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研究味觉编码的新方法

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DOI：

10.3791/55868

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2017年6月29日

 ,  ,  , 
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出三种研究味觉编码的新方法. 使用一种简单的动物——蛾 烟草天蛾（Manduca sexta）曼杜卡)我们描述了一种解剖方案、使用细胞外四极电极记录多个味觉感受神经元活动的方法，以及一个用于递送和监测精确时序味觉刺激脉冲的系统。

摘要

味觉使动物能够检测环境中的化学物质，从而产生对生存至关重要的行为反应。当味觉感受神经元（GRN）检测到呈味分子时，会将呈味物质的种类和浓度信息编码为电活动模式，并传递至脑内的下游神经元。这些电活动模式构成了呈味物质的内部表征，使动物能够选择相应的行为并形成记忆。利用相对简单的动物模型已成为研究感觉编码基本原理的有力工具。本文中，我们提出三种利用烟草天蛾Manduca sexta研究味觉编码的新方法。首先，我们介绍一种解剖方法，用于暴露上颌神经和食道下区（SEZ），从而能够从GRN的轴突记录其电活动。其次，我们描述如何使用细胞外电极，通过将四极导线直接插入上颌神经，同步记录多个GRN的电活动。第三，我们介绍一种新型系统，可高时间精度地递送并监测不同呈味物质的脉冲刺激。这些方法可在呈味物质递送前、递送期间和递送后，直接在活体（in vivo）条件下对GRN的神经元反应进行表征。我们提供了从多个GRN记录到的电压轨迹示例，并展示了如何对数据应用峰电位分类技术以识别单个神经元的反应。最后，为验证我们的记录方法，我们将使用四极电极获得的GRN细胞外记录结果与使用锐性玻璃微电极获得的细胞内记录结果进行了比较。

引言

味觉和嗅觉系统能够产生对环境中化学物质的内部表征，分别形成对味道和气味的感知。这些化学感觉对于引发生物体生存所必需的多种行为至关重要，从寻找配偶和食物到躲避捕食者和毒素均依赖于此。该过程始于环境中的化学物质与感觉受体细胞质膜上受体的相互作用；这些细胞直接或通过与神经元的相互作用，将化学物质的种类和浓度信息转化为电信号。这些信号随后被传递至高级神经元及其他脑部结构。随着这些步骤的推进，原始信号始终经历一系列变化，以增强生物体对感觉信息的检测、辨别、分类、比较和存储能力，并有助于选择适当的行为反应。理解大脑如何转化有关环境化学物质的信息以最优地执行各种任务，是神经科学中的一个基本问题。

味觉编码曾被认为相对简单：一种普遍观点认为，每种引发味觉的化学分子（即“"呈味物"）天然地归属于大约五种基本味觉品质之一（即甜、苦、酸、咸和鲜）1。在这种“"基本味觉"”观点中，味觉系统的任务是确定这些基本味觉中哪一种存在。此外，神经系统中基本味觉表征所依赖的神经机制尚不明确，目前认为可能由“"标记线"”2,3,4,5,6或“"跨纤维模式"”7,8编码机制所支配。在标记线编码中，每个感觉细胞及其下游神经元仅对单一味觉品质产生响应，共同形成一条直接且独立的通路，将信息传递至中枢神经系统中的高级处理中枢，专用于该种味觉。相比之下，在跨纤维模式编码中，每个感觉细胞可对多种味觉品质产生响应，因此关于呈味物的信息由感觉神经元群体的整体反应模式来表征。味觉信息是否通过基本味觉、标记线，或通过其他机制进行表征，目前仍不清楚，也是近期研究的关注重点3,8,9,10,11,12。我们近期的研究表明，味觉系统采用一种时空动态的群体编码方式来生成对单个呈味物的表征，而非对基本味觉类别的表征10。

本文提供了三种新工具，以协助味觉编码的研究。首先，我们建议将天蛾 Manduca sexta 作为一种相对简单的模式生物，用于味觉电生理学研究，并描述了一种解剖方法。其次，我们建议使用细胞外"四极电极"来记录单个味觉受体神经元（GRN）的活动。第三，我们提出一种新型装置，可向动物精确输送并监测定时的味觉刺激脉冲。这些工具借鉴了本实验室及其他实验室用于研究嗅觉系统的技术。

