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In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

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DOI：

10.3791/55886

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2017年7月25日

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

本文内容

摘要

本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero 胚胎电穿孔、器官型脑片培养与活细胞共聚焦显微成像相结合，可对迁移神经元中目的基因的过表达或下调效应进行直接且动态的研究，并分析其在发育过程中的分化情况。

摘要

在子宫内 电穿孔是一种快速而强大的方法，用于研究发育中鼠胚大脑皮层内神经元径向迁移的过程。该方法有助于描述径向迁移的不同阶段，并表征调控该过程的分子机制。为了对迁移中的神经元进行直接且动态的时间追踪分析，必须对它们进行连续观察。本方案描述了一种结合了 在子宫内 通过器官型脑片培养结合电穿孔与延时共聚焦成像技术，可直接观察并动态分析放射状迁移的皮层神经元。此外，还可对迁移神经元进行详细表征，例如迁移速度、速度分布特征以及径向取向变化等。该方法易于调整，可用于在放射状迁移的皮层神经元中通过基因功能缺失、功能获得及功能挽救实验，对目的基因进行功能分析。迁移神经元的延时成像是一项前沿技术，一经建立，即可成为研究神经元迁移障碍小鼠模型中大脑皮层发育的有力工具。

引言

新皮层是认知、情绪以及感觉运动功能的主要区域。它由六个平行于脑表面的水平层组成。在发育过程中，背侧端脑侧壁的前体细胞产生投射神经元，这些神经元径向迁移至软脑膜表面，并获得特定于皮层层的神经元身份。这些神经元在脑室区/脑室下区（VZ/SVZ）生成后，会暂时呈现多极形态，并减缓迁移速度。在中间带（IZ）短暂停留后，它们转变为双极形态，附着于放射状胶质支架上，并继续沿径向迁移进入皮层板（CP）。当到达最终目标位置时，投射神经元脱离放射状胶质突起，并获得特定于所在皮层层的身份。影响神经元迁移不同阶段的基因发生突变，可能导致严重的皮层畸形，例如无脑回畸形或白质异位灶1,2。

在子宫内 电穿孔是一种快速而高效的技术，可用于转染啮齿类动物胚胎发育中大脑的神经前体细胞3,4利用该技术，可对目标基因进行敲低和/或过表达，以研究其在神经元发育过程中的功能。该方法特别有助于描述放射状迁移过程中的形态学细节，并表征其分子机制。5,6,7,8,9径向迁移的神经元在细胞形态、迁移速度以及迁移方向上均经历动态变化，这些变化需要对细胞进行长时间的直接连续观察。通过脑组织器官型切片培养结合电穿孔标记脑组织的活体共聚焦显微时间序列成像，可实现对迁移神经元的实时动态追踪。利用该联合技术，能够分析电穿孔脑组织固定切片中无法观察到的迁移神经元的多种特征。

我们近期应用延时共聚焦成像技术，对电穿孔脑组织切片培养中迁移的神经元进行观察，以研究转录因子B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤11a（Bcl11a）在皮层发育过程中的作用10。Bcl11a在年轻的迁移性皮层神经元中表达，我们利用一种条件性突变的Bcl11a等位基因（Bcl11aflox）11来研究其功能。将Cre重组酶与绿色荧光蛋白（GFP）共同电穿孔至Bcl11aflox/flox小鼠脑的皮层前体细胞中，可构建一种嵌合突变状态，即在整体为野生型背景下仅有少数细胞发生突变。通过这种方法，能够在单细胞水平上研究Bcl11a的细胞自主性功能。我们发现，Bcl11a突变神经元在迁移过程中表现出迁移速度降低、速度分布发生变化以及类似随机的取向改变10。在本方案中，我们描述了一套成功进行小鼠脑电穿孔及脑片培养12的操作流程，以及对皮层脑片培养进行延时共聚焦成像的方法。

