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用于分析学习诱导可塑性的脑片膜片钳技术

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DOI：

10.3791/55876

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2017年11月11日

 ,  , 
1Department of Physiology, Yamaguchi University Graduate School of Medicine

本文内容

摘要

脑片膜片钳技术是分析学习诱导的兴奋性或抑制性突触内在特性和可塑性变化的有效方法。

摘要

脑片膜片钳技术是研究特定脑区学习诱导神经可塑性的有力工具。为了分析运动学习诱导的可塑性，我们采用加速转棒任务对大鼠进行训练。大鼠每天执行该任务10次，每次间隔30秒，持续1至2天。与首次试验相比，大鼠在训练期间的表现显著提高。随后，我们制备了未训练大鼠和已训练大鼠的初级运动皮层（M1）急性脑片。电流钳分析显示，II/III层锥体神经元的静息膜电位、动作电位阈值、后超极化及膜电阻均发生了动态变化。在训练2天的大鼠中，电流注入诱发的动作电位数量明显多于未训练的对照组。

为了分析情境学习诱导的可塑性，我们使用被动回避（inhibitory avoidance, IA）任务对大鼠进行训练。当大鼠在箱子的暗侧经历足部电击后，学会了避免进入该区域，而停留在明亮的一侧。我们制备了未训练组、IA训练组、非配对组和穿行对照组大鼠的急性海马脑片。采用电压钳技术，从同一CA1神经元依次记录微小兴奋性和抑制性突触后电流（mEPSCs和mIPSCs）。我们发现每个CA1神经元的平均mEPSC和mIPSC振幅各不相同，提示每个神经元在其兴奋性和抑制性突触处具有不同的突触后强度。此外，与未训练的对照组相比，IA训练组大鼠的mEPSC和mIPSC振幅更高，且表现出广泛的多样性。这些结果表明，情境学习可在每个CA1神经元的兴奋性和抑制性突触处均诱导出突触后多样性。

AMPA受体或GABAA受体似乎介导了突触后电流，因为用CNQX或荷包牡丹碱（bicuculline）进行灌流处理可分别阻断mEPSC或mIPSC事件。该技术可用于研究其他脑区（如感觉皮层和杏仁核）中不同类型的學習。

引言

由 Neher 和 Sakmann 开发的膜片钳技术已广泛应用于电生理学实验1。全细胞膜片钳技术2可通过细胞膜上的吉欧姆密封来记录细胞内电流或电压。电流钳技术使我们能够分析膜特性（如静息电位、电阻和电容）的差异3。电压钳技术则使我们能够在兴奋性和抑制性突触上分析学习诱导的突触可塑性。

初级运动皮层（M1）是控制熟练自主运动的关键中枢区域。既往电生理学研究表明，在进行熟练运动训练后，M1的II/III层兴奋性突触可产生类似长时程增强（LTP）的可塑性变化4。此外，体内成像研究进一步证实，在完成熟练抓取任务后，M1神经元树突棘会发生结构重塑5,6。然而，学习所诱导的突触可塑性和内在可塑性在M1神经元中尚未得到证实。

我们近期报道，转子杆任务促进了谷氨酸能和GABA能突触的动态变化，并改变了M1层II/III神经元的内在可塑性7。在此，我们采用脑片膜片钳技术研究学习诱导的可塑性。该技术也可用于研究其他脑区中其他类型的经验依赖性可塑性。例如，感觉输入进入桶状皮层可增强AMPA受体介导的对层II/III神经元的兴奋性输入8，而线索性恐惧条件反射可增强外侧杏仁核神经元的兴奋性输入，这一过程对恐惧记忆至关重要9。此外，情境学习可导致兴奋性和抑制性突触输入到海马CA1神经元的多样性变化10,11。

方案

所有动物饲养和手术操作均遵循山口大学医学院动物实验指南，并经山口大学机构动物护理与使用委员会批准。

1. 动物

  1. 使用4至5周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠（出生后28至31天）。
  2. 将大鼠单独饲养在塑料笼具（40 cm × 25 cm × 25 cm）中，环境温度保持恒定（23 °C ± 1 °C），光照周期为12小时光照/12小时黑暗。给予大鼠 随意摄取 可自由获取水和食物。