如果果蝇等昆虫 黑腹果蝇，蝗虫 Schistocerca americana，以及蛾类 曼杜卡 sexta, 几十年来，为理解神经系统的基本原理（包括感觉编码）提供了强大的研究资源（例如， 嗅觉 13）。在哺乳动物中，味觉受体是通过复杂的第二信使通路与神经元进行通讯的特化细胞。 1,14在昆虫中情况更简单：它们的味觉受体本身就是神经元。此外，哺乳动物外周附近的味觉通路相对复杂，具有多条平行的神经通路，且一些重要组成部分难以触及，因其位于微小的骨性结构内部。 15昆虫的味觉通路似乎更为简单。在昆虫中，味觉感受神经元（GRNs）位于特化的结构——称为感觉器（sensilla）——之中，这些结构分布在触角、口器、翅膀和足部。 16,17GRNs 直接投射到下咽区（SEZ），该结构的功能一直被认为主要与味觉相关。 17，且包含二级味觉神经元 10信息随后传递至身体以引发反射，并传递至大脑高级区域进行整合、储存，最终驱动行为选择。 16.

为了理解味觉信息如何在神经系统中逐级传递和转换，有必要对周围味觉反应进行表征。目前用于直接监测昆虫味觉感受神经元（GRNs）神经活动的最常用方法是顶端记录技术12,18,19,20,21,22,23。该方法是将电极直接放置在感器上，而许多感器相对容易接近。将待测的味觉刺激物置于电极内部，从而可激活感器内的GRN并记录其细胞外神经反应。然而，由于味觉刺激物被限制在电极内，因此无法在施加或移除刺激物之前或之后测量GRN的活动，也无法在不更换电极的情况下更换不同的刺激物20。另一种方法，即"侧壁"记录技术，也曾被用于记录GRN的活动。该方法是将记录电极插入味觉感器的基部24，同时通过另一根玻璃毛细管将味觉刺激物施加到感器的顶端。但上述两种技术均仅能从特定的单一感器中记录GRN的活动。本文中，我们提出一种新方法：在对喙部分别施加一系列味觉刺激物的同时，随机选取来自不同感器的GRN轴突进行记录。轴突记录通过将尖锐的玻璃电极或细胞外电极束（tetrodes）插入传导来自喙部GRN轴突至咽下神经节（SEZ）的神经中来实现10。在Manduca中，这些轴突经由下颚神经传导，该神经已知为纯粹的传入神经，因而可明确无误地记录感觉反应25。这种轴突记录方法可实现对GRN反应在一系列味觉刺激呈现前、期间及之后持续两小时以上的稳定测量。

本文介绍了一种解剖方法，用于暴露上颌神经以及舌咽感觉区（SEZ），从而能够同时记录多个味觉受体神经元（GRN）和SEZ内神经元的反应10。我们还描述了使用自制的四通道绞合丝状四极电极进行细胞外记录GRN的方法，结合峰电位分类技术，可实现对多个GRN（在我们的实验中最多达六个）的同步分析。我们进一步比较了使用四极电极与尖锐的细胞内电极所获得的记录结果。最后，我们介绍了一种新型的呈味刺激递送装置。该装置借鉴了长期以来用于嗅觉研究中递送气味分子的设备，并针对味觉研究进行了优化：相较于Stürckow及其同事开发的早期多通道递送系统（参见参考文献26,27），本装置能够精确控制呈味物递送的时间，并提供该时间的电压输出信号；同时支持多种呈味刺激的快速、顺序递送10。该装置使喙持续处于清洁水的恒定流动中，可控的呈味脉冲可被注入此水流。每个呈味脉冲流经喙表面后即被冲洗干净。呈味液中添加了少量无味食用色素，以便通过颜色传感器以精确的时间分辨率监测呈味物在喙表面的通过情况。

方案

注意：烟草天蛾（Manduca）释放的细小粉状鳞片可能具有致敏性，因此建议佩戴实验室安全手套和口罩。

1. 解剖烟草天蛾（Manduca sexta）以暴露上颌神经和咽下神经节

  1. 根据以下特征选择合适性别、羽化后三天且整体健康状况良好的蛾：翅膀应完全展开，喙和触角应完整。
    1. 将蛾单独放入塑料杯中以便运输。
  2. 将蛾插入聚丙烯管中。
    注意：建议在通风橱中进行此步骤，以防止蛾体上的粉状鳞片扩散。
    1. 管子应略长于蛾的身体（图1A）。可通过截取15 mL聚丙烯管制作。
    2. 推动蛾体直至头部露出，并将揉成团的纸巾塞入管子另一端，以帮助固定蛾体使其保持不动（图1A）。
  3. 通过向暴露的蛾头（腹面和背面）吹入加压空气，去除其表面的毛。
    1. 可通过将注射器（1 mL，带针头，内径约1.4 mm，尖端已去除）连接至加压气源来制作气流装置。
      注意：去除毛后，后续所有步骤可在通风橱外进行。
  4. 当大部分毛已被去除后，将管子放入固定装置中，使头部背面向上，如图1B所示。
    1. 在培养皿上，使用模型黏土制作一个长约7 cm、高约2.5 cm的三角形底座（图1B）。

