本方案提供了直接观察径向迁移皮层神经元的操作指南。In utero 胚胎电穿孔、器官型脑片培养与活细胞共聚焦显微成像相结合，可对迁移神经元中目的基因的过表达或下调效应进行直接且动态的研究，并分析其在发育过程中的分化情况。
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本文内容
摘要
摘要
在子宫内 电穿孔是一种快速而强大的方法，用于研究发育中鼠胚大脑皮层内神经元径向迁移的过程。该方法有助于描述径向迁移的不同阶段，并表征调控该过程的分子机制。为了对迁移中的神经元进行直接且动态的时间追踪分析，必须对它们进行连续观察。本方案描述了一种结合了 在子宫内 通过器官型脑片培养结合电穿孔与延时共聚焦成像技术，可直接观察并动态分析放射状迁移的皮层神经元。此外，还可对迁移神经元进行详细表征，例如迁移速度、速度分布特征以及径向取向变化等。该方法易于调整，可用于在放射状迁移的皮层神经元中通过基因功能缺失、功能获得及功能挽救实验，对目的基因进行功能分析。迁移神经元的延时成像是一项前沿技术，一经建立，即可成为研究神经元迁移障碍小鼠模型中大脑皮层发育的有力工具。
引言
新皮层是认知、情绪以及感觉运动功能的主要区域。它由六个平行于脑表面的水平层组成。在发育过程中，背侧端脑侧壁的前体细胞产生投射神经元，这些神经元径向迁移至软脑膜表面，并获得特定于皮层层的神经元身份。这些神经元在脑室区/脑室下区（VZ/SVZ）生成后，会暂时呈现多极形态，并减缓迁移速度。在中间带（IZ）短暂停留后，它们转变为双极形态，附着于放射状胶质支架上，并继续沿径向迁移进入皮层板（CP）。当到达最终目标位置时，投射神经元脱离放射状胶质突起，并获得特定于所在皮层层的身份。影响神经元迁移不同阶段的基因发生突变，可能导致严重的皮层畸形，例如无脑回畸形或白质异位灶1,2。
在子宫内 电穿孔是一种快速而高效的技术，可用于转染啮齿类动物胚胎发育中大脑的神经前体细胞3,4利用该技术，可对目标基因进行敲低和/或过表达，以研究其在神经元发育过程中的功能。该方法特别有助于描述放射状迁移过程中的形态学细节，并表征其分子机制。5,6,7,
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方案
所有实验程序均经动物福利委员会（Regierungspräsidium Tübingen）批准，并依照德国动物福利法和欧盟指令2010/63/EU执行。
1. 子宫内 电穿孔
- 显微注射针
- 使用配备方形灯丝（2.5 mm × 2.5 mm）的微电极拉制仪，将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.0 mm，内径：0.58 mm，长度：100 mm）拉制成显微注射针，程序参数设置为：HEAT：540，PULL：125，VELOCITY：20，DELAY：140。通过执行RAMP测试（HEAT值 = RAMP + 25）确定每根灯丝对应的HEAT值。
- 以38°角使用微磨针器对针尖进行斜面打磨，并保持中等到高速的转速，以获得针尖直径为20至30 µm的注射针，用于胚胎第13.5天（E13.5）或更早期的注射；若用于较晚期的胚胎阶段注射，则针尖直径应为30至40 µm。针尖使用后应插入装有模型黏土的盒子或培养皿中固定存放，以防止针尖受损。
- 质粒DNA溶液
- 准备含有荧光报告蛋白的质粒DNA构建体（例如 GFP）使用无内毒素大提纯试剂盒，按照制造商说明书进行制备。
- 将质粒DNA溶液用含有Fast Green（终浓度0.01%）的无内毒素....
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结果
此前，我们已证实基因敲除 Bcl11a 由 在子宫内 电穿孔损害晚期出生的上层投射神经元的径向迁移10含有DNA质粒载体的电穿孔 Cre-IRES-GFP 高效删除 Bcl11a 在条件性情况下 Bcl11aflox/flox 大脑11在电转后三天分析E14.5电转脑组织时，大多数对照组神经元已迁移至大脑皮层板（CP），而许多 Bcl11a 突变神经元在中间带（IZ）以及室带/室下带（VZ/SVZ）的迁移路径上停滞。此外，我们发现在IZ区域，多极细胞数量增加，而双极细胞数量相应减少 Bcl11a 缺失提示极化缺陷10.