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方案

所有实验程序均经动物福利委员会（Regierungspräsidium Tübingen）批准，并依照德国动物福利法和欧盟指令2010/63/EU执行。

1. 子宫内 电穿孔

  1. 显微注射针
    1. 使用配备方形灯丝（2.5 mm × 2.5 mm）的微电极拉制仪，将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.0 mm，内径：0.58 mm，长度：100 mm）拉制成显微注射针，程序参数设置为：HEAT：540，PULL：125，VELOCITY：20，DELAY：140。通过执行RAMP测试（HEAT值 = RAMP + 25）确定每根灯丝对应的HEAT值。
    2. 以38°角使用微磨针器对针尖进行斜面打磨，并保持中等到高速的转速，以获得针尖直径为20至30 µm的注射针，用于胚胎第13.5天（E13.5）或更早期的注射；若用于较晚期的胚胎阶段注射，则针尖直径应为30至40 µm。针尖使用后应插入装有模型黏土的盒子或培养皿中固定存放，以防止针尖受损。
  2. 质粒DNA溶液
    1. 准备含有荧光报告蛋白的质粒DNA构建体（例如 GFP）使用无内毒素大提纯试剂盒，按照制造商说明书进行制备。
    2. 将质粒DNA溶液用含有Fast Green（终浓度0.01%）的无内毒素Tris-EDTA缓冲液稀释至终浓度为1 - 2 µg/µL。分装后于-20 °C保存。
  3. 抑菌氯化钠溶液
    1. 通过将苯甲醇加入等渗0.9%氯化钠溶液中，使其终浓度为0.9%，制备抑菌氯化钠溶液。使用前立即进行无菌过滤。
  4. 卡洛芬注射液
    1. 将卡洛芬加入无菌等渗的0.9%氯化钠溶液中，配制成终浓度为0.5 mg/mL的卡洛芬注射液。 4 °C 下可保存长达 28 天。
  5. 麻醉、DNA注射与电穿孔
    1. 称取一只E14.5天的定时妊娠小鼠，将其放入连接麻醉蒸发器并充满5%异氟烷的透明麻醉室中。待动物失去意识后，转移至连接于37 °C加热板的麻醉面罩，并以1.8–2.2%异氟烷维持麻醉状态。
      注意： 通过尾部夹捏和足底反射（脚趾夹捏）消失来评估手术麻醉的诱导效果。
    2. 为镇痛，按每10 mg小鼠体重给予100 µL卡洛芬注射液（5 mg/kg体重）进行皮下注射。将小鼠背部朝下放置，并用凡士林小心覆盖眼睛，以防角膜干燥。
    3. 轻轻展开四肢，并用手术胶带将其固定在加热板上。使用纤维素棉签，先以70%乙醇、再以碘溶液（7.5 mg/mL）对腹部进行消毒。 重复此步骤三次，以确保充分消毒。
    4. 用无菌纱布覆盖腹部，纱布中央已剪出一个切口，留出直径为 2 - 2.5 cm 的区域用于腹部切口。用抑菌氯化钠溶液润湿纱布。
      注意：通过足底反射的消失来重新评估外科麻醉的进展。
    5. 使用微型有齿Adson镊（长度：12 cm）和精细剪刀（侧向倾斜，长度：9 cm），沿腹部中线纵向切开皮肤约1.5 cm。沿腹白线剪开下方肌肉层。
    6. 用环形镊子（长度：9 cm，外径：3 mm，内径：2.2 mm）取下一条子宫角，轻轻放置于湿润的纱布上。
      注意：使用环形镊夹持子宫角时，仅可夹在胚胎之间的部位，避免干扰胎盘或任何供血血管。始终用抑菌氯化钠溶液保持子宫湿润。
    7. 使用环形镊子小心固定胚胎，定位侧脑室，其表现为与矢状窦平行的新月形阴影。注射位点位于色素眼与窦汇之间连线的中点附近，此处矢状窦分叉为两条横窦。将显微注射针穿过子宫壁并插入侧脑室。
      注意：如有必要，可通过回撤针头来校正注射深度。
    8. 使用微量注射器通过脚踏开关控制，将1至2 µL DNA溶液注入侧脑室，参数设置为：25 psi，每次脉冲10至20 ms，共5至10次脉冲。可通过观察有颜色的DNA溶液是否充满脑室系统来判断注射是否成功。
    9. 将镊子型电极（E13.5及更早期胚胎使用直径3 mm，E14.5及更晚期胚胎使用直径5 mm）放置于胚胎头部，使“正极”位于与注射侧脑室同侧的位置，“负极”位于注射侧脑室对侧、耳下方的胚胎头部区域。
    10. 用几滴抑菌氯化钠溶液润湿电穿孔部位，随后施加5次电脉冲（E13.5及更早期为35 V，E14.5及更晚期为40 V），每次脉冲持续50 ms，间隔950 ms。
      注意：60 至 90 mA 的电流通常足以实现有效的电穿孔。电流过低将无法高效转染神经元，而电流过高可能导致胚胎死亡。
    11. 重复该操作（参见步骤 1.5.7 至 1.5.10）处理子宫角中的每一个胚胎，并轻柔地将其放回腹腔内。
    12. 取出另一侧的子宫角，并重复步骤1.5.7至1.5.11所述操作。
    13. 使用显微有齿镊、Mathieu持针器（碳化钨，长度：14 cm）和不可吸收外科缝线（3/8圆弧，13 mm，锥形针尖），先缝合肌肉层，再缝合皮肤，以关闭腹腔。
      注意：缝合时需小心，避免缝及子宫或其他器官。
    14. 用碘溶液（7.5 mg/mL）仔细消毒皮肤缝合处，并使用纤维素棉签轻轻清除眼周多余的凡士林。将小鼠置于红外灯下直至其苏醒。在接下来的两天内密切观察小鼠状态。在12至24小时后，按照步骤1.5.2所述重复镇痛处理。