昆虫解剖图，标签：身体、头部、触角、喙；固定在油泥上，培养皿中。
图 1：Manduca 解剖室的制备。（A）一只蛾子被固定在管中，头部从一端露出，另一端用纸巾塞住。（B）显示由培养皿和油泥制成的解剖室，头部背侧朝上。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 保护触角和喙
    1. 用移液器吸头（黄色吸头，1-200 µL用剃刀将材料切成约0.5 cm长的三段。内径应足够大，以确保触角和喙能够紧密贴合。
    2. 用一根长约7厘米的22号导线弯成钩状。将蛾的喙伸出，然后用金属钩牵引，将其插入小管中，直至小管到达喙的近端部分。
    3. 用坚固的蜡笔蜡（例如，使用牙科电热蜡笔加热并引导蜡液）将小管固定在蛾头部背侧的头壳上图2A 左侧。
    4. 将每根天线放入试管中，并用蜡封蜡固定试管，如图所示 图 2A （左侧）。注意避免热蜡损伤触角。
  2. 通过切断覆盖脑前表面的肌肉，防止脑组织移动即 颊部压缩肌
    1. 在解剖显微镜下，使用显微解剖剪或用粘附在牙签上的刀片碎片制成的微型斧头，在喙下方稍作小切口以打开头壳图2A，左上角插图）。
    2. 使用显微解剖剪剪断颊部压缩肌（示意图参见参考文献） 25）。由于该肌肉不易直接观察，建议采用以下行为学测试以确认其已被切断。
    3. 将蔗糖溶于蒸馏水中，配制成1 M的溶液。
    4. 使用移液器转移约 200 µL 将蔗糖溶液施加到喙的远端2/3处，观察喙5分钟。如果肌肉被正确切断，昆虫应无法伸展或移动其喙。
    5. 在头 capsule 的开口处涂抹一层熔化的蜡封剂以密封。
  3. 将昆虫翻转，使其头壳的腹面朝上。
  4. 在解剖过程中及解剖后灌注生理盐水时，使用电热蜡笔在头部腹侧周围构建一个蜡杯：在解剖显微镜下，从头部前方开始沿前缘施加第一排蜡，逐渐向后移动。确保吻部和触角管位于蜡杯内部（图 2A 右侧
    1. 继续向外和向上编织杯状结构，直至达到眼睛的水平位置。
  5. 用镊子取下两个唇须中的一个，然后将其放置于一侧，并通过添加更多熔化的石蜡固定在蜡杯中。对另一个上颚须进行相同操作。图2A 右侧
  6. 密封石蜡杯和管子的所有开口。
    注意：此步骤使用环氧树脂，因为它可轻松密封石蜡和管子中的缝隙，且能避免触角和喙器受到任何与热量相关的损伤。
    1. 使用牙签在塑料混合皿中混合双组分环氧树脂。保留该混合皿。
    2. 使用牙签将一层薄薄的环氧树脂涂在杯子的外侧和内侧图2B).
    3. 用环氧树脂填充装有喙和触角的管中空余部分，并在聚丙烯管颈部周围填充足量的环氧树脂，以确保其牢固固定图2B).
    4. 让环氧树脂干燥约20分钟。检查时，可测试塑料混合皿中残留的环氧树脂，确保其已固化且不再发黏。
    5. 将石蜡杯填满 曼杜卡 生理盐水 28 等待几分钟，确保无泄漏。若发现泄漏，可尝试用更多热蜡和/或环氧树脂进行密封。

