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利用光化学方法在水凝胶上图案化生物活性蛋白质或多肽以用于生物应用

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DOI：

10.3791/55873

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2017年9月15日

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1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

本文内容

摘要

本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.

摘要

许多生物刺激因素均可影响细胞行为和干细胞分化。传统的细胞培养方法主要依赖培养基中的可溶性因子来调控细胞行为。然而，可溶性添加物无法模拟某些常见的细胞信号模式，例如基质结合型生长因子、细胞间信号传递以及空间性的生化信号线索。此外，基质的生物物理特性（如基底刚度）在细胞命运决定中也起着重要作用，而这些特性难以通过常规的细胞培养手段进行有效调控。本方法介绍了一种利用光化学技术在合成聚乙二醇（PEG）水凝胶上实现图案化生物活性蛋白的简便方案。该平台可独立调控基底刚度和空间性生化信号。这些水凝胶能够达到广泛范围内具有生理相关性的刚度值。此外，可通过巯基-烯烃点击化学反应，在水凝胶表面进行光图案化修饰，固定生物活性肽或蛋白质。这些方法经过优化，可在表面固定后仍保持蛋白质的功能活性。本方案具有良好的通用性，适用于任何感兴趣的蛋白质或肽，可构建多种不同的图案结构。最后，接种于这些生物活性水凝胶表面的细胞可被长期监测，以观察其对空间特异性信号的响应过程。

引言

影响细胞行为的刺激因素有很多。通常，传统的细胞培养技术依赖可溶性因子来诱导细胞反应；然而，这种方法存在一定的局限性。这些方法无法准确呈现通常存在于细胞信号传导中的全部信号模式 体内 此类信号机制包括被隔离的生长因子、细胞间信号传递以及空间特异性的生化信号。此外，基质刚度在细胞行为和干细胞分化中可发挥重要作用，而常规的细胞培养方法难以对其有效调控。1,2生物材料方法为探索这些信号机制提供了新的平台。特别是水凝胶，是调节基质刚度的理想候选材料3,4，固定蛋白质和多肽5,6，以及创建空间特异性的图案7,8.

水凝胶因其与细胞外基质（ECM）具有相似的生物物理和生物化学特性，常被用作组织工程中的支架材料9,10。天然聚合物是支架材料的常用选择，因为它们具有良好的生物相容性，并且广泛存在于人体多种组织中。然而，将天然聚合物作为基底材料的局限性在于，其缺乏易于调控的化学基团用于生物共轭反应。相比之下，合成水凝胶（如聚乙二醇，PEG）则是实现靶向化学修饰的优良平台11,12。此外，PEG水凝胶不会引发细胞反应，因此常被用作惰性骨架以构建具有生物活性的支架。

为了制备具有生物活性的水凝胶，需同时采用光聚合和硫醇-烯烃点击化学反应。这些光化学反应需要光引发剂和紫外光源。当光引发剂暴露于紫外光时，化学键断裂并形成自由基。这些自由基对于启动反应至关重要，但可能对蛋白质的生物活性产生不利影响12,13。因此，优化光引发剂的浓度和紫外光照时间以维持蛋白质的生物活性至关重要。

该方法通过丙烯酸酯-丙烯酸酯链增长型光聚合反应合成水凝胶。聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）单体相互反应，形成支化聚合物网络，构成水凝胶的结构基础。凝胶前体溶液中 PEGDA 单体的浓度可调控基底的刚度。由于水凝胶孔径较小，细胞外基质蛋白（如纤连蛋白）可被轻易包埋于水凝胶内部，以实现细胞黏附。最后，可通过硫醇-烯烃点击化学反应，在水凝胶表面进行生物活性肽或蛋白质的图案化修饰。在此过程中，水凝胶体系中未反应的游离丙烯酸酯基团在紫外光照射下，将与蛋白质或肽上的游离巯基发生反应。蛋白质或肽在水凝胶表面固定化后，水凝胶可在 4 °C 下保存数周而不会丧失生物活性。这为实验提供了便利性、灵活的实验设计空间以及实验室间合作的可能性。总体而言，该平台可独立调控生物力学和空间生化因素，从而影响细胞行为。