2. 器官型脑片培养

  1. 层粘连蛋白储备液
    1. 将1 mg冻干层粘连蛋白溶于无菌水中，配制成1 mg/mL的层粘连蛋白储备液。分装为50 µL每份，于-80 °C保存。
  2. 聚-L-赖氨酸储备液
    1. 将50 mg聚-L-赖氨酸溶于无菌水中，配制成1 mg/mL的聚-L-赖氨酸储备液。分装为0.5 mL每份，于-20 °C保存。
  3. 完全汉克平衡盐溶液（完全HBSS）
    1. 通过混合以下组分配制500 mL完全HBSS：50 mL 10x HBSS溶液、1.25 mL 1 M HEPES缓冲液（pH 7.4）、15 mL 1 M D-葡萄糖溶液、5 mL 100 mM氯化钙溶液、5 mL 100 mM硫酸镁溶液、2 mL 1 M碳酸氢钠溶液，加无菌水至500 mL，经无菌过滤后，于4 °C保存。
  4. 脑片培养基
    1. 将35 mL基础培养基Eagle（BME）、12.9 mL完全HBSS（参见第2.3.1节）、1.35 mL 1 M D-葡萄糖、0.25 mL 200 mM L-谷氨酰胺和0.5 mL青霉素-链霉素混合，得到50 mL脑片培养基。经无菌过滤后，加入马血清至终浓度为5%。于4 °C保存，最多可保存4周。
  5. 低熔点（LMP）琼脂糖溶液
    1. 通过将1.5 g LMP琼脂糖溶于50 mL完全HBSS中，使用微波炉中等功率加热1至2分钟，配制3% LMP琼脂糖溶液。
      注意：加热过程中需密切监控，防止沸腾时溢出。
    2. 将溶液置于38 °C水浴中，待用。于4 °C保存，可重复使用一次。
  6. 膜插件的包被
    1. 将一份层粘连蛋白储备液（参见步骤2.1.1）和一份聚-L-赖氨酸储备液（参见步骤2.2.1）加入6 mL无菌水中，配制成包被液（足够用于6个插件）。
    2. 将膜插件放入6孔板中，每孔底部加入2 mL无菌水。在每个膜表面加入1 mL包被液（参见步骤2.6.1），于37 °C、5%二氧化碳环境中孵育过夜。
      注意：仅使用带有光学透明膜的插件，例如聚四氟乙烯（PTFE）膜。
    3. 用1 mL无菌水洗涤膜三次，干燥。包被后的膜应于当日使用，或置于洁净的6孔板中于4 °C保存，最多可保存四周。
  7. 脑组织解剖与包埋
    1. 电穿孔后两天，将小鼠放入连接麻醉蒸发器的透明密闭室中，通入5%异氟烷使其麻醉。动物失去意识后，将其从密闭室中取出，并通过颈椎脱位法处死。
    2. 取出含有胚胎的子宫，放入盛有冰浴完全HBSS的10 cm培养皿中。
      注意：此后所有溶液、胚胎和脑组织均需保持在冰上操作。
    3. 使用体视显微镜、精细尖头镊子（直头，11 cm）和一对Vannas Tübingen弹簧剪刀（向上倾斜，长度：9.5 cm）将每个胚胎从子宫中分离，并转移至另一盛有冰浴完全HBSS的培养皿中。
    4. 在脑干水平处做切口，沿矢状中线剪开。剥离覆盖脑部的皮肤和软骨。然后，在半球后方切断脑干，将脑组织从颅骨中取出。使用微型刮勺（185 mm × 5 mm）将脑组织转移至盛有冰浴完全HBSS的12孔板中。将同窝所有脑组织收集于同一12孔板中。
    5. 使用荧光体视显微镜在12孔板中筛选脑组织，评估其荧光强度及电穿孔区域大小。选择2至4个在预期体感皮层区域显示强荧光信号的脑组织用于后续处理。
    6. 将保持在38 °C的3% LMP琼脂糖溶液倒入一次性可剥离包埋模具中。用微型刮勺从12孔板中取出脑组织，并用精细滤纸小心吸去周围多余的完全HBSS。
    7. 将脑组织轻柔地放入琼脂糖溶液中，推至模具底部，并使用20号针头小心调整其位置。如需制备冠状切片，应使嗅球朝上。将模具置于冰上，待琼脂糖完全凝固后，继续进行切片。
  8. 振动切片机切片与脑片培养
    1. 将琼脂糖包埋块从模具中取出，置于无菌培养皿盖上。使用洁净的剃刀片修剪多余琼脂糖，使嗅球下方保留约2至3 mm，其余各侧保留约1 mm琼脂糖。使用 氰基丙烯酸酯胶将修剪后的琼脂糖块（嗅球朝下）固定于样品台。
      注意：切片前需用70%乙醇对器械和设备进行消毒。
    2. 将样品台转移至含有冰浴完全HBSS的振动切片机切片室中，使脑组织背侧朝向刀片。以0.9 mm的低至中等振幅、0.09–0.12 mm/s的极慢切片速度，切取厚度为250 µm、包含电穿孔区域的脑片。通常每个成功电穿孔的脑组织可获得4至6片强荧光信号的切片。
    3. 使用弯头微型刮勺和精细尖头镊子，小心地将脑片及其周围琼脂糖转移至盛有冰浴完全HBSS的6孔板中。
      警告：转移过程中仅用镊子接触切片周围的琼脂糖边缘，避免损伤脑组织。
    4. 按照步骤2.8.1至2.8.3所述方法处理所有选定的脑组织。
    5. 在将脑片放置于膜上之前，先用100 µL完全HBSS润湿膜插件，以利于脑片定位。每个膜插件上最多可放置5片脑片。
    6. 使用弯头微型刮勺和精细尖头镊子小心转移脑片。仅用镊子接触琼脂糖边缘，将切片轻柔地拉至刮勺上，再轻轻推至膜表面。使用镊子调整位置，并依次转移其余切片。用移液器吸去多余的完全HBSS。
      注意：脑片之间不得重叠。
    7. 借助镊子，小心将带有脑片的膜插件放入盛有1.8 mL脑片培养基（参见步骤2.4.1）的6孔板中，于37 °C、5%二氧化碳环境中孵育，直至进行延时成像。