昆虫解剖实验；背侧和腹侧视图中的石蜡和环氧树脂；肌肉鉴定。
图 2：准备 Manduca 以进行解剖。（A）触角和喙被保护在由移液器吸头切成约 0.5 cm 长的三段小管中。（左侧面板，大图）用熔化的蜡在头部背侧周围固定这些小管。（左侧面板，插图）为去除口部压缩肌，需在头壳背侧做一小切口，如大图中虚线所示。（右侧面板）在头部腹侧周围构建一个石蜡杯，作为解剖过程和记录实验期间灌流生理盐水的储液池。（B）使用环氧树脂密封石蜡杯底部与头部背侧之间的缝隙（左侧面板），以及石蜡与容纳触角和喙的小管之间的缝隙，包括小管的开口处（右侧面板）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在解剖显微镜下，使用显微解剖剪剪除唇须。
  2. 使用显微解剖剪或微型斧刀，通过四次切割打开头壳的腹侧：沿每个复眼周围自后向前的几丁质外骨骼各切一次，在头后部的几丁质外骨骼上切一次，以及在靠近喙的头部前部几丁质外骨骼上切一次（图3A）。
  3. 使用显微解剖镊轻轻剥离几丁质外骨骼，以暴露脑组织。
  4. 使用两把锋利的显微解剖镊缓慢而小心地去除覆盖在咽下神经节（SEZ）上的脂肪组织和气管。避免对脑组织或神经（如上颌神经、视神经、颈连接）造成任何损伤。通过频繁更换生理盐水冲洗脑组织，并经常调节光照以提高视野清晰度。注意：此步骤可能是解剖过程中最关键的环节；容易因牵拉或压碎而意外损伤上颌神经。
    注意：此时咽下神经节（SEZ）和上颌神经应已清晰可见（图3B-3C）。然而，脑组织和上颌神经仍被一层薄的鞘膜覆盖。
  5. 为去除鞘膜，将蜡盘中的生理盐水替换为含10% (w/v) 胶原酶/分散酶的生理盐水溶液，静置5分钟。随后，用生理盐水多次冲洗脑组织，再用超细显微解剖镊从咽下神经节（SEZ）处沿上颌神经方向轻轻向上牵拉，以去除鞘膜。
  6. 开始用新鲜生理盐水持续灌流蜡盘。将生理盐水输液管的导管插入蜡盘中，并用熔化的石蜡固定。

昆虫喙器解剖结构；标注的示意图及显微图像显示上颌神经和食管下区；显微分析。
图3：Manduca 解剖步骤。（A）去除唇须后，沿虚线所示位置做四道切口以打开头壳。（B）打开头壳并去除脂肪组织和气管后的大脑放大图像，可清晰观察到上颌神经（MxNs）和食管下区（SEZ，指食管下方的脑区区域）。上颌神经负责将喙器中味觉感受神经元（GRNs）的轴突传递至食管下区。（C）Manduca 大脑的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 味觉刺激递送系统

  1. 味觉刺激递送系统由四个主要部分组成：水源、味觉刺激多通管、颜色传感器以及容纳喙的区域，所有部分均连接至一根刚性塑料管（图4A-4B）。构建该系统时，请参照图4B所示步骤进行。使用一根长约6 cm的刚性塑料管（内径0.3 cm）。
  2. 使用电烙铁在塑料管上需放置喙的位置打一个小孔（图4A-4B）。
  3. 为确保不同动物的喙始终置于相同位置，将一块塑料筛网材料（网状，孔径约0.1 cm）固定在管内（图4A-4B）。使用剃刀片或旋转工具，在喙孔上方约5 mm处将刚性管切断。将筛网置于两段管之间，并在管外侧涂抹环氧树脂以固定筛网并重新连接两段管。让环氧树脂静置干燥约20分钟。
  4. 味觉刺激递送采用加压灌流系统，根据需要连接多个味觉刺激管，并汇入一个多通管（见下文）。使用电烙铁在筛网上方约1 cm处的刚性管上打一个小孔。将灌流系统的输出管（内径0.86 mm）插入刚性管中，并用环氧树脂固定（图4A-4B）。
  5. 使用蠕动泵输送恒定流速（约40 mL/min）的蒸馏水。通过硅胶管将其连接至刚性塑料管（图4A-4C）。将刚性管的另一端连接至另一根硅胶管，以将流出液导入一个较大的废液容器中（图4A-4C）。
  6. 递送味觉刺激时，向灌流系统的多通管中注入压缩空气。例如，可通过气动泵（10 p.s.i.）实现，该泵由定时电压脉冲控制，将压缩空气注入含有目标味觉刺激的多通管中。1秒的脉冲可推出约0.5 mL的味觉刺激溶液。

3. 味觉刺激物的制备与递送监测

  1. 用蒸馏水将味觉刺激物稀释至所需浓度。注意，味觉刺激物会被流水进一步稀释。我们测得到达喙器的实际浓度为初始浓度的77%（参见参考文献10,29）。
  2. 向每种味觉刺激溶液中添加人工食用染料，以便准确确定刺激物流经喙器的时间点。我们发现，0.05% w/v 浓度的绿色染料（见材料清单）不会激活烟草天蛾（Manduca）的味觉受体神经元（GRNs）。
  3. 使用颜色传感器（见表1）检测味觉刺激溶液中的食用色素。使用电烙铁在灌流系统输出管下方0.5 cm处、紧邻金属网的位置打孔（图4A-4B）。将传感器连接至刚性管，并在其外部用环氧树脂固定。
    1. 将颜色传感器的电压输出作为模拟信号与生理信号一同记录（见第4节）。可通过连接至传感器的直流放大器对颜色传感器的电压信号进行放大（图4A）。
  4. 通过递送味觉刺激物并记录传感器的电压输出，确认颜色传感器正常工作。染料引发的信号应明显高于噪声水平。
    1. 调节恒定的水流速度，使信号波形尽可能接近方形。
      注意：当依次递送多种味觉刺激物时，首次使用新刺激物的试验中，实际递送的溶液会含有新旧刺激物的混合物。因此，我们未分析这些首次试验的数据。