2. 转棒实验

  1. 为了研究运动技能学习， 对每只大鼠进行处理 转子杆实验（杆直径 7 cm；跑道宽度 8.9 cm；跌落高度 26.7 cm）连续 1 或 2 天（图1A 见 Kida 等，20167）。在安静且温度受控的房间（23 ± 1 °C）中进行实验。测试前不要打扰或触碰大鼠。
  2. 将转子杆设置为加速模式，使其在5分钟内转速从4转/分钟线性增加至40转/分钟（8 π/分钟至80 π/分钟）。
  3. 将大鼠置于静止的旋转杆上，确认其四肢均位于杆上。
  4. 通过测量从旋转杆上跌落的潜伏期来评估运动功能。
  5. 每只大鼠进行10次尝试（试验），每次间隔30秒。
  6. 如果大鼠从旋转杆上跌落，应在间隔10-20秒后将其重新放回杆上。
  7. 在最后一次试验后30分钟，通过过量戊巴比妥钠（400 mg/kg）处死大鼠。在未训练的对照组大鼠的饲养笼内，注射相同剂量的麻醉剂。

3. 抑制性回避测试

  1. 为研究情境学习，使大鼠接受抑制性回避（IA）测试（参见 Mitsushima 等，2011，201310,11 中的图1D）。实验当天避免任何情节性经历，例如与其他动物接触、更换笼具或清洁操作。实验应在安静、温度受控的房间（23 ± 1 °C）中进行。
    注意：IA训练装置为一个双室丙烯酸箱（长33 cm；宽58 cm；高33 cm），包含一个明亮的安全侧和一个黑暗的电击侧，两侧之间由一个活动门隔开（图1D）。
  2. 将大鼠放置于照明箱的明亮（安全）侧。操作时应轻柔，避免造成应激。
  3. 等待短暂时间（10 至 20 秒），使大鼠适应环境。
  4. 打开滑动门，允许大鼠自由进入黑暗侧。
  5. 记录大鼠进入箱体新奇黑暗侧之前的潜伏期（秒）。首次试验的潜伏期代表训练前大鼠的表现。
  6. 当大鼠进入黑暗侧后，关闭门，并通过箱底嵌入的电极钢棒施加随机电击（2 秒，1.6 mA）。对于穿行型大鼠，允许其在训练装置中自由探索1分钟，不给予电击。对于非配对组大鼠，将其饲养在照明的电击笼中数天，随后在无情节性经历的情况下突然施加电击。所有组别操作时均应轻柔，避免应激。
  7. 每次电击后，将每只大鼠保留在黑暗侧10秒，然后放回其居住笼。
  8. 在足底电击后30分钟，再次将大鼠置于箱体的明亮侧，记录其进入黑暗侧的潜伏期。
  9. 将大鼠放回其居住笼。
  10. 在电击后60分钟，使用戊巴比妥钠过量（400 mg/kg）处死大鼠。操作时应轻柔，并通过腹腔注射给予麻醉剂。对于未经训练的对照组大鼠，直接在其居住笼中注射麻醉剂，不经历上述训练过程。

4. 解剖缓冲液

  1. 将 0.195 g NaH2PO4-2H2O、0.188 g KCl、0.074 g CaCl2、1.423 g MgCl2-6H2O 和 12.579 g 氯化胆碱晶体溶解于超纯水（900 mL 至 950 mL）中。参见表 1。
  2. 将 2.340 g 抗坏血酸、0.342 g 丙酮酸钠盐、2.100 g NaHCO3 和 4.500 g 葡萄糖晶体溶解。
  3. 加水至 1000 mL。渗透压范围应在 290 mOsm/L 至 300 mOsm/L 之间。若超出此范围，可通过添加超纯水调节渗透压。
  4. 使用前，在冰浴温度下用 5% CO2/95% O2 混合气体对溶液通气 5 分钟。

5. 人工脑脊液（aCSF）

  1. 将 0.186 g KCl、6.700 g NaCl 和 0.156 g NaH2PO4-2H2O 晶体溶解于超纯水（900 mL 至 950 mL）中。参见表 2。
  2. 用气体混合物通气 5 分钟。
  3. 溶解 1.800 g 葡萄糖和 2.184 g NaHCO3 晶体，然后从 1 M 储备液中加入 4 mL MgCl2 和 4 mL CaCl2。
  4. 加水至 1000 mL。渗透压范围应在 290 mOsm/L 至 295 mOsm/L 之间。若超出此范围，可通过添加超纯水调节渗透压。
  5. 使用前用气体混合物通气。