为了直接且动态地分析 Bcl11a
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讨论
径向迁移是新皮层发育过程中的一个关键环节。影响该过程不同阶段的基因突变可导致严重的皮层畸形，包括无脑回畸形和白质异位1,2。我们近期研究发现，在年轻的迁移性皮层投射神经元中表达的Bcl11a在径向迁移过程中发挥重要作用。通过对外电穿孔脑组织的急性皮层切片进行活细胞共聚焦延时成像，我们直接证明了在迁移神经元中基因敲除Bcl11a会导致神经元极化障碍和迁移缺陷。利用延时图像序列追踪单个神经元的迁移路径，并计算迁移神经元的特定参数，包括速度变化曲线、平均迁移速度以及迁移方向10。
本方案描述了研究径向迁移中分子机制的重要方法。通过使用短发夹RNA或DNA表达质粒，可分别实现对几乎所有目的基因的敲低或过表达。将电穿孔技术与Cre-LoxP系统相结合是一种强大的策略。对条件性突变小鼠（conditional mutant）的脑组织进行转染，可实现特定基因在特定细胞类型或发育阶段的精确调控。"条件性等位基.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Jacqueline Andratschke、Elena Werle、Sachi Takenaka和Matthias Toberer提供的出色技术协助，同时感谢Victor Tarabykin的有益讨论。本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）对S.B.（BR-2215）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷 | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6孔板 | Corning | 351146 | |
| 12孔板 | Corning | 351143 | |
| 不可吸收外科缝合线 | Ethicon | K890H | 3/8圆弧，13 mm，锥形针尖 |
| 显微有齿Adson镊 | Fine Science Tools | 11018-12 | 带齿，长度：12 cm |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14063-09 | 侧向倾斜，长度：9 cm |
| Mathieu持针器 | Fine Science Tools | 12510-14 | 碳化钨材质，长度：14 cm |
| 细尖镊子 | Fine Science Tools | 11370-40 | 直头，11 cm |
| Vannas Tübingen弹簧剪 | Fine Science Tools | 15005-08 | 向上倾斜，9.5 cm |
| 环形镊 | Fine Science Tools | 11103-09 | 外径：3 mm，内径：2.2 mm，长度：9 cm |
| HBSS（10倍浓缩液） | Gibco | 14180046 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 马血清 | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | 30-0016 | 外径1.0 × 内径0.58 × 长度100 mm |
| 麻醉系统 | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| 麻醉诱导室 | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| 氟烷吸附过滤罐 | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520100 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1200 S | |
| 荧光体视显微镜 | Leica | M205 FA | |
| 体视显微镜 | Leica | M125 | |
| 倒置荧光组织培养显微镜 | Leica | DM IL LED | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS SP5II | |
| 混合探测器 | Leica | HyD | |
| 物镜，40倍/0.60 数值孔径 | Leica | 11506201 | |
| 显微镜温控系统 | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| 细胞培养小室 | Millipore | PICM0RG50 | |
| 微磨刀器 | Narishige | EG-45 | 研磨斜面时使用38°角度 |
| 微量注射器 | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| 卡洛芬 | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| 包埋模具 | Polysciences | 18986-1 | |
| 无内毒素质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | |
| 快绿染料 | Sigma | F7252 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G6152 | |
| 氯化钙 | Sigma | C7902 | |
| 硫酸镁 | Sigma | M2643 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S6297 | |
| 方波电穿孔仪 | Sonidel | CUY21EDIT | |
| 带5 mm铂盘电极的镊子 | Sonidel | CUY650P5 | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| 盒式灯丝 | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm × 2.5 mm |
| 微型药匙 | VWR | 231-0191 | 185 mm × 5 mm |
| 玻璃底培养皿，50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
参考文献
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuron....
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重印与许可