用于味觉研究的蠕动泵示意图，包含16通道灌注系统、颜色传感器和电极装置。
图4：味觉刺激递送系统。（A）用于向动物喙部递送并监测定时味觉刺激脉冲的装置示意图。系统的主要组件以红色数字标示。通过连接至刚性塑料管（1）的蠕动泵，使用硅胶管维持蒸馏水在喙部的持续流动，喙部置于该刚性塑料管的孔洞位置（6）。含有少量无味染料的味觉刺激物通过加压的16通道灌注系统递送。盛有味觉刺激物的储液器连接至一个歧管（2），该歧管连接在刚性管上，位于喙部插入孔（5）的上方。来自气动泵的压缩空气被注入灌注系统，以快速递送味觉刺激物，递送时间由定制软件控制。使用颜色传感器（3）监测味觉刺激物的递送情况。传感器连接在刚性管上，位于喙部旁边且在味觉刺激物出口下方。颜色传感器的电压信号由直流放大器放大。放大器旁边插图中的红色轨迹显示了使用定制数据采集软件记录的颜色信号；信号的快速上升和下降分别反映了味觉刺激物的到达和冲洗过程。蛾类的喙部插入位于颜色传感器正下方的孔洞（5）中。在孔洞上方放置一层网筛（4），以确保不同个体的喙部始终处于相同位置。刚性管的另一端连接另一根硅胶管，将流出液导入废液容器（7）。（B）显示连接至刚性塑料管的味觉刺激递送系统主要部件的图像，各部件以红色数字标示，对应于A图中的编号：水源（6）、味觉刺激物歧管输出管路（2）、颜色传感器（3）、网筛（4）以及喙部插入孔（5），全部连接至一根刚性塑料管（1）。（C）展示将Manduca标本安装至实验装置中的情况。将蛾类喙部远端的2/3部分插入刚性塑料管（1）上的孔洞（5）中。如插图所示，使用牙科蜡和环氧树脂将喙部固定。刚性管的进水口和出水口分别以数字6和7标示，指向废液容器。数字2表示味觉刺激物歧管的输出管路。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 细胞外四极记录法监测味觉刺激物诱导的味觉受体神经元活动

  1. 将蛾类标本置于体视显微镜下的平台上，平台需放置在隔振台上（图4C）。
  2. 将蛾喙的远端三分之二插入味觉刺激递送系统的硬质管中（图2B）。操作时，先将蛾喙伸展，然后借助敷料镊子轻轻将其推入硬质管的孔洞中。使用软质牙科蜡将喙固定密封，再覆盖一层环氧树脂以防止泄漏（图4C，插图）。
  3. 将生理盐水灌注管路连接至头囊，并将灌注流速设定为约0.04 L/h的恒定速率。
  4. 将接地电极（即氯化银丝）浸入生理盐水浴中（图5A）。
  5. 使用按照文献30所述方法自制的绞合丝四极电极（建议使用4根电极丝，以获得良好分离的神经信号单元并适配神经尺寸）。实验前，按照文献30中描述的步骤对电极进行电镀处理。
  6. 使用手动显微操作器将四极电极定位至下颌神经附近，逐步推进电极直至其开始进入神经（图5）。
  7. 电极置入后，至少等待10分钟，使其在神经内稳定后再开始记录。
  8. 将信号放大3000倍，并使用0.3–6 kHz的带通滤波器。使用数据采集软件以40 kHz的采样率获取信号。
  9. 实验结束后，将蛾类标本放入冷冻机中保存。

用于昆虫电生理研究的四极记录装置，包含电极和食管下区（SEZ）示意图。
图 5：来自味觉感受神经元（GRNs）的四极记录。（A，大图）使用显微操作器将绞合金属丝四极电极插入上颌神经（MxN），以记录味觉感受神经元（GRNs）的活动。如图所示，将氯化银接地电极置于生理盐水中。（A，插图）显示脑部结构的放大图像，其中四极电极位于上颌神经内。图中同时标示了食管下区（SEZ）。（B）为按A图方向定位的烟草天蛾（Manduca）脑部示意图。请点击此处查看该图的高清版本。