6. 细胞内溶液

  1. 进行电流钳记录（表3）时，将0.0746 g KCl、6.089 g K-葡萄糖酸盐、0.476 g HEPES、0.0456 g EGTA以及500 µL来自1 M储备液的MgCl2溶解于180 mL超纯水中（用KOH调节pH至7.2）。
    1. 加入0.4408 g Na2-ATP、0.0418 g Na3-GTP和0.510 g Na-磷酸肌酸。加水至200 mL，并用KOH将pH调节至7.35。
    2. 通过添加超纯水将渗透压调节至约290 mOsm/L。
    3. 分装为1 mL等份，于-30 °C冰箱中保存。
  2. 进行电压钳记录（表4）时，将5.244 g CsMeSO3、0.672 g CsCl、0.476 g HEPES、0.0456 g EGTA以及500 µL来自1 M储备液的MgCl2溶解于180 mL超纯水中。用CsOH调节pH至7.2。对于mEPSP和mIPSP记录，使用改良浓度：5.814 g CsMeSO3和0.252 g CsCl，以调节GABAA受体反应的反转电位11。
    1. 加入0.4408 g Na2-ATP、0.0418 g Na3-GTP和0.510 g Na-磷酸肌酸。加水至200 mL，并用CsOH将pH调节至7.35。
    2. 通过添加超纯水将渗透压调节至约290 mOsm/L。
    3. 分装为1 mL等份，于-30 °C冰箱中保存。

7. 切片制备

  1. 处死动物前，用碎冰冷却所有解剖工具（图2A）。在碎冰容器中加入约500 mL的冷水，以增加接触表面积。该步骤此前已有描述10,11,12。
    注意：此处使用的工具有：大剪刀、虹膜剪、刮匙、微型刮匙、镊子、细镊、不锈钢200 mL烧杯、用于修整脑组织的刀片、装有经混合气体处理的解剖液的120 mL心脏灌注注射器、连接至压扁的18号针头的硅胶管（20 cm）、不锈钢脑解剖台（厚度 = 3 mm，ϕ = 12 cm），以及用于振动切片机的固定台（ϕ = 5 cm）。
  2. 在完成行为学实验范式30分钟后，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（400 mg/kg体重）麻醉大鼠并实施处死。切片制备过程应迅速进行，以确保脑片尽可能保持良好状态10,11,12。本脑组织提取方案符合本校所有兽医标准。
  3. 用冰冻的解剖液（表1）填充120 mL注射器，并用5% CO2/95% O2混合气体持续鼓泡。灌注前需排除所有气泡。
  4. 暴露心脏后，将针头插入左心室后部。
  5. 使用注射器手动进行经心脏灌注。体型较大的大鼠需要更多的解剖液进行灌注。将脑组织浸入冰冻的解剖液中5分钟，并在浸泡过程中持续向液体中鼓泡。
  6. 使用刀片沿与目标皮层区域树突走向平行的角度修整脑组织后端。由于脑组织以切面朝下置于解剖台上，初始切割角度将决定后续所有脑片的切片角度。此步骤至关重要（图2B）。若角度不正确，可能会切断目标锥体神经元。
    注意：此处使用的工具有：用于修整脑组织的刀片、滤纸（ϕ = 10 cm）、不锈钢脑解剖台（厚度 = 3 mm，ϕ = 12 cm）、刮匙、超级胶水、滴管，以及用于振动切片机的固定台（ϕ = 5 cm）。
  7. 使用振动切片机切割厚度为350 µm的冠状脑片。将解剖室中充满经5% CO2/95% O2混合气体鼓泡的冰冻缓冲液（图2C）。在切片过程中持续向缓冲液中鼓泡。
  8. 使用虹膜剪修剪目标区域的周边组织。
  9. 将修整后的脑片在室温下用经5% CO2/95% O2混合气体鼓泡的aCSF（表2）轻轻洗涤。
  10. 将修整后的脑片保存于界面式孵育 chamber 中，直至开始记录（图2D 和 E）。在 chamber 中孵育1小时可改善细胞状态，但若孵育时间超过10小时，细胞表型可能发生改变。应盖紧 chamber 的盖子，以封闭气体和aCSF中的微小液滴。

8. 全细胞膜片钳

注意：全细胞记录需要使用放大器和低通滤波器，滤波器的截止频率设置为 5 kHz。信号经数字化后存储于计算机中。存储的数据进行离线分析（图 3A）。

  1. 使用水平拉制仪制备玻璃电极。使用连接有细玻璃管和0.22-µm滤器的常规聚乙烯1-mL注射器，将电极填充适当的溶液（见表3和表4）。
  2. 在接触细胞之前，保持正压，并将移液管电流调节至零。
  3. 形成吉欧姆密封后，施加负压以破裂细胞膜（图3F中的全细胞构型）。

