本方法通过超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析多种底物，用于在HeLa细胞中鉴定组蛋白去乙酰化酶（HDAC）亚型特异性抑制剂。该方法无需使用抗体，可在活细胞环境中反映HDAC1和HDAC6的活性，与单一亚型的无细胞检测方法相比具有优势。
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方法文章
使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性
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本文内容
摘要
摘要
寻找新的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在药物研发中日益受到关注。自从I类HDAC抑制剂罗米地辛被批准用于癌症治疗，以及HDAC6特异性抑制剂进入多发性骨髓瘤的临床研究以来，亚型选择性成为研究热点。本方法用于测定受试化合物在细胞中对HDAC1和HDAC6的抑制活性。通过超高效液相色谱-质谱法（UHPLC-MS）分析经处理与未处理的HeLa细胞孵育后的特异性底物，以测定不同亚型的酶活性。与在分离亚型上进行的无细胞生化检测相比，该方法的优势在于能够反映细胞环境中内源性HDAC的活性。此外，由于该方法基于合成底物的定量分析，因此无需依赖抗体识别内源性乙酰化蛋白。该方法易于适用于多种细胞系，并可实现自动化操作。此前该方法已在神经母细胞中成功用于发现HDAC6选择性化合物。本文以HeLa细胞为例，展示了标准HDAC抑制剂——曲古抑菌素A（非特异性）、MS275（HDAC1特异性）和管抑素A（HDAC6特异性）的代表性实验结果。
引言
HDAC 属于一类能够在染色质结构中使组蛋白去乙酰化的酶。它们在细胞质中还具有其他蛋白质底物，并分布于多种细胞区室中。迄今为止已鉴定出 18 种 HDAC 同工型，这些同工型与多种细胞机制相关，包括转录因子和基因表达的调控，以及细胞信号传导和运输。1,2,3,4,5,6,7HDAC 催化抑制剂已作为潜在的癌症治疗药物出现。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的大多数 HDAC 抑制剂用于治疗 T 细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤，且均为非特异性 HDAC 抑制剂，例如伏立诺他（SAHA）、贝利司他和帕比司他。8,9然而，广谱抑制剂已报道存在一系列副作用，因此寻找亚型特异性小分子已成为药物化学与药物发现领域的研究热点。相应地，I类（HDAC1-3 和 HDAC8）选择性抑制剂罗米地辛（romidepsin）已作为获批药物投入使用
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方案
1. 细胞培养
注意：以下步骤均在标准组织培养罩内进行。要求熟悉无菌操作技术。
- 在含有10%胎牛血清、青霉素G（100 U/mL）和链霉素（100 mg/mL）的MEM培养基中，将HeLa细胞培养至T75细胞培养瓶中细胞融合度达到80%。
注意：细胞培养、处理和裂解步骤均在层流条件下进行，37 °C的孵育步骤需在含5% CO2的湿润环境中无菌操作。 - 用5 mL DPBS洗涤细胞两次，吸除DPBS后加入1 mL细胞解离试剂，于37 °C孵育5 min以使细胞脱落。
- 加入9 mL MEM培养基，充分重悬细胞悬液，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 用MEM培养基将细胞悬液密度调整至6 × 104 cells/mL。
- 向无菌、平底、经组织培养处理的96孔板的对照孔和待测孔中各加入100 µL细胞悬液（图1A）。
- 向96孔板的空白孔中加入100 µL MEM培养基（图1A）。
- 将96孔板在37 °C孵育24 h。
注意：24 h孵育时间适用于检测HeLa细胞内源性HDAC活性。对于HDAC活性未知的不同细胞类型，可能需要对对照细胞进行时间过程评估。
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结果
为展示该方法在鉴定HDAC1（I类）和HDAC6（IIb类）的非选择性与选择性抑制剂中的应用，采用已知的标准化合物处理HeLa细胞：曲古抑菌素A（对HDAC1与HDAC6无选择性）18、MS275（HDAC1选择性抑制剂）19 和 tubastatin A（HDAC6选择性抑制剂）20。利用本方法（图1），可在活细胞中直接测定HDAC1（通过检测MOCPAC去乙酰化）和HDAC6（通过检测BATCP去乙酰化）的IC50值（图2）。曲古抑菌素A对HDAC1和HDAC6均具有强效但无选择性；而MS275对HDAC1具有选择性，tubastatin A则明显选择性作用于HDAC6。
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讨论
HDAC 抑制是药物发现领域的热点话题，目前的研究重点是针对癌症治疗的 HDAC6 选择性抑制剂21。HDAC 选择性通常通过一系列高通量、无细胞的生化检测方法进行评估，旨在确定化合物对各个 HDAC 亚型的抑制效力21。然而，抑制剂的选择性还需在活细胞中进一步验证，即通过评估内源性蛋白底物的乙酰化状态（如组蛋白用于评估 I 类 HDAC，微管蛋白用于评估 HDAC6）来确认。因此，通常需要借助基于抗体识别的细胞检测方法（例如免疫染色、Western 印迹、流式细胞术和 ELISA），以对特定化合物在活细胞中对不同亚型的作用效力进行定量或半定量评估21。在无细胞酶学检测中表现出选择性的化合物，在细胞或组织中却缺乏选择性的情况并不少见17,22，反之亦然19。这可能是由于酶来源未标准化，以及生化检测中缺乏辅因子或蛋白.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢COST行动CM1406（表观遗传化学生物学）的支持。本出版物中报道的研究得到了Pierre Mercier基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | 同义词：BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| 乙腈，HPLC级 | 菲舍尔科技公司 | 10660131 | |
| 甲酸，LC/MS级 | 菲舍尔科技公司 | 10596814 | |
| H2O，HPLC级 | 经Milli-Q纯化系统过滤的蒸馏H2O | ||
| HeLa细胞 | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| 细胞解离试剂 TrypLE Express | 赛默飞世尔科技公司 | 12604013 | |
| DMSO，细胞培养级 | Applichem | 146463 | |
| DPBS | 赛默飞世尔科技公司 | 14190144 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1810 | |
| MEM | 赛默飞世尔科技公司 | 22561021 | |
| 青霉素-链霉素 | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA缓冲液 | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast蛋白酶抑制剂片剂 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96孔板，无菌，平底，Corning组织培养处理 | VWR | 29442-058 | |
| 96孔板，非无菌，V型底，Corning | VWR | 29442-404 | 用于离心步骤 |
| 96孔板，锥形底，Nunc | 赛默飞世尔科技公司 | 249944 | 与Acquity UHPLC系统兼容 |
| T75细胞培养瓶，Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| 可剥离热封箔 | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC系统 | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | 菲舍尔科技公司 | 05-413-323 | |
| 积分软件：MassLynx V4.1 | Waters | 目录号不可用 | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | 目录号不可用 | |
| Quattro micro API 串联四极杆系统 | Waters | 目录号不可用 |
参考文献
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
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重印与许可
