本方法中，我们采用光聚合与点击化学技术，在聚乙二醇（PEG）水凝胶表面构建蛋白质或多肽图案，以提供固定的生物活性信号，用于研究细胞响应 体外.
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摘要
摘要
许多生物刺激因素均可影响细胞行为和干细胞分化。传统的细胞培养方法主要依赖培养基中的可溶性因子来调控细胞行为。然而，可溶性添加物无法模拟某些常见的细胞信号模式，例如基质结合型生长因子、细胞间信号传递以及空间性的生化信号线索。此外，基质的生物物理特性（如基底刚度）在细胞命运决定中也起着重要作用，而这些特性难以通过常规的细胞培养手段进行有效调控。本方法介绍了一种利用光化学技术在合成聚乙二醇（PEG）水凝胶上实现图案化生物活性蛋白的简便方案。该平台可独立调控基底刚度和空间性生化信号。这些水凝胶能够达到广泛范围内具有生理相关性的刚度值。此外，可通过巯基-烯烃点击化学反应，在水凝胶表面进行光图案化修饰，固定生物活性肽或蛋白质。这些方法经过优化，可在表面固定后仍保持蛋白质的功能活性。本方案具有良好的通用性，适用于任何感兴趣的蛋白质或肽，可构建多种不同的图案结构。最后，接种于这些生物活性水凝胶表面的细胞可被长期监测，以观察其对空间特异性信号的响应过程。
引言
影响细胞行为的刺激因素有很多。通常，传统的细胞培养技术依赖可溶性因子来诱导细胞反应；然而，这种方法存在一定的局限性。这些方法无法准确呈现通常存在于细胞信号传导中的全部信号模式 体内 此类信号机制包括被隔离的生长因子、细胞间信号传递以及空间特异性的生化信号。此外，基质刚度在细胞行为和干细胞分化中可发挥重要作用，而常规的细胞培养方法难以对其有效调控。1,2生物材料方法为探索这些信号机制提供了新的平台。特别是水凝胶，是调节基质刚度的理想候选材料3,4，固定蛋白质和多肽5,6，以及创建空间特异性的图案7,8.
水凝胶因其与细胞外基质（ECM）具有相似的生物物理和生物化学特性，常被用作组织工程中的支架材料9,10。天然聚合物是支架材料的常用选择，因为它们具有良好的生物相容性，并且广泛存在于....
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方案
1. 水凝胶合成材料的准备
- 在无菌条件下，根据计算结果配制聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）和纤连蛋白的储备液（表1A）。
- 称取化合物并溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中。通常将PEGDA工作液浓度维持在50至200 mg/mL（5–20% 质量/体积）。使用0.22 µm注射器滤器过滤PEGDA溶液以实现无菌。
注意： 用铝箔包裹 PEGDA 溶液以避光保存。每次实验建议配制新鲜的 PEGDA 溶液。 - 根据制造商的说明重悬纤连蛋白蛋白粉末。将纤连蛋白储存液配制成1 mg/mL的浓度，分装为60至100 µL每份，于-20 °C保存至使用。使用前在4 °C条件下数小时或过夜解冻。若蛋白原液未以无菌条件提供，需使用0.22 µm注射器滤器进行无菌过滤。
注意：纤连蛋白用于细胞贴附，其他细胞外基质蛋白可替代使用。 - 称取LAP配制母液，并溶于PBS中；通常母液浓度为25 mg/mL。若溶解困难，可进行超声处理。使用0.22 µm滤器过滤溶液以实现无菌。用铝箔包裹LAP溶液，4 °C保存，可存放数月。
注意：LAP 是光化学反应中使用的光引发剂。
- 称取化合物并溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中。通常将PEGDA工作液浓度维持在50至200 mg/mL（5–20% 质量/体积）。使用0.22 µm注射器滤器过滤PEGDA溶液以实现无菌。
- 准备无菌玻璃载玻片模具用于水凝胶形成。
- 高压灭菌一张聚酯膜；每个凝....