9. 电流钳分析

  1. 细胞膜的特性
    1. 使用细胞内溶液（见表3）填充用于电流钳记录的膜片钳电极。电极在aCSF中的电阻介于4 MΩ至7 MΩ之间。
    2. 当细胞膜破裂后，在电压钳模式下将膜电位钳制在-60 mV。随后，在膜特性测试软件中，将模式从"bath"切换至"cell"模式，以测量细胞的固有特性，如膜电容、膜电阻和时间常数。
  2. 电流注入实验
    1. 记录完细胞的固有特性后，将记录模式从电压钳（V-CLAMP）切换至跟踪模式（TRACK, I = 0）或常规电流钳（I-CLAMP NORMAL），以进行电流注入。注意：液结电位无需校正10。
    2. 向细胞注入持续300 ms的电流。将电流强度以50 pA为步长，从−100 pA逐步增加至+550 pA，并记录每次电流注入所诱发的动作电位（锋电位）数量。
    3. 测定诱发动作电位所需的最小电压（即阈值电压）。
    4. 通过计算动作电位起始时的电压与后超极化期间所达到的最低电压之间的差值，得出后超极化幅度7。

10. 电压钳分析

  1. AMPA/NMDA 比值
    注意：AMPA/NMDA 比值是评估谷氨酸能兴奋性突触上突触后可塑性的常规方法7,8,9,10,11。但需注意，若两个组分同时增加，该比值可能不变13。
    1. 用混合气体饱和的生理溶液灌流记录室，并将温度维持在 22 °C 至 25 °C。在溶液中加入 0.1 mM 药根碱（picrotoxin）以阻断 GABAA 介导的反应，并加入 4 µM 2-氯腺苷以稳定诱发出的神经反应14。
    2. 使用细胞内溶液填充记录电极，用于电压钳记录（表 4）。在 aCSF 中检测记录电极的电阻，其阻值应在 4 MΩ 至 7 MΩ 之间。
    3. 记录 M1 区第 II/III 层锥体神经元时，将双极钨刺激电极置于待记录细胞外侧 200 µm 至 300 µm 处，位于软脑膜下方前肢代表区（中线外侧 2 mm 处）15,16,17。
    4. 记录 CA1 区锥体神经元时，将刺激电极置于待记录细胞外侧 200 µm 至 300 µm（Schaffer 侧支纤维）或内侧（颞下角通路）处（图 3B）。
    5. 逐步增加刺激强度，使突触反应> 10 pA。
    6. 将 AMPA/NMDA 比值计算为刺激开始后 150 毫秒时在 −60 mV 测得的峰值电流与在 +40 mV 测得的电流之比。注意，应平均 50 至 100 次记录以计算该比值。
  2. 微型突触后电流记录
    注意：微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）被认为对应于突触前单个谷氨酸囊泡释放所引发的反应18。相比之下，微型抑制性突触后电流（mIPSCs）被认为对应于突触前单个 GABA 囊泡释放所引发的反应18。mEPSCs 和 mIPSCs 幅度的增加反映突触后传递增强，而事件频率的增加则反映功能性突触数量增多或突触前释放概率升高11。
    1. 使用改良的细胞内溶液填充膜片钳记录电极（表 4），以将 GABAA 受体介导电流的反转电位调节至 -60 mV。
    2. 向浴液中加入 0.5 µM 河豚毒素（tetrodotoxin）以阻断自发动作电位。
    3. 将膜电位钳制在 -60 mV，记录 5 分钟的 mEPSC 事件。
    4. 将钳制电位改为 0 mV，记录 5 分钟的 mIPSC 事件。由于 M1 神经元的 AMPA 受体介导电流反转电位略高，因此 M1 神经元的 mIPSCs 应在 +15 mV 下记录，并加入 0.1 mM APV。
    5. 等待数分钟，使电流稳定。
    6. 记录 5 分钟的 mIPSC 事件。
    7. 使用软件检测微型事件，分析时仅选取幅度大于 10 pA 的事件。统计 5 分钟内 mEPSCs 或 mIPSCs 事件的数量以确定频率。对事件幅度取平均值，获得平均幅度。
    8. 确认浴液中加入 10 µM CNQX 或 10 µM 荷包牡丹碱甲碘化物（bicuculline methiodide）是否分别阻断 mEPSCs 和 mIPSCs 事件。
  3. 成对脉冲分析
    注意：突触前可塑性可通过成对脉冲分析进行评估。成对脉冲比值的升高提示突触前谷氨酸或 GABA 释放概率降低7,10,11。
    1. 分析兴奋性突触时，在浴液中加入 0.1 mM 药根碱，并在 -60 mV 记录反应。尽管我们在浴液中加入了 4 µM 2-氯腺苷，但需注意该药物会影响突触前释放概率14。
    2. 分析抑制性突触时，在浴液中加入 0.1 mM APV 和 4 µM 2-氯腺苷，并在 0 mV 记录反应。在 M1 神经元中，应在 +15 mV 记录反应。
    3. 施加两个间隔为 100 ms 或 200 ms 的成对脉冲刺激。
    4. 在每个钳制电位下记录 50–100 次连续的记录，并对数值进行平均。
    5. 将成对脉冲比值计算为突触后电流第二个峰值与第一个峰值的比值。

