使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性

摘要

本方法通过超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析多种底物，用于在HeLa细胞中鉴定组蛋白去乙酰化酶（HDAC）亚型特异性抑制剂。该方法无需使用抗体，可在活细胞环境中反映HDAC1和HDAC6的活性，与单一亚型的无细胞检测方法相比具有优势。

摘要

寻找新的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂在药物研发中日益受到关注。自从I类HDAC抑制剂罗米地辛被批准用于癌症治疗，以及HDAC6特异性抑制剂进入多发性骨髓瘤的临床研究以来，亚型选择性成为研究热点。本方法用于测定受试化合物在细胞中对HDAC1和HDAC6的抑制活性。通过超高效液相色谱-质谱法（UHPLC-MS）分析经处理与未处理的HeLa细胞孵育后的特异性底物，以测定不同亚型的酶活性。与在分离亚型上进行的无细胞生化检测相比，该方法的优势在于能够反映细胞环境中内源性HDAC的活性。此外，由于该方法基于合成底物的定量分析，因此无需依赖抗体识别内源性乙酰化蛋白。该方法易于适用于多种细胞系，并可实现自动化操作。此前该方法已在神经母细胞中成功用于发现HDAC6选择性化合物。本文以HeLa细胞为例，展示了标准HDAC抑制剂——曲古抑菌素A（非特异性）、MS275（HDAC1特异性）和管抑素A（HDAC6特异性）的代表性实验结果。

引言

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）属于一类能够在染色质结构中去乙酰化组蛋白的酶类。它们在细胞质中还具有其他蛋白质底物，并分布于多种细胞区室中。迄今为止已鉴定出18种HDAC亚型，这些亚型与多种细胞机制相关，包括转录因子和基因表达的调控，以及细胞信号传导和转运^{1,2,3,4,5,6,7}。HDAC催化抑制剂已作为潜在的抗癌治疗药物受到关注。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的大多数HDAC抑制剂用于治疗T细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤，且均为非特异性HDAC抑制剂，例如伏立诺他（vorinostat, SAHA）、贝利司他（belinostat）和帕比司他（panobinostat）^8,9。然而，广谱抑制剂已报道与一系列副作用相关，因此寻找亚型特异性的小分子化合物已成为药物化学和新药研发的热点领域。相应地，针对I类HDAC（HDAC1-3和HDAC8）的选择性抑制剂罗米地辛（romidepsin）已被批准用于临床治疗¹⁰，而特异性靶向HDAC6的抑制剂目前正处于临床试验阶段，在多发性骨髓瘤治疗中展现出更高的治疗潜力^{11,12,13,14,15}。

用于表征组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂的筛选实验，通常基于将HDAC底物与酶源（单一亚型、核提取物或细胞裂解液）共同孵育。该底物通常为一段含有乙酰化赖氨酸残基的小肽序列，并连接一个可裂解的荧光基团（例如，香豆素），如N-(4-甲基-7-氨基香豆素基)-Nα-(叔丁氧羰基)-Nω-乙酰赖氨酰胺（MAL）¹⁶。为了区分不同亚型的特异性活性，需分别进行针对各个亚型的无细胞实验，但这些实验可能无法真实反映活细胞中各亚型的实际活性。目前已有商业化的亚型特异性底物，例如苯甲基(S)-[1-(4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基氨基甲酰基)-5-丙酰胺基戊基]氨基甲酸酯（MOCPAC，HDAC1特异性底物）和(S)-[5-乙酰胺基-1-(2-氧代-4-三氟甲基-2H-色烯-7-基氨基甲酰基)戊基]氨基甲酸叔丁酯（BATCP，HDAC6特异性底物）（图1B）。然而，若将包含MAL、MOCPAC和BATCP的多种底物混合物加入活细胞中，则由于它们均携带相同的可裂解荧光基团，无法通过荧光检测方法分辨各个去乙酰化产物。

本文所述方法通过多底物检测联合超高效液相色谱-电喷雾串联质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）分析，可在HeLa细胞中实现各底物及其去乙酰化产物的检测与相对定量¹⁷。该方法在HeLa细胞中进行组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性检测，能够直接鉴定受试化合物对内源性HDAC的抑制活性及其特异性。本研究重点关注HDAC1和HDAC6，并对二者进行同步评估。为在单次孵育反应中完成这些酶活性测定，将非特异性与特异性HDAC底物的混合物加入已接种于96孔板的经处理与未处理的HeLa细胞中。经过孵育后，裂解细胞以释放底物及其相应的反应产物，并采用UHPLC-MS方法进行分离与检测（图1C）。MAL、MOCPAC和BATCP三种底物的去乙酰化产物分别为去乙酰化MAL（dMAL）、去乙酰化MOCPAC（dMOCPAC）和去乙酰化BATCP（dBATCP）。对于具有活性的化合物，可进一步构建剂量-反应曲线。

