进行自我给药的程序，即，一次有效杠杆按压导致一次输注。对于程序#1，将左侧杠杆设为有效杠杆；对于程序#2，将右侧杠杆设为有效杠杆。将两个程序均设置为180分钟长，并按以下方式递送可卡因刺激和离散线索复合物：
      1. 一次有效杠杆按压同时触发笼灯和有效杠杆上方刺激灯的点亮。
      2. 延迟1秒后，输注泵在6秒内递送0.1 mL溶液。
      3. 刺激灯在7秒后关闭（与输注泵同时失活）。
      4. 笼灯在27秒后关闭，最后20秒表示为“超时”期，在此期间有效杠杆按压无预定后果，但仍会被记录。
      5. 数据输出包括：输注次数、有效杠杆按压次数、无效杠杆按压次数以及首次有效杠杆按压的潜伏期。
   2. 再编写两个在FR5程序下进行自我给药的程序，即，五次杠杆按压导致一次输注。同样，一个程序将有效杠杆设为左侧，另一个程序将有效杠杆设为右侧。两个程序均设置为180分钟长，并按以下方式递送强化物和离散线索复合物：
      1. 五次有效杠杆按压同时触发笼灯和有效杠杆上方刺激灯的点亮。
      2. 重复步骤 3.1.1.2 至 3.1.1.5。
2. 自我给药训练
   1. 每日使用无菌0.9% NaCl配制可卡因溶液，剂量为0.75 mg/kg/0.1 mL。
      注：在每次180分钟的自我给药过程中，大鼠大约会自我给予4–5 mL可卡因溶液，因此为避免不足，建议每日按每只大鼠约8 mL的量进行配制。
   2. 将导管注射器（10 mL）装入至少8 mL的可卡因或生理盐水溶液。确认可卡因/生理盐水溶液流通后，在每次自我给药开始前，将注射器插入输注泵，并连接至金属弹簧套管保护的聚乙烯导管。在将注射器连接至各导管前，仔细调整输注泵中的注射器，确保溶液在聚乙烯导管中均匀且完全分布。
   3. 将大鼠放入位于通风、隔音箱内的标准操作条件箱中，箱内配有风扇。每次均将同一只大鼠放入相同的操作箱中，并在整个实验过程中保持有效杠杆位于同一侧。在左侧和右侧有效杠杆之间平衡分配大鼠。
      注：每个箱体均配备一个位于两个可伸缩反应杠杆之间的食丸接收口，每个反应杠杆上方设有刺激灯，与杠杆相对的一侧设有笼灯。可卡因/生理盐水注射器通过23号针头（已打磨以避免刺破导管）连接至金属弹簧套管内的聚乙烯导管，该导管通过液体旋转接头连接至每只大鼠的导管。注射器置于隔音箱旁的输注泵中。
   4. 采用已建立的方法^28,36,37,51，在每日180分钟的训练中训练大鼠通过按压杠杆获得可卡因输注（0.75 mg/kg/0.1 mL）或生理盐水输注（0.1 mL）。
      注：该训练仅需将大鼠放入操作箱中并允许其按压杠杆；按压有效杠杆将获得离散线索复合物和可卡因输注，而按压无效杠杆则无预定后果。
      1. 有效杠杆完成程序后，将在6秒内递送一次可卡因或生理盐水输注，同时点亮笼灯和有效杠杆上方的刺激灯，并启动输注泵（此即与可卡因递送配对的离散线索复合物）；无效杠杆按压不产生预定后果。在强化物（可卡因）递送后，刺激灯和输注泵均失活；笼灯继续亮起20秒，表示“超时”期，在此期间杠杆按压无预定后果。
         注：如何设置此程序的说明见步骤 3.1.1.1–3.1.1.4
   5. 180分钟训练结束后，将每只大鼠从操作条件箱中取出，并冲洗其导管（步骤2.2）。每次训练之间仔细清洁箱体，用70%乙醇溶液擦拭所有表面。
      注：在自我给药过程中接受可卡因的大鼠可能难以从箱中取出，且更易表现出攻击性。应缓慢、小心地 移动，将每只大鼠与其束缚装置断开。
   6. 首先在FR1强化程序下训练大鼠，当连续三天内每小时输注次数达到七次，且每次训练总输注次数的变异率低于10%时，转为FR5程序。持续进行自我给药训练，直至大鼠完成总共14天的自我给药训练。
      注：这是操作性学习的一种变体；某些实验方案倾向于让大鼠在整个实验过程中始终处于FR1程序。从FR1转为FR5的固定比率程序变化不会影响动物自我给予的输注次数^54,55。然而，增加固定比率的大小有助于确保大鼠反应的稳定性，并可能增强奖励的显著性⁵⁶。此外，若需在强制戒断期间进行干预处理，应在大鼠达到FR5程序下的稳定状态（连续至少三天每次训练总输注次数变异率低于10%）时，将其伪随机分配至各处理组。此外，生理盐水组大鼠不应从FR1转为FR5，因为生理盐水的显著性不足以达到从FR1过渡到FR5所需的稳定性。