结果

正如我们最近所描述的7，转棒训练（图1A）可诱导M1皮层II/III层锥体神经元内在可塑性的动态变化。通过测量大鼠从旋转转棒上跌落所需的时间，可以评估其技能学习表现。跌落潜伏期越长，表明运动表现越好。在训练第1天，大鼠的转棒表现随着训练进行而持续改善，直至训练结束。在第2天，大鼠在各次训练中的平均得分已接近平台期（图1B）。与第一次试验的潜伏期相比，事后检验（post-hoc analysis）显示，在训练期间的最后一次试验中，潜伏期显著延长（图1C）。

图4A 展示了动作技能学习后神经元特性发生变化的电流钳分析示例。在未训练组和训练1天的大鼠中，分别需要注入400 pA和500 pA的电流才能诱发动作电位。相比之下，在训练2天的大鼠中，仅需注入150 pA的电流即可诱发动作电位。图4B 显示了电流强度与动作电位数量之间的关系。在训练2天的大鼠中，低至50 pA的电流即可诱发放电；相比之下，训练1天的大鼠在350 pA及以上电流刺激下产生的动作电位数量少于未训练组。此外，图4C 显示，训练1天的大鼠静息电位较低、峰电位阈值较高、后超极化更深；而训练2天的大鼠则表现出较高的静息电位（图4C）和膜电阻（图4D）。

正如我们先前所述11，IA训练（图1D）可诱导海马CA1神经元兴奋性和抑制性突触的突触后可塑性。通过测量大鼠在明箱中的停留时间，我们可以评估其情境学习能力。图1E展示了IA任务的结果。在配对电刺激后，大鼠学会避免进入暗箱侧并停留在明亮侧，而通常情况下它们更倾向于暗箱侧。因此，避免进入暗箱侧的行为倾向表明大鼠已获得情境记忆。

图5 展示了电压钳分析的一个示例，其中在情境学习后，微型突触后电流发生了显著变化。为了研究学习诱导的可塑性，记录了自发的AMPA介导的mEPSCs和GABAA介导的微小抑制性突触后电流（mIPSCs）在依次存在下记录 0.5 µM 河豚毒素（tetrodotoxin）图5A 和 B）。如二维图所示（图5C），每个CA1神经元的mEPSCs和mIPSCs平均振幅均不相同。尽管在未训练、未配对和穿行对照组大鼠中，振幅较低且分布范围较窄，但在IA训练大鼠中则表现出多样性（表5）。经方差分析（ANOVA）后继以 事后 分析显示，IA训练大鼠的mEPSC和mIPSC平均振幅显著增加（图5E)，表明CA1神经元存在学习诱导的突触后可塑性。

此外，每个CA1神经元表现出不同的mEPSC和mIPSC频率（图5D）。尽管在未训练、未配对和穿行组大鼠中，频率较低且分布范围较窄，但在IA训练大鼠中则表现出多样性（表6）。随后进行方差分析（ANOVA） 事后 分析显示，IA训练大鼠的mEPSC和mIPSC事件频率显著增加（图 5F）。这些结果有两种可能的解释：第一种是情境学习增加了神经元功能性突触的数量；另一种是情境学习提高了谷氨酸和GABA的突触前释放概率。

为了进一步研究突触前可塑性，我们还进行了成对脉冲刺激，如先前报道所述10,11。

小鼠行为学实验与脑片分析；潜伏期图示及IA训练装置示意图。
图1训练后的学习表现。
A实验设计示意图显示了转子杆训练和冠状脑切片。 B从加速旋转杆滚落的平均潜伏期 C训练第1天和第2天首次及最后一次试验中从转棒上掉落的平均潜伏期7. **P<0.01 与 首次试验 D：抑制性回避（IA）任务示意图与冠状脑切片。 E：IA训练前后进入暗箱的平均潜伏期11. **P<0.01 与 在IA训练前。冠状切片旁的数字表示相对于前囟的前方距离（单位：mm）。柱状图底部显示动物数量。误差线表示标准误（SEM）。 请点击此处查看此图的放大版本。