3. 时间序列成像

  1. 显微镜设置
    1. 将倒置共聚焦显微镜载物台上的气候室设定为37 °C和5%二氧化碳环境。使用混合探测器以降低激光强度，提高细胞存活率。进行详细分析时，采用工作距离超长的40倍干镜，数值孔径为0.6或更高。
      注意：显微镜所有组件需在成像前预热至37 °C，持续2–3小时，以确保成像过程中焦点稳定。
  2. 脑片成像
    1. 使用倒置荧光显微镜，从含有膜插件的6孔板中选择用于成像的脑片。
      注意：避免长时间暴露于紫外光下，以免造成细胞光损伤。
      注意：选择上部室管膜下区（SVZ）中单个神经元明亮且正向脑片软脑膜表面径向迁移的脑片。贯穿整个皮质板（CP）的放射状胶质细胞细长荧光突起，表明放射状胶质支架结构完整，这是皮质神经元径向迁移所依赖的结构。
    2. 用镊子将选定用于延时成像的脑片及其膜插件转移至直径50 mm的玻璃底培养皿中，皿内含2 ml脑片培养基。将培养皿放入共聚焦显微镜的气候室内。
    3. 将图像分辨率设为512×512像素，并将扫描速度从400 Hz提高到700 Hz，使帧率分别从约1.4提升至约2.5帧/秒。平均扫描次数不超过两次。对电穿孔区域（通常为400–100 μm）设置z轴层扫，步长为1.5 μm。综合这些设置可在保证图像足够分辨率和亮度的同时，最大限度降低成像过程中的光损伤。开始延时成像，每30分钟采集一次z轴层扫图像。
      注意：脑片长时间暴露于激光将引起光损伤，降低细胞活力。应相应调整激光曝光时间。
    4. 使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）或同等软件分析延时成像序列。

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结果

此前，我们已证实基因敲除 Bcl11a 由 在子宫内 电穿孔损害晚期生成的上层投射神经元的径向迁移10含有DNA质粒载体的电穿孔 Cre-IRES-GFP 高效删除 Bcl11a 在条件性情况下 Bcl11aflox/flox 大脑11在电转后三天分析E14.5电转脑组织时，大多数对照组神经元已迁移至大脑皮层板（CP），而许多 Bcl11a 突变神经元在中间带（IZ）以及室管膜下区/室管膜区（VZ/SVZ）的迁移路径上停滞。此外，我们发现在IZ区域，多极细胞数量增加，而双极细胞数量相应减少 Bcl11a 缺失提示极化缺陷10.