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结果
在 PEG 水凝胶表面构建生物活性图案的实验方案如图1所示。已开发一个电子表格用于计算每种储备溶液的体积和浓度（表1A）。需固定在水凝胶表面的蛋白质使用2-亚氨基硫醇（2-iminothiolane）进行修饰（图1B），该反应所用体积参见表1B。前体水凝胶溶液由10% 质量/体积浓度的 PEGDA 与 LAP 组成（图1A）。可通过调整前体 PEGDA 的浓度以获得所需的基底刚度（图2A）。前体溶液中包含纤连蛋白（fibronectin），以促进细胞黏附。充分混匀后，将该溶液移入已准备好的模具中，并暴露于紫外光下（图1
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讨论
本方案提供了一种用于生物学应用的生物活性蛋白图案制备方法。可根据不同的实验需求对该方案进行若干修改。首先，不同细胞类型的贴壁需求各不相同。如果初始观察到细胞在凝胶上的贴附效果较差，建议提高前体溶液中细胞外基质（ECM）蛋白的浓度。除纤连蛋白外，也可使用其他类型的ECM蛋白，包括不同类型的胶原蛋白、层粘连蛋白，或其组合。对于每一种新细胞类型，在进行水凝胶图案化之前应先优化其贴壁条件。本方案还支持用户自定义光掩模。根据具体应用需求，可制作具有不同特征尺寸、形状和整体图案的光掩模。在不使用光掩模的情况下，也可实现均匀的固定化。
本方案存在一定的局限性。如代表性结果部分所述，该方法在每一步骤中对紫外光照射量较为敏感。在水凝胶形成过程中过度曝光会限制后续表面生物偶联反应中可利用的丙烯酸酯基团。因此，本方案中的关键步骤是精确控制每一步的紫外光照射时间。此外，该方案需要较高浓度的蛋白质储备液以实现成功的图案化；蛋白质浓度过低将导致表面图案质量不佳。同时，光掩膜本身也存在局限性，仅能生成离散的图案。若需获得更复杂的图案，可采用类似方法，但需借助更先进的技术手段。<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究主要由美国心脏协会科学家发展基金（12SDG12050083，授予G.D.）、美国国立卫生研究院（R21HL102773、R01HL118245，授予G.D.）以及美国国家科学基金会（CBET-1263455 和 CBET-1350240，授予G.D.）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA） | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | 也可自行合成或通过其他供应商购买。可使用不同分子量的产品。 |
| 苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP） | 实验室合成 | ||
| 纤连蛋白 | Corning | 356008 | 可使用其他细胞黏附蛋白，如层粘连蛋白、Matrigel |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | D8537-500ML | |
| 光掩模 | FineLine Imaging | n/a | 高分辨率 DPI 的透明片材定制打印。 |
| 文件夹夹具（Binder Clips） | 各种供应商 | ||
| 紧凑型紫外光源（365 nm） | UVP | UVP-21 | 可使用其他紫外光源，但需校准功率。 |
| 2-亚氨基硫醇（Pierce Traut’s Reagent） | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s 试剂：DTNB；5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) | Thermo Sci. | 22582 | |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） | Lonza | 传代次数在 6–10 代之间 | |
| EGM-2 培养基 | Lonza | CC31-56, CC-3162 | 实验中使用不含生长因子的 EGM-2 培养基。完整 EGM-2 培养基用于细胞维持 |
| 0.25% 胰蛋白酶 EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| 胰蛋白酶中和剂 | Life Tech | R-002-100 | |
| 离心机 | 各种供应商 | ||
| 血细胞计数板（Hemocytometer） | Hausser Sci. Bright-line | ||
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm 滤器 | Cell Treat | 229743 | |
| 1 mL 注射器 | |||
| 玻璃显微镜载玻片 | Fisher Sci. | 12-550C | |
| 塑料垫片 | 各种供应商 | 厚度 0.5 mm | |
| 70% 乙醇 | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford 试剂 | BIO-RAD | ||
| 脱盐树脂 - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| 微量离心柱 | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 流变仪 | TA Instruments |
参考文献
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al.
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重印与许可