小鼠脑解剖；提取过程；标注图示；修整；样本保存；脑切片。
图 2：切片操作流程。
A：照片显示急性脑切片的制备过程。解剖工具在使用前置于碎冰中冷却。B：脑组织解剖与修整。注意后侧修整的角度必须与树突走向平行。C：在振动切片机槽内进行脑组织切片。脑组织浸没于解剖缓冲液中，并持续通入5% CO2/95% O2混合气体。D：由两个塑料食品盒和一根硅胶管制成的界面切片孵育室。孵育室内盛有人工脑脊液，并持续通入混合气体。E：将脑切片置于孵育室内的湿润滤纸上。标尺 = 5 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

膜片钳电生理实验装置示意图；神经元刺激反应记录；脑图谱绘制
图3膜片钳技术
A用于记录神经元电信号的膜片钳系统。图中显示了刺激电极和记录电极在大鼠运动皮层II/III层神经元中的位置。 B：为分析CA1锥体神经元的Schaffer侧支突触，将刺激电极置于辐射层；为分析颞角-海马突触，将刺激电极置于分子层。图中显示了在同一CA1神经元中诱发的AMPA受体和NMDA受体介导的兴奋性突触后电流的代表性记录 trace。 C使用切片锚定装置来稳定记录室中的脑片。 D运动皮层中的表征图谱，基于已发表的论文15,16,17. ML = 中线。 E: M1层II/III神经元在IR-DIC下的显微图像 （上部）以及记录过程中（较低。比例尺 = 10 µm. F：触碰前移液管电流的变化（顶部膜破裂时底部). 请点击此处以查看此图的放大版本。

电生理学结果；显示转子杆训练对膜电位、动作电位和电阻影响的图表
图4：电流钳分析的代表性结果7.
A：电流刺激诱导后记录的动作电位代表性轨迹。 B：未训练大鼠（空心柱）、训练1天大鼠（灰色柱）和训练2天大鼠（实心柱）脑切片中平均电流输入（pA）与动作电位输出（峰电位数量）之间的关系。 C静息电位、阈值以及II/III层神经元的后超极化 D：神经元的膜电阻和串联电阻。每组使用了9至10只大鼠。各组细胞数量显示在每根柱状图内。误差线表示标准误（SEM）。*P<0.05, **P<0.01 与 未经训练的 请点击此处以查看此图的放大版本。

神经生理学分析；mEPSC与mIPSC信号；训练组与未训练组比较；图表结果。
图5：电压钳分析的代表性结果11.
未训练小鼠中兴奋性与抑制性微型突触后电流（mEPSCs 和 mIPSCs）的代表性记录 traceA以及抑制性回避（IA）训练的大鼠（B在河豚毒素存在下，于同一CA1锥体神经元中依次测量-60 mV下的mEPSCs和0 mV下的mIPSCs0.5 µM垂直标尺 = 20 pA，水平标尺 = 200 msec。 C未训练、IA训练、未配对和走过组大鼠mE(I)PSC平均振幅的二维图。 D：四个组别中mE(I)PSC频率的二维图。注意每个CA1神经元表现出不同的平均mE(I)PSC幅度和频率。IA训练不仅增强了平均幅度 (E但还增加了微小兴奋性（抑制性）突触后电流（mE(I)PSC）事件的发生频率 (F)。每组使用4-6只大鼠。细胞数量显示在柱状图底部。红色加号（C，D）以及带垂直线的柱状图（E，F) 表示均值 ± 标准误。**P<0.01 与 未经训练的大鼠 请点击此处查看此图的放大版本。

解剖缓冲液（总体积 1L）
NaH2PO4 • 2H2O0.195 g1.25 mmol/L
KCl0.188 g2.5 mmol/L
CaCl20.074 g0.5 mmol/L
MgCl2 • 6H2O1.423 g7.0 mmol/L
Choline chloride12.579 g90 mmol/L
Ascorbic acid2.340 g11.6 mmol/L
Pyruvic acid0.342 g3.1 mmol/L
NaHCO32.100 g25 mmol/L
Glucose4.500 g25 mmol/L

表1：解剖缓冲液配方

人工脑脊液（总体积 1L）
KCl0.186 g2.5 mmol/L
NaCl6.700 g114.6 mmol/L
NaH2PO4 •2H2O0.156 g1 mmol/L
葡萄糖1.800 g10 mmol/L
NaHCO32.184 g26 mmol/L
1M MgCl24 mL4 mmol/L
1M CaCl24 mL4 mmol/L