为了直接且动态地分析 Bcl1...

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讨论

径向迁移是新皮层发育过程中的一个关键环节。影响该过程不同阶段的基因突变可导致严重的皮层畸形，包括无脑回畸形和白质异位1,2。我们近期研究发现，在年轻的迁移性皮层投射神经元中表达的Bcl11a在径向迁移过程中发挥重要作用。通过对外电穿孔脑组织的急性皮层切片进行活细胞共聚焦延时成像，我们直接证明了在迁移神经元中基因敲除Bcl11a会导致神经元极化障碍和迁移缺陷。利用延时图像序列追踪单个神经元的迁移路径，并计算迁移神经元的特定参数，包括速度变化曲线、平均迁移速度以及迁移方向10。

本方案描述了研究径向迁移中分子机制的重要方法。通过使用短发夹RNA或DNA表达质粒，可分别实现对几乎所有目的基因的敲低或过表达。将电穿孔技术与Cre-LoxP系统相结合是一种强大的策略。对条件性突变小鼠（conditional mutant）的脑组织进行转染，可实现特定基因在特定细胞类型或发育阶段的精确调控。"条件性等位基...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Jacqueline Andratschke、Elena Werle、Sachi Takenaka和Matthias Toberer提供的出色技术协助，同时感谢Victor Tarabykin的有益讨论。本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）对S.B.（BR-2215）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷Abbott Laboratories 506949Forene
6孔板Corning351146
12孔板Corning351143
不可吸收外科缝合线EthiconK890H3/8圆弧，13 mm，锥形针尖
显微有齿Adson镊Fine Science Tools11018-12带齿，长度：12 cm
精细剪刀Fine Science Tools14063-09侧向倾斜，长度：9 cm
Mathieu持针器Fine Science Tools12510-14碳化钨材质，长度：14 cm
细尖镊子Fine Science Tools11370-40直头，11 cm
Vannas Tübingen弹簧剪Fine Science Tools15005-08向上倾斜，9.5 cm
环形镊Fine Science Tools11103-09外径：3 mm，内径：2.2 mm，长度：9 cm
HBSS（10倍浓缩液）Gibco14180046
L-谷氨酰胺Gibco25030081
青霉素/链霉素Gibco15140122
马血清Gibco26050088
BMEGibco41010026
硼硅酸盐玻璃毛细管Harvard Apparatus30-0016外径1.0 × 内径0.58 × 长度100 mm
麻醉系统Harvard Apparaus72-6471
麻醉诱导室Harvard Apparaus34-0460
氟烷吸附过滤罐Harvard Apparaus34-0415
低熔点琼脂糖Invitrogen16520100
振动切片机LeicaVT1200 S
荧光体视显微镜LeicaM205 FA
体视显微镜LeicaM125
倒置荧光组织培养显微镜LeicaDM IL LED
共聚焦激光扫描显微镜LeicaTCS SP5II
混合探测器LeicaHyD
物镜，40倍/0.60 数值孔径Leica11506201
显微镜温控系统Life Imaging ServicesCube, Brick & Box
细胞培养小室MilliporePICM0RG50
微磨刀器NarishigeEG-45研磨斜面时使用38°角度
微量注射器Parker Hannifin 052-0500-900Picospritzer III
卡洛芬Pfizer Animal HealthNDC 61106-8507Rimadyl
包埋模具Polysciences18986-1
无内毒素质粒大提试剂盒Qiagen12362
快绿染料SigmaF7252
层粘连蛋白SigmaL2020
聚-L-赖氨酸SigmaP5899
HEPESSigmaH4034
D-葡萄糖SigmaG6152
氯化钙SigmaC7902
硫酸镁SigmaM2643
碳酸氢钠SigmaS6297
方波电穿孔仪SonidelCUY21EDIT
带5 mm铂盘电极的镊子SonidelCUY650P5
微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP-97
盒式灯丝Sutter InstrumentFB255B2.5 mm × 2.5 mm
微型药匙VWR231-0191185 mm × 5 mm
玻璃底培养皿，50 mmWorld Precision InstrumentsFD5040-100

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