结果

在呈递味觉刺激物之前、期间和之后，可使用细胞外四极电极记录味觉感受神经元（GRNs）的活动（图6A 和 6C）。图6A（中、下图）显示了位于上颌神经内的四根导线分别记录到的滤波后（300–6,000 Hz）电压轨迹，其中可观察到反映动作电位的不同幅度信号（箭头所示）。在实验开始2秒后，给予1秒的味觉刺激物脉冲（1 M蔗糖）；刺激的起始和终止通过颜色传感器进行监测（图6A，上图）。该味觉刺激物在四个通道中的每一个通道均诱导出可观察到的放电尖峰（图6A，中图）。当神经元对某些味觉刺激物有反应而对其他刺激物无反应时，即可将味觉感受神经元（GRNs）与机械感受器（本图中未显示）区分开来10。

为了从四极记录中识别并分离单个神经元的反应，我们使用基于Pouzat31以及Kleinfeld32,33方法的一组自定义函数进行离线 spike sorting（尖峰分类）（这些方法在以下文献中有详细描述：10,29）。图6B展示了对图6A所示数据进行 spike sorting 的一个示例，其中识别出三个分离良好的神经元单元。

图6C中的点阵图展示了图6B中三个独立神经元单位对六种不同味觉刺激物（1 M 蔗糖、麦芽糖和 NaCl；100 mM 咖啡因以及 10 mM 小檗碱和洛贝林）的响应，这些刺激物按顺序递送（每种刺激物显示4次试验）。如图6C所示，记录到的味觉受体神经元（GRN）具有不同水平的基础活动性，从无活动（GRN 1）到低或中等水平（GRN 2 和 3）不等。在味觉刺激开始后，GRN表现出多样的活动模式，并对不同味觉刺激物表现出不同的选择性。例如，GRN 1 仅对蔗糖产生响应，而 GRN 2 对麦芽糖和 NaCl 表现出爆发性放电，对洛贝林则仅在刺激开始时出现短暂放电。此外，某些响应与刺激的时间精确同步（例如 GRN 1 对蔗糖的响应），而另一些响应则持续超过刺激的持续时间（例如 GRN 3 对小檗碱的响应），或同时包含兴奋性和抑制性成分（例如 图7 中 GRN 2 对 NaCl 和蔗糖的响应）。有关 GRN 多样化的敏感性及活动模式的更多信息，请参见参考文献10。

为了验证使用四极电极和峰电位分类技术记录上颌神经中味觉反应神经元（GRN）的可行性，我们采用传统的尖锐玻璃电极（电阻为80-120 MΩ）在其他动物中对GRN轴突进行了细胞内记录。我们发现，通过细胞内记录获得的活动模式与使用四极电极技术观察到的反应相似（图7）。A图中绿色框内的电压迹线是GRN 1在连续5次蔗糖刺激试验期间通过细胞内记录获得的，相同的反应在B图中以点阵图形式展示。（注意：此类反应模式与四极电极记录结果一致，如图6C所示。）使用尖锐细胞内电极记录的GRN 2则表现出更广泛的反应模式。

神经反应分析示意图；包含微伏测量值和峰电位时间的电生理数据。
图6：上颌神经细胞外四极记录的代表性结果。（A）中间图显示了四根电极丝在上颌神经处记录到的滤波后（300–6,000 Hz）电压轨迹。在中间图中红色阴影所示时间段内施加了持续1秒的味觉刺激物。刺激的起始和终止通过上图中红色电压轨迹所示的颜色传感器进行监测，并在中间图中以红色阴影区域标示。虚线水平线分别表示+50（上）、0（中）和-50（下）µV。底部图显示了对应于垂直虚线框内区域的原始电压轨迹的放大图。箭头指示了峰电位的示例。（B）对A图数据进行峰电位分类分析的示例。在四根细胞外电极丝（1–4）上记录到的波形被归类为三个不同的味觉受体神经元（GRN，单位1–3），它们共同贡献了记录到的信号。对这三个单位分别展示了单个事件（彩色细线）和平均波形（粗黑线）。为可靠地通过峰电位分类方法识别独立神经元单位，需考虑多项统计标准（参见参考文献10,29）。（C）点阵图（Raster plots）表示三个分离单位对六种不同味觉刺激物序列的反应（每种味觉刺激物显示4次试验）。味觉刺激物施加的时间段（1秒）以红色阴影区域标示。味觉刺激物的浓度分别为1 M（蔗糖、麦芽糖、NaCl）、100 mM（咖啡因）和10 mM（小檗碱和lobeline）。请点击此处查看该图的放大版本。