表2： 人工脑脊液（CSF）配方

电流钳制用细胞内溶液（总体积 200 mL）
KCl0.0746 g5 mmol/L
K-Gluconate6.089 g130 mmol/L
HEPES0.476 g10 mmol/L
EGTA0.0456 g0.6 mmol/L
1M MgCl2500 µL2.5 mmol/L
Na2 ATP0.4408 g4 mmol/L
Na3 GTP0.0418 g0.4 mmol/L
Na phosphocreatine0.510 g10 mmol/L

表3：用于电流钳记录的细胞内溶液配方

电压钳制用细胞内溶液（总体积 200 mL）
CsMeSO35.244 g(5.814)*115 mmol/L(127.5)*
CsCl0.672 g(0.252)*20 mmol/L(7.5)*
HEPES0.476 g10 mmol/L
EGTA0.0456 g0.6 mmol/L
1M MgCl2500 µL2.5 mmol/L
Na2 ATP0.4408 g4 mmol/L
Na3 GTP0.0418 g0.4 mmol/L
Na phosphocreatine0.510 g10 mmol/L
* 微小记录用低 Cl- 浓度

表4： 电压钳记录用细胞内溶液的配制配方

参数未训练IA 训练非配对穿行
mEPSC 振幅方差5.832.14.75.9
标准差2.45.72.22.4
变异系数0.1890.3260.1770.190
mIPSC 振幅方差17.156.731.820.7
标准差4.17.55.64.5
变异系数0.2790.3870.3670.286

表5：抑制性回避（IA）训练大鼠中微型兴奋性和抑制性突触后电流（mEPSC和mIPSC）幅度的多样性

参数未训练IA 训练非配对穿行
mEPSC 频率方差2782195188195
标准差17471414
变异系数0.9021.1980.8930.874
mIPSC 频率方差32822721213855135
标准差571653772
变异系数1.1951.0060.9550.836

表6：抑制性回避（IA）训练大鼠中微型兴奋性和抑制性突触后电流（mEPSC和mIPSC）频率的多样性

讨论

脑片膜片钳技术的主要局限性在于脑片制备中的记录，这可能无法反映体内的真实情况。尽管体内电流钳分析更为可靠，但从清醒动物中获取足够数据在技术上具有挑战性。由于每个锥体神经元具有不同的细胞特性，因此需要足够数量的细胞，才能在训练后对神经元间的差异进行充分分析。此外，电压钳分析需要持续使用CNQX、APV或荷包牡丹碱进行药物处理，以确定突触后反应的性质。为了分析由单个谷氨酸或GABA囊泡释放所诱导的微小反应，需持续使用河豚毒素处理以阻断自发性动作电位。尽管近年来发展的多光子成像技术在分析兴奋性突触的形态学变化方面功能强大19，但仍需结合膜片钳技术来分析突触在体内的功能。目前，分析抑制性突触的形态学变化仍十分困难，因为大多数抑制性突触不形成树突棘。因此，对于训练动物中细胞特性或兴奋性/抑制性突触功能的分析，脑片膜片钳技术仍是目前最合适的方法。

通过电流钳分析（图4），我们近期报道了运动学习诱导的II/III层神经元内在可塑性。具体而言，训练1天的大鼠表现出静息膜电位显著降低以及动作电位阈值升高；训练2天的大鼠则表现出静息膜电位显著升高，从而导致兴奋性增强。这些结果提示，在训练后的大鼠M1区II/III层神经元中，其内在可塑性发生了动态变化。进一步的电压钳分析显示，训练1天的大鼠配对脉冲比值增加，提示突触前GABA释放概率出现短暂性下降7。因此，GABA在II/III层突触处的去抑制作用可能触发了M1区学习诱导的可塑性变化。支持这一观点的是，M1脑片制备过程中需在灌流液中加入GABAA受体阻断剂才能诱导长时程增强（LTP）20。

微小突触后电位的分析是检测IA训练动物中突触可塑性的有力方法。在单个CA1神经元中连续记录mEPSC和mIPSC，可分析每个神经元的突触兴奋性/抑制性强度。由于单个mE(I)PSC反应来源于单个谷氨酸或GABA囊泡，mE(I)PSC振幅的增加提示突触后增强。通过mE(I)PSC分析，我们发现每个CA1神经元的兴奋性/抑制性输入强度存在个体差异（图5C）。IA训练显著促进了突触强度的多样性，但在其他组中未观察到这一现象（表5）。