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方案

1. 水凝胶合成材料的准备

  1. 在无菌条件下，根据计算结果配制聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）和纤连蛋白的储备液（表1A）。
    1. 称取化合物并溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中。通常将PEGDA工作液浓度维持在50至200 mg/mL（5–20% 质量/体积）。使用0.22 µm注射器滤器过滤PEGDA溶液以实现无菌。
      注意： 用铝箔包裹 PEGDA 溶液以避光保存。每次实验建议配制新鲜的 PEGDA 溶液。
    2. 根据制造商的说明重悬纤连蛋白蛋白粉末。将纤连蛋白储存液配制成1 mg/mL的浓度，分装为60至100 µL每份，于-20 °C保存至使用。使用前在4 °C条件下数小时或过夜解冻。若蛋白原液未以无菌条件提供，需使用0.22 µm注射器滤器进行无菌过滤。
      注意：纤连蛋白用于细胞贴附，其他细胞外基质蛋白可替代使用。
    3. 称取LAP配制母液，并溶于PBS中；通常母液浓度为25 mg/mL。若溶解困难，可进行超声处理。使用0.22 µm滤器过滤溶液以实现无菌。用铝箔包裹LAP溶液，4 °C保存，可存放数月。
      注意：LAP 是光化学反应中使用的光引发剂。
  2. 准备无菌玻璃载玻片模具用于水凝胶形成。
    1. 高压灭菌一张聚酯膜；每个凝胶模具各需一张。将两片显微镜载玻片和三个塑料垫片（0.5 mm厚）分别浸泡于70%乙醇中，每个凝胶模具各需一组，浸泡时间至少2小时，通常建议过夜。使用前，将五个文件夹夹子浸泡于70%乙醇中10分钟，每个凝胶模具各需五个。
    2. 将载玻片、间隔片和夹子放置在细胞培养操作台内的灭菌小金属板上，使其晾干数小时。
    3. 通过在载玻片边缘放置塑料垫片来制备水凝胶模具。将第二张载玻片置于其上。使用长尾夹在两侧长边各固定两个、顶部固定一个，将垫片紧密固定在一起。
      注意：如果组装不当，凝胶溶液将会泄漏。
    4. 在使用前，将模具置于细胞培养罩内的紫外灯下照射30分钟以进行表面灭菌。照射至一半时间时，翻转模具以暴露其两个表面。

2. 使用游离巯基修饰蛋白质

  1. 使用电子表格中的计算结果配制将蛋白质上的氨基转化为巯基所需的储备液（表1A）。
    1. 配制反应缓冲液时，将PBS调节至pH 8，并加入5 mM EDTA。用移液器将反应缓冲液转移至0.22 µm针头滤器中进行除菌。
      注意：EDTA至关重要，因为它可防止巯基形成二硫键。巯基必须保持还原状态，反应才能顺利进行。
    2. 称取2-亚氨基硫醇（Traut试剂），用反应缓冲液溶解，配制成浓度为2 mg/mL（14 mM）的储备液。将溶液通过0.22 µm针头滤器除菌。储备液可于4 °C保存数月。
      注意：2-亚氨基硫醇是一种可与蛋白质表面暴露的游离氨基发生反应并将其转化为游离巯基的分子。
    3. 用反应缓冲液将蛋白质重新溶解，浓度控制在0.1至1 mg/mL之间。若此前未除菌，需将该溶液通过0.22 µm针头滤器进行除菌。
      注意：该蛋白质即为将被图案化固定于水凝胶表面的生化信号分子。此外，尽管蛋白质浓度可有所变化，但较高浓度更有利于形成更强的蛋白质图案。
  2. 通过混合两种储备液使蛋白质与2-亚氨基硫醇发生反应；参照表1B计算正确的体积比。通常采用8:1的摩尔比（2-亚氨基硫醇:蛋白质）。
    注意：对于较大分子量的蛋白质或更稀释的浓度，应使用更高的2-亚氨基硫醇摩尔比。请参考生产商的操作说明15。
  3. 室温孵育反应体系1小时。按照生产商的操作说明16，使用脱盐离心微柱将巯基化后的蛋白质产物与未反应的反应物分离。
    注意：该树脂的排阻极限为5 KDa。
  4. 采用Ellman法定量测定每个蛋白质分子所含游离巯基的数量。请遵循试剂盒生产商提供的操作说明17进行检测。

3. 水凝胶的形成

  1. 根据表1C中计算的数值配制凝胶前体溶液。将PEGDA、纤连蛋白（fibronectin）和LAP的体积混合在一起。剧烈吹打溶液以确保混合均匀，但避免产生气泡。将溶液避光保存。
  2. 小心地将凝胶前体溶液加样至凝胶模具的两片玻璃片之间。通常向模具中加入800至1,000 µL的溶液。将模具中的凝胶溶液暴露于紫外光下（波长：365 nm，功率：3-4 mW/cm2）1-2分钟，以形成水凝胶。
    注意：请勿将水凝胶长时间暴露于紫外光下，否则会限制其表面蛋白图案化能力。
  3. 取下夹子，并通过对两侧间隔片施加相反方向的压力，轻轻移除上方的玻璃片。
  4. 使用合适尺寸的活检打孔器切取水凝胶样品。从凝胶矩形区域中 punch 出多个水凝胶，作为重复实验组和对照组样品。