图1：基于细胞的HDAC检测通用方案，通过UHPLC-MS分析多种底物，鉴定HDAC1和HDAC6特异性抑制剂。（A）典型的96孔板示意图，包含经处理（测试化合物）和未处理（对照）的HeLa细胞，以及无细胞的空白对照。（B）以混合物形式加入的底物化学结构（每种21 µM），由内源性HDAC去乙酰化。（C）典型的UHPLC-MS色谱图，显示所加底物（MAL、MOCPAC和BATCP）及其去乙酰化产物（分别为dMAL、dMOCPAC和dBATCP）的峰。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 细胞培养

注意：以下步骤均在标准组织培养罩内进行。要求熟悉无菌操作技术。

1. 在含有10%胎牛血清、青霉素G（100 U/mL）和链霉素（100 mg/mL）的MEM培养基中，将HeLa细胞培养至T75细胞培养瓶中细胞融合度达到80%。
   注意：细胞培养、处理和裂解步骤均在层流条件下进行，涉及37 °C孵育的步骤需在含5% CO₂的湿润环境中无菌操作。
2. 用5 mL DPBS洗涤细胞两次，吸除DPBS后加入1 mL细胞解离试剂。在37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。
3. 加入9 mL MEM培养基，充分重悬细胞悬液，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
4. 用MEM培养基将细胞悬液密度调整至6 × 10⁴ 个细胞/mL。
5. 向无菌、平底、经组织培养处理的96孔板的对照孔和待测孔中各加入100 µL细胞悬液（图1A）。
6. 向96孔板的空白孔中加入100 µL MEM培养基（图1A）。
7. 将96孔板在37 °C孵育24小时。
   注意：24小时孵育时间适用于检测HeLa细胞内源性HDAC活性。对于HDAC活性未知的不同细胞类型，可能需要对对照细胞进行时间进程评估。

2. 使用测试化合物和HDAC底物处理细胞

1. 吸出96孔板各孔中的培养基。
2. 加入25 µL的2倍浓度待测化合物 例如， 在 MEM 中加入曲古抑菌素 A（trichostatin A）、MS275 和 tubastatin A 至检测孔。向对照孔和空白孔中各加入 25 µL MEM。
   注意：待测化合物的浓度需进行调整，以提供至少5个最终测试浓度（每孔一个浓度）。待测化合物中DMSO的最终浓度不得超过0.5%，且在各孔（包括空白孔和对照孔）中应保持一致。最终孵育体积为每孔50 µL。Trichostatin A在5个浓度下进行测试，范围为500至1.95 nM（1:4稀释）；MS275和tubastatin A在5个浓度下进行测试，范围为8,000至6.17 nM（1:6稀释）。各用户应通过绘制剂量-反应曲线确定每种待测化合物所需的最终测试浓度。
3. 向对照孔和检测孔中加入25 µL底物混合液（MEM中含42 µM MAL、42 µM MOCPAC和42 µM BATCP）。向空白孔中加入25 µL MEM。
   注意：每种底物的终浓度为 21 µM。MOCPAC 和 BATCP 分别用于区分 HDAC1 和 HDAC6 的活性（图 1B当在这些底物上未观察到活性时，使用 MAL 可能有助于鉴定对另一种 HDAC 亚型的活性。
4. 将96孔板置于湿润的含5% CO₂的环境中，37 °C孵育8 h₂ 培养箱
   注意：该孵育时间适用于HeLa细胞，可使内源性HDAC与合成底物相互作用。不同细胞系可能需要调整孵育时间及/或底物浓度。

3. 超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱法的细胞裂解与样品制备

注意：样品制备步骤中使用的有机化学品具有高度易燃性，且通过摄入或吸入具有毒性。请佩戴适当个人防护装备，如手套和护目镜。

1. 向96孔板的每个孔中加入10 µL 6x RIPA缓冲液（由10x RIPA缓冲液稀释而成），并添加蛋白酶抑制剂。
2. 向每孔加入160 µL预冷的乙腈以终止反应，并通过反复吹打混匀。
   注意：在此步骤前，应将乙腈保存在-20 °C条件下。
3. 将该板置于-80 °C冰箱中冷冻10分钟。
4. 从冰箱中取出板，将每孔中的220 µL内容物转移至一个非无菌、圆锥底（V型底）96孔板中。在4 °C条件下以5,000 × g离心10分钟。
   注意：此步骤旨在去除蛋白质和盐类。如有需要，可在离心前将溶液转移至单独的圆锥形离心管中，或通过一组96孔、0.65 µm PVDF滤板进行过滤。在进行UHPLC分析前，必须成功去除沉淀物。
5. 将200 µL上清液（或滤液）转移至与UHPLC系统兼容的96孔板中，并使用可剥离热封膜通过板封仪密封。
   注意：在移取上清液时避免吸取沉淀。若无法立即进行UHPLC分析，该板可在4 °C条件下最多保存24小时，直至分析开始。