学习诱导的突触多样性可通过数学方法进行分析。通过计算每个数据点的出现概率，可利用克劳德·E·香农（Claude E. Shannon）的信息论21将每个神经元的数据转换为自熵（bit）。出现概率较高（接近均值水平）的数据点表示自熵较低，而出现概率极低（偏离均值）的数据点则表示自熵较高。与未训练的大鼠相比，IA训练大鼠每个神经元的自熵明显增加，但在非配对组或穿行组大鼠中则未见此现象22。该分析表明，在情境学习后，CA1区内部的信息量有所增加。

脑片膜片钳技术还可用于研究外侧杏仁核中的线索性恐惧条件反射9，以及桶状皮层中的感觉经验研究8。此外，该技术可与其他多种技术结合，以开展更深入的研究。例如，可通过病毒介导的绿色荧光蛋白（GFP）标记基因递送技术与膜片钳技术联用，分析特定分子的功能。另外，可通过局部微量注射逆行示踪剂，以可视化投射至特定脑区的神经元。随后，利用电流钳技术，可在已标记的神经元中分析其细胞特异性特性23。进一步地，将双光子激光扫描显微镜与双光子激光解笼锁谷氨酸技术相结合，已被用于展示小鼠大脑皮层II/III层锥体神经元中树突棘特异性的生长及其兴奋性突触后电流（EPSC）反应19。因此，通过与新型化学物质、基因递送以及光操控技术相结合，脑片膜片钳技术正不断得到改进和拓展。

披露

作者声明不存在利益冲突。我们确认已阅读该期刊关于伦理出版问题的立场，并申明本报告符合其指导方针。资助方在研究设计、数据收集或分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

致谢

我们感谢Paw-Min-Thein-Oo博士、Han-Thiri-Zin博士以及H. Tsurutani女士提供的技术协助。本项目得到了日本文部科学省青年科学家研究费（H.K. 和 Y.S.）、科学研究B类项目（D.M.）、科学研究C类项目（D.M.）以及创新领域科学研究项目（D.M.）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
转棒跑步机Med Associates Inc.ENV577
被动回避实验箱Shinano Seisakusho
戊巴比妥钠协和化学工业株式会社
刀片日进电气株式会社LC05Z
心脏灌注注射器JMS株式会社JS-S00S
振动切片机 Leica MicrosystemsVT-1200
水平拉制仪Sutter InstrumentModel P97
Microfilm 34号规格微丝World Precision Instruments, IncMF34G-5
0.22 µm 滤器MilliporeSLGVR04NL
Axopatch–1D 放大器 Axon Instruments
Digidata 1440 模数转换板Axon Instruments
pCLAMP 10 软件Axon Instruments
直立式显微镜OlympusBX51WI
CCD相机OlympusU-CMAD3
相机控制器滨松光子学株式会社C2741
刺激器日本光电工业株式会社SEN-3301
隔离器日本光电工业株式会社SS-104J
电动操纵器Sutter InstrumentMP-285
显微操作器成机株式会社NMN-21
蠕动泵 Gilson, IncMINIPULS® 3
玻璃毛细管成机株式会社GD-1.5
Ag/AgCl电极 World Precision Instruments, IncEP4
切片固定锚Warner Instruments64-0252
刺激电极Unique Medical Co., LtdKU201-025B
材料公司目录编号备注
解剖缓冲液/
人工脑脊液
NaH2PO4 • 2H2OSigma-Aldrich 公司C1426
KCl和光纯药工业株式会社163-03545
CaCl2和光纯药工业株式会社039-00475
MgCl2 • 6H2O和光纯药工业株式会社135-00165
氯化胆碱 Sigma-Aldrich 公司C7527
抗坏血酸和光纯药工业株式会社190-01255
丙酮酸钠和光纯药工业株式会社199-03062
NaHCO3Sigma-Aldrich 公司28-1850-5
葡萄糖Sigma-Aldrich 公司07-0680-5
材料公司目录编号备注
细胞内液
K-葡萄糖酸盐Sigma-Aldrich 公司G4500
HEPES和光纯药工业株式会社346-01373
EGTA和光纯药工业株式会社348-01311
Na2 ATP那卡来提斯克株式会社01072-24
Na3 GTPSigma-Aldrich 公司G-8877
磷酸肌酸钠Sigma-Aldrich 公司P-7936
CsMeSO3Sigma-Aldrich 公司C1426
CsCl和光纯药工业株式会社033-01953
材料公司目录编号备注
溶于aCSF的药物
2-氯腺苷Sigma-Aldrich 公司C5134
苦味毒 Sigma-Aldrich 公司P-1675
河豚毒素和光纯药工业株式会社207-15901
CNQX Sigma-Aldrich 公司C239
APVSigma-Aldrich 公司A5282

参考文献

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