电生理电压-时间图；味觉受体神经元对 H2O、蔗糖、NaCl 的反应；神经元活动分析。
图 7：味觉受体神经元轴突的细胞内记录。（A，绿色方框图）使用尖端玻璃细胞内电极（电阻为 80 - 120 MΩ）插入上颌神经，记录到一个味觉受体神经元（GRN）在连续五次 1 M 蔗糖（Suc）刺激下产生的电压轨迹。（B）两个味觉受体神经元的反应点阵图，包括 A 图中所示的反应（绿色方框图），依次施加两种不同味觉刺激物（100 mM 以灰色字体表示；1 M 以黑色字体表示），记录时使用插入上颌神经的尖端玻璃细胞内电极（每种味觉刺激物显示 7 次试验，水显示 3 次试验）。两个图中红色阴影区域表示味觉刺激物的施加时间。刺激的开始和结束通过颜色传感器监测，如各图底部的红色电压轨迹所示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

此处所述方法允许 在体 来自一种相对简单的动物的记录 Manduca sexta，以表征多个随机选取的味觉受体神经元（GRNs）在长时间（超过2小时）内，在呈味物质递送前、递送中和递送后的活动情况。这些方法还能够以精确的时间控制快速、顺序地递送多种呈味刺激，这一优势有助于研究呈味物质表征背后的神经机制。本方案已被用于研究味觉受体神经元对呈味物质的响应在传递至其突触后靶神经元时如何被转换例如， 通过同时监测与中间神经元单突触连接的GRNs，研究SEZ中的活动 10此外，这些方法可根据实验者的需要进行调整，从而实施复杂的实验范式，以研究味觉编码的基本机制。

在开始研究时，我们有时需要排查的一个技术问题是无法用四极导线检测到上颌神经的放电信号。造成这一问题的可能原因多种多样，因为解剖流程具有挑战性，需要一定的练习才能获得良好的制备样本。首先，在蛾类解剖过程中，上颌神经很容易受损，尤其是在去除包裹神经组织的鞘膜时。其次，如果鞘膜未完全去除，四极导线可能无法接触到神经。在这两种情况下，通常最简便的解决方法是重新制备样本。第三，可能是四极导线本身存在问题。可通过测量导线阻抗来检查，其在1 kHz时应约为270 kΩ。如果阻抗值高于约300 kΩ，应使用金进行电镀以达到理想的阻抗值（参见参考文献30）。第四，可能是某件设备连接错误或工作异常。

另一个可能的问题是记录到了放电信号，但神经元对味觉刺激物似乎无反应。这可能是因为所记录的神经元对所施加的味觉刺激物组合不敏感。此外，需要注意的是，除了味觉受体神经元（GRNs）的轴突外，上颌神经还含有机械感受纤维。因此，有可能记录到的是机械感受神经元的活动，而非味觉受体神经元，或同时记录到两类神经元的活动。然而，味觉刺激递送系统的设计旨在整个实验过程中提供恒定的机械输入，因此由递送过程中的机械成分引起的反应不太可能干扰对味觉刺激本身的反应。对某些味觉刺激物有反应而对其他刺激物无反应，或对不同味觉刺激物产生不同反应模式的神经元，可明确归类为味觉受体神经元（GRNs）。我们建议使用 freshly diluted 味觉刺激物，以避免因化合物降解或溶剂挥发导致的浓度或成分变化。同时建议定期清洁系统，以防止管路污染或堵塞。

另一个可能的技术问题是信噪比较差。该问题通常可通过重新氯化或调整浴槽接地电极的位置来解决。其他解决方案可能包括对设备进行屏蔽，并尽量缩短每个电气连接的长度。

最后，需要注意的是，对使用四极记录获得的数据进行正确分析需要仔细的峰电位分类。我们发现，完全自动化的分类方法通常不够理想。建议在分析四极数据之前，先熟悉峰电位分类的相关文献10,29,31,32,33。