4. 强制戒断

1. 将大鼠置于强制戒断状态30天；即在30天内不给予大鼠自我给药可卡因或生理盐水的机会。重要的是，在此期间不要将大鼠放回操作箱（先前自我给药的环境）。但是，为评估其总体健康状况，需每天将大鼠从饲养笼中取出进行常规抓取和称重。
   注意：强制戒断的持续时间可以调整，但应选择足够长的时间以避免出现天花板效应和地板效应。在确定强制戒断期持续时间时，应注意以下因素：啮齿类动物品系、年龄、自我给药训练会话的长度与总时长、药物种类、药物剂量与输注时间，以及动物的性别。

5. 可卡因线索反应性

1. 为固定比率1（FR1）程序的线索反应任务编写两个软件程序；一个程序将左侧杠杆设为有效杠杆，另一个程序将右侧杠杆设为有效杠杆。每个程序均应设计为采集60分钟内的压杆数据，并按以下说明递送离散线索复合刺激。
   1. 重复步骤 3.1.1.1-3.1.1.4
   2. 数据输出时，采集线索呈现次数（先前称为输注次数）、先前有效杠杆按压次数、无效杠杆按压次数，以及首次 压杆的潜伏期。
2. 可卡因线索反应性测试阶段
   1. 在强制戒断第30天进行一次持续60分钟的操作式条件反射测试，以评估线索反应性。错开大鼠的测试开始时间，以便快速实施断头术并采集脑组织。重要的是，在进行线索反应性测试时，不要将注射器插入输注泵中，从而使输注泵的声音可作为听觉线索，但不给予可卡因强化。
      注意：线索反应性也可在强制戒断第30天以外的时间点进行评估，但在选择测试日期时应牢记，对与可卡因相关线索的反应性会随时间而变化³⁴。
   2. 将每只大鼠放入其先前接受训练的自我给药实验箱中，并像日常自我给药阶段一样连接至其套管。此时，对先前可获得可卡因或生理盐水的杠杆的按压行为，仅通过递送离散线索复合刺激（i.e.，刺激灯和箱内环境灯亮起，同时激活输注泵）进行强化，强化程序为FR1（i.e.，每次有效杠杆按压呈现一次离散线索复合刺激）；在一次60分钟的测试中，记录线索呈现次数和先前有效杠杆按压次数，同时记录无效杠杆按压次数。然而，与自我给药阶段相同，无效杠杆的按压不会引发任何程序设定的结果。
      注意：另一种对照方案是，在无程序设定结果的情况下（i.e.，不提供离散线索复合刺激强化物），记录先前有效杠杆和无效杠杆的按压次数。
   3. 完成线索反应性测试后，立即处死大鼠，以捕捉其在重新暴露于操作式条件反射箱及离散线索复合刺激后所产生的生化效应。

6. 数据收集、整理与分析

1. 将数据分为三个常规类别：一般健康状况、自我给药和线索反应性。
   1. 在整个实验过程中监测一般健康状况（例如，动物体重、毛发状况），必要时提供兽医护理；如果压杆行为受到健康状况影响，则将动物从研究中剔除。
   2. 在14天的自我给药期间收集自我给药数据。使用非配对双尾t检验，分析可卡因组与生理盐水组在总输注次数、主动压杆次数、非主动压杆次数以及首次主动压杆潜伏期上的统计学差异。
      注意：如果希望研究 在强制戒断期间某种处理对线索反应性的影响，则需要在强制戒断前分析自我给药数据（以确保各组的平均输注次数以及主动和非主动压杆次数相等）。如果采用2×2实验设计（可卡因±处理、生理盐水±处理），应使用双因素方差分析（ANOVA）并结合适当的事后检验来分析该数据。
   3. 对于线索反应性数据，需收集并分析线索呈现总次数、先前主动压杆次数、非主动压杆次数以及首次 压杆的潜伏期。同样使用非配对双尾t检验，分析自我给予可卡因的动物与自我给予生理盐水的动物之间的差异。
      注意：同样地，如果采用2×2实验设计（可卡因±处理、生理盐水±处理），应使用双因素方差分析（ANOVA）并结合适当的事后检验来分析该数据。

结果

一项先前发表的研究⁵⁷中可卡因自我给药与戒断实验后进行线索反应性测试的结果如图1所示。研究时间线如图1A所示。

大鼠在达到标准后，会从FR1逐步过渡到FR5。随着操作性条件反射的进行，接受可卡因给药组的大鼠逐渐增加输注次数，直至达到稳定水平（图1B）。在可卡因给药组和生理盐水给药组中，非活动杠杆按压次数均始终保持在较低水平；非活动杠杆按压次数的差异可能提示动机或健康状况的变化。生理盐水自我给药作为对照，因为生理盐水不具备强化效应，因此从第1天到第14天，杠杆按压次数和输注次数不会上升（未展示图示）。如果可卡因给药组大鼠在第1天至第14天之间的活动杠杆按压次数下降，则提示导管可能已失去通畅性（也可通过2.2.2步骤中描述的方法加以...