4. 水凝胶硬度测量

  1. 使用8 mm直径的活检打孔器从水凝胶上取样，用于8 mm平行板流变仪。将一个水凝胶样品装入流变仪中（参见材料表）。
  2. 降下直径为8 mm的平行板测量夹具，直至与凝胶表面接触。对于厚度为0.5 mm的水凝胶样品，保持0.5 mm的间隙距离。
  3. 在0.1%应变、0.1 Hz频率和37 °C条件下进行5分钟的时间扫描。对每次时间扫描中的G'值取平均值。每种组分分别使用独立制备的水凝胶进行重复实验。
    注意：G'值在各时间点应保持稳定；若不稳定，应进行应变百分比和频率扫描，以选择合适的参数值14。

5. 蛋白质图案化

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）程序制备所需图案的光掩模。使用高分辨率打印机将光掩模打印在透明胶片上。使用前，将光掩模浸泡于70%乙醇中10分钟。随后在细胞培养操作台中让光掩模自然晾干后再使用。
  2. 将步骤2中制备的巯基化蛋白溶液加入水凝胶表面，用于表面图案化。每个切割好的凝胶表面滴加1–2 µL/cm2的巯基化蛋白溶液。
    注意：应尽量减少蛋白溶液的用量；仅需足够均匀覆盖整个水凝胶样品表面即可。
  3. 小心地将光掩模放置在水凝胶表面。确保光掩模与水凝胶表面之间无气泡产生。轻轻按压掩模以去除可能形成的气泡。
  4. 将水凝胶暴露于第二轮紫外光照射（波长：365 nm，功率：3–4 mW/cm2）中，持续30–60秒。
    注意：需确保图案接受足够的紫外光照射，以形成清晰稳定的图案，同时避免导致蛋白功能丧失。
  5. 用PBS洗涤水凝胶以去除未反应的物质，并将每个水凝胶放入孔板的孔中。将凝胶放入各孔时需小心操作，确保图案化表面朝上。在4 °C条件下用PBS洗涤凝胶；凝胶在4 °C下至少可稳定保存两周。

6. 准备用于细胞接种的水凝胶

  1. 接种前，将凝胶在基础培养基中于 37 °C 孵育 5–10 分钟。对于人脐静脉内皮细胞（HUVECs），使用不含生长因子的 EGM-2 培养基。每孔加入的培养基体积应尽量减少，以防止水凝胶漂浮。对于 48 孔板，每孔使用 250 µL 培养基。
  2. 接种细胞前立即以 300 × g 离心 3 分钟，确保水凝胶位于孔底且不漂浮。

7. 在水凝胶上接种细胞

  1. 采用标准的无菌哺乳动物细胞培养程序进行细胞接种和实验操作。使用标准的细胞解离方法从组织培养瓶中分离HUVECs。用无菌PBS洗涤组织培养皿，并在37 °C下用胰蛋白酶孵育3–5分钟。
  2. 用过量的细胞培养基或胰蛋白酶中和液终止胰蛋白酶消化的细胞悬液。
  3. 在离心机中以 300 x g 离心 5 分钟，使细胞悬液沉淀。小心移除上清液，保留细胞沉淀。
  4. 将细胞沉淀重悬于不含生长因子的基础EGM-2培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数。
  5. 加入 75,000 个细胞/cm²2 将液体缓慢移液至每个孔的中心，以避免扰动水凝胶表面。将培养板放入37 °C细胞培养箱中。在数天内定期取出培养皿进行观察。

8. 生物活性评价

  1. 培养 E. coli 在37 °C、200 rpm条件下，在LB肉汤中于旋转摇床中悬浮培养过夜。离心沉淀 E. coli 培养后，倾出上清，用最小体积的PBS重悬细胞沉淀。称取溶菌酶，用PBS配制成1 mg/mL的储存液。
  2. 将少量（25 µL）溶菌酶储备液移入微量离心管中。加入不同浓度的LAP光引发剂（0–12 mM），并将样品暴露于紫外光照射1分钟。另设一组，在溶菌酶溶液中加入相同浓度的LAP（2 mM），并将样品暴露于不同时间的紫外光照射（0–4分钟）。每种处理均设置重复样本。
  3. 加入等体积的浓缩液 E. coli 向每个溶菌酶样品中加入溶液，使溶菌酶蛋白的终浓度为 0.5 mg/mL。将混合溶液在室温下孵育 4 小时。
    注意：这一步骤可确保有足够时间让有活性的溶菌酶裂解细菌细胞壁，并将蛋白质释放到溶液中。
  4. 使用未处理的溶菌酶与 E. coli 作为阳性对照；将其视为100%生物活性的测量值。使用仅与PBS孵育的溶菌酶溶液作为阴性对照。
  5. 离心样品以去除细胞碎片，保留上清液。采用Bradford法测定上清液中的总蛋白浓度，以确定细菌裂解液的量。
  6. 按照制造商的说明书进行 Bradford 测定18计算与阴性对照相比蛋白质浓度的变化倍数。