4. 超高效液相色谱-串联质谱分析

1. 使用流动相体系（95% A : 5% B）冲洗超高效液相色谱（UHPLC）系统：
   A：H₂O，色谱纯，含0.1%甲酸（配制1 L）
   B：乙腈，色谱纯，含0.1%甲酸（配制1 L）。
   注意：流动相含有有机化学品，易燃，经口或吸入有毒。操作时应佩戴适当个人防护装备，如手套和护目镜。
2. 将96孔板放入配备板架的样品管理器中。根据表1提供的UHPLC-ESI-MS/MS条件运行样品。
   注：分析用96孔板的每一列应包含一个对照孔和一个空白孔（如图1A的板布局所示）。对照孔代表测试细胞系中100%的酶活性，空白孔用于检测质谱源背景信号是否稳定。若在某一空白孔中检测到异常质谱峰，应进行排查，以避免质谱灵敏度发生变化。

5. 数据分析

1. 使用适当的超高效液相色谱（UHPLC）积分软件，对每种底物及其去乙酰化产物的峰面积进行积分。
   注：建议采用自动积分参数并结合平滑方法（例如，均值法，窗口大小为3，平滑次数为2）。根据表1提供的色谱条件，洗脱顺序依次为 dMAL（5.8 分钟）、dBATCP（6.0 分钟）、dMOCPAC（6.2 分钟）、MAL（7.6 分钟）、MOCPAC（8.9 分钟）和 BATCP（9.8 分钟），如图1C所示。
2. 针对每种底物，分别计算每个色谱图中（测试样品与对照样品）去乙酰化产物与乙酰化底物的峰面积比值（去乙酰化/乙酰化）。
3. 计算每个测试样品的HDAC抑制率：
   
   注：HDAC1 抑制率通过 dMOCPAC/MOCPAC 的峰面积比值计算；HDAC6 抑制率通过 dBATCP/BATCP 的比值计算。dMAL/MAL 比值可用于表示总体 HDAC 抑制水平。

结果

为了展示该方法在鉴定HDAC1（I类）和HDAC6（IIb类）的非选择性及选择性抑制剂中的应用，使用已知的标准化合物处理HeLa细胞：曲古抑菌素A（对HDAC1和HDAC6无选择性）¹⁸、MS275（HDAC1选择性抑制剂）¹⁹ 和 tubastatin A（HDAC6选择性抑制剂）²⁰。利用本方法（图1），可在活细胞中直接测定HDAC1（通过检测MOCPAC去乙酰化）和HDAC6（通过检测BATCP去乙酰化）的IC₅₀值（图2）。曲古抑菌素A对HDAC1和HDAC6均具有强效抑制作用，但无选择性；而MS275对HDAC1具有选择性，tubastatin A则明显选择性作用于HDAC6。

讨论

HDAC 抑制是药物发现领域的热点话题，目前的研究重点是针对癌症治疗的 HDAC6 选择性抑制剂²¹。HDAC 选择性通常通过一系列高通量、无细胞的生化检测方法进行评估，旨在确定化合物对各个 HDAC 亚型的抑制效力²¹。然而，抑制剂的选择性还需在活细胞中进一步验证，即通过评估内源性蛋白底物的乙酰化状态（如组蛋白用于评估 I 类 HDAC，微管蛋白用于评估 HDAC6）来确认。因此，通常需要借助基于抗体识别的细胞检测方法（例如免疫染色、Western 印迹、流式细胞术和 ELISA），以对特定化合物在活细胞中对不同亚型的作用效力进行定量或半定量评估²¹。在无细胞酶学检测中表现出选择性的化合物，在细胞或组织中却缺乏选择性的情况并不少见^17,22，反之亦然¹⁹。这可能是由于酶来源未标准化，以及生化检测中缺乏辅因子或蛋白...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	同义词：BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubastatin A	Sigma-Aldrich	SML0044
乙腈，HPLC级	菲舍尔科技公司	10660131
甲酸，LC/MS级	菲舍尔科技公司	10596814
H2O，HPLC级			经Milli-Q纯化系统过滤的蒸馏H2O
HeLa细胞	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
细胞解离试剂 TrypLE Express	赛默飞世尔科技公司	12604013
DMSO，细胞培养级	Applichem	146463
DPBS	赛默飞世尔科技公司	14190144
胎牛血清	Biowest	S1810
MEM	赛默飞世尔科技公司	22561021
青霉素-链霉素	Bioconcept	4-01F00-H
10x RIPA缓冲液	Abcam	ab156034
SigmaFast蛋白酶抑制剂片剂	Sigma-Aldrich	S8820
96孔板，无菌，平底，Corning组织培养处理	VWR	29442-058
96孔板，非无菌，V型底，Corning	VWR	29442-404	用于离心步骤
96孔板，锥形底，Nunc	赛默飞世尔科技公司	249944	与Acquity UHPLC系统兼容
T75细胞培养瓶，Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
可剥离热封箔	Waters	186002789
Acquity UPLC系统	Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R	菲舍尔科技公司	05-413-323
积分软件：MassLynx V4.1	Waters		目录号不可用
Combi thermo-sealer SP-0669/240	Waters		目录号不可用
Quattro micro API 串联四极杆系统	Waters		目录号不可用