我们的解剖方案存在其他替代方法。本文描述了通过蛾类头部腹侧进行解剖，以暴露下颚神经和食道下神经节（SEZ），但也可通过背侧解剖来获取这些结构。我们发现，由于味觉相关结构位置较深，背侧解剖制备并不适合记录这些味觉结构的电活动；然而，该制备方法的优势在于能够记录更高级的脑区，例如蘑菇体——该区域与多感官整合、联想学习和记忆处理相关34。我们重点介绍了使用四极电极记录下颚神经活动的方法，但如文中所示，传统的细胞内尖电极也可用于此目的。此外，这两种技术可结合使用，以实现对多个脑区的同步记录10。神经科学文献中已有大量实例表明，无脊椎动物模型是揭示感觉信息处理基本原理的有力工具，例如嗅觉编码机制，这些原理在昆虫和脊椎动物中均适用35,36,37,38,39。我们希望本方法能够推动对味觉编码机制的全新基础性认识。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院下属的国立儿童健康与人类发育研究所（NIH-NICHD）内部资助，资助对象为 M.S。我们感谢美国国立卫生研究院下属的国立精神卫生研究所仪器核心设施（NIH-NIMH Instrumentation Core Facility）的 G. Dold 和 T. Talbot 在味觉刺激递送系统设计方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖与样本制备
聚丙烯管，15 mL FalconFisher Scientific14-959-53A
针头，短斜面，19 G × 1 - 1/2"  MONOJET888200144用于吹气以去除蛾体表的毛发。
油性黏土 - Van Aken Plastalina DickBlick33268
培养皿 - 100 × 15 mm VWR International89000-304
移液器吸头（1 - 200 µL）USA Scientific1111-0806
剃须刀片Techni EdgeTE05-071
22 AWG 标准连接导线AlphaWire1551用于将喙插入移液器吸头中。
蜡染蜡Jacquard7946000
电热蜡熔器Almore International66000
体视显微镜LeicaMZ75
Dumont #1 镊子（粗头） World Precision Instruments500335用于去除脂肪组织及非神经组织。
Dumont #5 钛合金镊子（细头） World Precision Instruments14096用于去除脂肪组织及非神经组织。
Dumont #5SF 镊子（超细头）World Precision Instruments500085用于剥离神经组织的鞘膜。
Vannas 剪刀（细头）World Precision Instruments500086用于去除角质层。
胶原酶/分散酶Sigma-Aldrich11097113001
环氧树脂Permatex84101
名称公司目录编号备注
生理盐水灌流系统
带流量调节器的延长管 B Braun Medical Inc.V5200
带Y型注射口的静脉输液管 B Braun Medical Inc.V1402
名称公司目录编号备注
味觉刺激物递送系统
白色半透明尼龙管，外径 1/4"，内径 1/8"Small Parts Inc.B001JJT4SA用于连接系统的四个主要部件的刚性管。
电烙铁Circuit SpecialistsZD200BK
旋转工具 - DremelDremel4200
聚丙烯网，孔径（0.1 × 0.13 cm） Industrial NettingXN5170用于确保不同动物的喙被放置在相同位置。
加压式16通道灌流系统 Bioscience ToolsPS-16H用于递送味觉刺激物。该系统包括夹管阀、管路、歧管、溶液瓶、阀门控制器及连接配件。
聚丙烯管，内径 0.034"，内径 0.050"Becton, Dickinson & Co427421灌流系统的输出管。
气动PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820用于控制灌流系统的输出通道。 
数据采集软件系统，LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ卡National InstrumentsLabVIEW 2011用于控制PicoPump以递送味觉刺激物，并记录颜色传感器的信号。
Compulab 3 Manostat 蠕动泵SigmaP1366用于泵送水。
硅胶管，内径 1/16"，外径 1/8"Cole-ParmerWU-95802-02用于连接水源与蠕动泵管路，以及将泵的出口管连接至递送系统的刚性管。
颜色传感器 - 数字光纤传感器Keyence FS-V31M用于监测味觉刺激物的递送。 
颜色传感器 - 反射式光纤单元KeyenceFU35-FZ用于连接颜色传感器设备。
牙科周边蜡Henry-Schein Dental6652151用于固定喙于刚性管中。
两个 3.7 L 容器用于为系统供水，并收集废水。
亮蓝FCF SigmaF7258
持针钳，25.5 cmWPI500364用于将蛾的喙插入刚性管的喙孔中。
名称公司目录编号备注
电生理设备
直流放大器Brown-Lee440
光源SchottSchott Fostec Light Source DCR 2
手动显微操作器Leicamicromanipulator用于精确地将四极电极插入动物脑内。该操作器需支持在x、y和z轴上的精细与粗调运动。
体视显微镜LeicaMZ75
隔振台（MICRO-g 实验台）TMC63-541
示波器Tektronix TDS2014
16通道前置放大器与放大器16通道MA-800放大器系统 B.E.S 2013
计算机Delloptiplex 780以下为最低推荐配置：内存：3.32 GHz，3GB；处理器：Intel Core 2 Duo；显卡：集成Intel GMA X4500。 
数据采集软件系统，LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ卡National InstrumentsLabVIEW 2011用于控制PicoPump以递送味觉刺激物，并记录颜色传感器和电极的信号。
名称公司目录编号备注
味觉刺激物
KAcSigma-AldrichP5708
LiClSigma-AldrichL9650
NaClSigma-Aldrich73575
蔗糖Sigma-Aldrich84097

参考文献

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