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结果

在 PEG 水凝胶表面构建生物活性图案的实验方案如图1所示。已开发一个电子表格用于计算每种储备溶液的体积和浓度（表1A）。需固定在水凝胶表面的蛋白质使用2-亚氨基硫醇（2-iminothiolane）进行修饰（图1B），该反应所用体积参见表1B。前体水凝胶溶液由10% 质量/体积浓度的 PEGDA 与 LAP 组成（图1A）。可通过调整前体 PEGDA 的浓度以获得所需的基底刚度（图2A）。前体溶液中包含纤连蛋白（fibronectin），以促进细胞黏附。充分混匀后，将该溶液移入已准备好的模具中，并暴露于紫外光下（图1

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讨论

本方案提供了一种用于生物学应用的生物活性蛋白图案制备方法。可根据不同的实验需求对该方案进行若干修改。首先，不同细胞类型的贴壁需求各不相同。如果初始观察到细胞在凝胶上的贴附效果较差，建议提高前体溶液中细胞外基质（ECM）蛋白的浓度。除纤连蛋白外，也可使用其他类型的ECM蛋白，包括不同类型的胶原蛋白、层粘连蛋白，或其组合。对于每一种新细胞类型，在进行水凝胶图案化之前应先优化其贴壁条件。本方案还支持用户自定义光掩模。根据具体应用需求，可制作具有不同特征尺寸、形状和整体图案的光掩模。在不使用光掩模的情况下，也可实现均匀的固定化。

本方案存在一定的局限性。如代表性结果部分所述，该方法在每一步骤中对紫外光照射量较为敏感。在水凝胶形成过程中过度曝光会限制后续表面生物偶联反应中可利用的丙烯酸酯基团。因此，本方案中的关键步骤是精确控制每一步的紫外光照射时间。此外，该方案需要较高浓度的蛋白质储备液以实现成功的图案化；蛋白质浓度过低将导致表面图案质量不佳。同时，光掩膜本身也存在局限性，仅能生成离散的图案。若需获得更复杂的图案，可采用类似方法，但需借助更先进的技术手段。<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究主要由美国心脏协会科学家发展基金（12SDG12050083，授予G.D.）、美国国立卫生研究院（R21HL102773、R01HL118245，授予G.D.）以及美国国家科学基金会（CBET-1263455 和 CBET-1350240，授予G.D.）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）Laysan BioACRL-PEG-ACRL-3400也可自行合成或通过其他供应商购买。可使用不同分子量的产品。
苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP）实验室合成
纤连蛋白Corning356008可使用其他细胞黏附蛋白，如层粘连蛋白、Matrigel
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaD8537-500ML
光掩模FineLine Imagingn/a高分辨率 DPI 的透明片材定制打印。
文件夹夹具（Binder Clips）各种供应商
紧凑型紫外光源（365 nm）UVPUVP-21可使用其他紫外光源，但需校准功率。
2-亚氨基硫醇（Pierce Traut’s Reagent）Thermo Sci.26101
Ellman’s 试剂：DTNB；5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)Thermo Sci.22582
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）Lonza传代次数在 6–10 代之间
EGM-2 培养基LonzaCC31-56, CC-3162实验中使用不含生长因子的 EGM-2 培养基。完整 EGM-2 培养基用于细胞维持
0.25% 胰蛋白酶 EDTALife Tech25200-056
胰蛋白酶中和剂Life TechR-002-100
离心机各种供应商
血细胞计数板（Hemocytometer）Hausser Sci. Bright-line
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma AldrichE6758
0.22µm 滤器Cell Treat229743
1 mL 注射器
玻璃显微镜载玻片Fisher Sci.12-550C
塑料垫片各种供应商厚度 0.5 mm
70% 乙醇BICCA2546.70-1
Bio-shieldBio-shield19-150-0010
Bradford 试剂 BIO-RAD
脱盐树脂 - Sephadex G-25GE Healthcare95016-754
微量离心柱Thermo Sci.PI69725
AR-G2 流变仪TA Instruments

参考文献

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  15. Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
  16. Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
  17. Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
  18. Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).

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