讨论

接触与药物配对的线索以及对这些线索产生的生理变化¹⁶与复吸相关^11,16，上述所采用的可卡因线索反应性测试在无药物存在的情况下条件性地呈现与可卡因配对的线索；因此，以先前活跃的杠杆按压形式表现的觅药行为 可作为复吸易感性的一种衡量指标。本文所述的线索反应性方案是一种临床前方法，可用于测试能够调节复吸的药物治疗手段，并可用于研究影响复吸风险的遗传和环境因素。这是一种用于评估觅药行为的操作性任务，其具有许多与人类吸毒及复吸行为相似的特征，已有大量文献对关键的药物剂量和给药参数进行了优化，并采用了适当的对照措施，以确立其表面效度和转化预测能力^28,36,37,39,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
导管管路：0.50 mm 内径 × 0.94 mm 外径 × 0.2 mm 宽度	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	11-189-15A	1/次实验
提示灯	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	ENV-229M	2/操作箱
引导套管（22 号，基座尺寸 8 mm，切割长度 11 mm，基座上方 5 mm）	Plastics One, Roanoke, VA, USA	8IC313G5UPXC	1/只大鼠
箱内照明灯	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	ENV-227M	1/操作箱
输注泵	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	PHM-100	1/操作箱
杠杆	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	ENV-110M	2/操作箱
液体旋转接头	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA	375/22	1/操作箱
MED-PC 软件包（含输注泵软件）	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	SOF-735（输注软件 SOF-700RA-10 版本 1.04）	1
金属弹簧连接管	Plastics One, Roanoke, VA, USA	C313CS/SPC	1/操作箱
针头（23 号，1 英寸）	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA	305193	1/操作箱
Nitex 网格（6/6 编织网片，12"×12"，厚度 500 微米，开孔面积 38%）	Amazon, Seattle, WA, USA	CMN-0500-C, B000FMUNE6	约 1 张/100 只大鼠
PCI 接口模块包	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	DIG-700P2-R2, MED-SYST-16	1/16 个操作箱
接口模块电源	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	SG-6510D	1/16 个操作箱
隔音箱	Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA	ENV-018V	1/操作箱
注射器，10 mL，鲁尔锁™ 接头	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	14-827-52	1 盒/次实验（1/操作箱）
冲洗用 Tygon 管路：0.51 mm 内径 × 1.52 mm 外径，0.51 mm 宽度 × 152.4 m 长度	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	14-170-15B	1/次实验
化学试剂
乙酰丙嗪（10 mg/mL）	Henry Schein（动物健康），Melville, NY, USA	003845	约 0.5 mg/只大鼠*
Acraweld 修复树脂	Henry Schein（牙科），Melville, NY, USA	1013959	1/次实验
Altalube（眼科软膏）	Henry Schein（牙科），Melville, NY, USA	6050059	1/次实验
可卡因	NIDA, North Bethesda, MD, USA	N/A	整个实验约 350 mg/只大鼠*；需持有 DEA 许可证
肝素（10,000 USP 单位/10 mL）	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10	1/次实验（约 21 单位/只大鼠*）
Jet 液体	Henry Schein（牙科），Melville, NY, USA	1256401	1/次实验
氯胺酮（100 mg/mL，10 mL）	Henry Schein（牙科），Melville, NY, USA	1049007	约 15 mg/只大鼠*；需持有 DEA 许可证
甲氧比妥钠（Brevital®，500 mg/50 mL）	Patterson Dental, Saint Paul, MN, USA	043-5461	1/次实验；需持有 DEA 许可证
生理盐水（0.9%，USP）	Baxter, Deerfield, IL, USA	2B1307	1 盒/次实验
链激酶（来源于 β-溶血性链球菌（Lancefield C 组），≥3,000 单位/mg）	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	S3134-250KU	1 瓶/次实验（约 1.5 mg/只大鼠/次实验*）
替卡西林二钠盐	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	50-213-695	约 4 瓶/次实验，或购买 25 g 瓶装（货号 50-489-093）（约 150 mg/只大鼠/次实验*）
赛拉嗪（100 mg/mL）	Henry Schein（动物健康），Melville, NY, USA	033198	约 3 mg/只大鼠*
*假设大鼠年龄符合方案描述，大鼠自给药持续 14 天，冲洗持续 21 天。