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高通量分析运动行为的 果蝇 岛屿实验

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DOI：

10.3791/55892

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2017年11月5日

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1Department of Human Genetics, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center, 2Centre for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 3Department of Neurology, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

孤岛实验是一种相对较新且成本效益较高的检测方法，可用于评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的基本运动行为。本文描述了用于自动处理数据和客观量化孤岛实验数据的算法，使该实验成为适用于大规模遗传学或药理学筛选的灵敏、高通量检测手段。

摘要

下一代测序技术的进步正以日益加快的速度推动着运动障碍及其他神经系统疾病（候选）致病基因的鉴定。然而，目前对这些疾病所涉及的分子机制仍知之甚少。遗传学、分子生物学和行为学研究工具箱的 黑腹果蝇 使该模式生物在高通量水平上鉴定新致病基因和疾病机制方面具有重要价值。然而，高通量筛选需要高效且可靠的检测方法，理想情况下应具备成本效益，并能够实现与这些疾病相关表型的自动化定量分析。岛屿实验是一种成本低、易于建立的方法，可用于评估 果蝇 运动行为。在该实验中，果蝇从固定高度被抛掷到一个平台上。这会引发果蝇的先天运动反应，使其在数秒内逃离平台。目前，对拍摄的岛屿实验进行定量分析主要依赖人工完成，这一过程费时费力，尤其在进行大规模筛选时尤为如此。

本文描述了 "果蝇 岛屿实验" 和 "岛屿实验分析" 算法用于 高通量、自动化的岛状结构实验数据处理与定量分析。在该系统中，一台简单的网络摄像头连接至笔记本电脑，在实验进行过程中持续采集平台的图像序列。 "果蝇 岛屿实验" 为开源软件 Fiji 开发的算法可处理这些图像序列，并针对每种实验条件，量化随时间变化停留在平台上的果蝇数量。 "岛屿实验分析" 一种与免费软件 R 兼容的脚本被开发用于自动处理所获得的数据，并计算不同处理/基因型之间是否存在统计学差异。这显著提高了岛式实验的效率，使其成为检测果蝇基本运动和飞行行为的有力指标。因此，该方法可应用于大规模筛选果蝇运动能力的研究。 果蝇 运动障碍模型及药物疗效评估

引言

近年来，下一代测序技术的进步极大地推动了对脑部变性运动障碍（例如，小脑性共济失调和帕金森病）、周围神经源性障碍（例如，肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫）以及肌肉源性障碍（例如，杜氏肌营养不良症和强直性肌营养不良症）相关致病基因的鉴定1,2,3,4。尽管如此，目前对这些疾病大多数背后的分子机制仍知之甚少。深入理解这些机制对于开发有效疗法至关重要。

与人类相似，模式生物的运动，例如飞行和移动， 果蝇由中枢脑、外周神经系统和肌肉控制。此外，其快速的世代周期和遗传工具箱 果蝇 使该模式生物特别适用于与运动障碍相关基因的高通量筛选以及药物测试5,6由于此类筛选需要测试大量条件，因此非常需要可靠、经济且相对简单的检测方法，以及能够以自动化方式量化输出结果的工具。

施密特 等 (2012)7 描述了一种名为低成本检测方法 "岛状实验" 用于评估 黑腹果蝇 运动行为。岛式实验已成功应用于大规模筛选，以鉴定具有胶质细胞特异性功能的基因7，在评估中 果蝇 智力障碍模型8以及对果蝇运动行为的总体评估9岛式行为检测的基本设计包括一个升高的平台，将数只果蝇投掷到该平台上。这会诱发一种本能的运动行为，使健康的果蝇在数秒内逃离平台。该检测通过测量随时间推移仍停留在平台上的果蝇数量来评估其运动能力。7,8,9所有这些特征表明，岛式实验可能是筛选与运动障碍相关基因的一种有力工具。

目前，拍摄的岛状细胞迁移实验数据的定量分析仍通过人工完成7,8,9为了提高实验的效率，开发了一种低成本方法，用于半自动量化果蝇从平台上的逃逸行为。该装置通过连接至笔记本电脑的普通网络摄像头采集平台的图像时间序列，每0.1秒获取一帧图像。随后，利用软件对图像帧进行处理， "果蝇 岛屿实验" 用于随时间量化平台上果蝇数量的宏。 "果蝇 岛屿实验" 宏被分为三个独立的子宏：（I） "创建图像堆栈与投影，" sub-macro 可识别存储在不同子文件夹中的各个岛屿实验，并为每个时间序列创建图像堆栈和投影。（II）该 "定义平台" 子宏将依次打开所有 "投影图像名称.tif" 位于各个实验子文件夹中的文件，此时要求用户手动将岛状平台定义为感兴趣区域（ROI）。(III) "分析" 自动量化在时间序列过程中停留在平台上的果蝇数量。子宏程序可连续运行（一次运行中）或独立运行。为进行统计数据分析，已开发一个脚本以自动处理所获得的数据，并应用统计检验来确定不同处理/基因型之间的行为是否存在显著差异。 彼此之间（图1最后，证明该装置可用于评估和量化一种异常运动能力 果蝇 共济失调-毛细血管扩张症（AT）模型。

方案

1. 岛屿实验箱的构建

  1. 准备一个由坚固材料（如聚甲基丙烯酸甲酯）制成的托盘 （聚甲基丙烯酸甲酯），以容纳一层水（即 水浴）。确保材料不是白色的。
    注意：尺寸为 40 x 35 x 2.5 cm3 建议使用（图1A).
  2. 准备一个盒子（42 × 38 × 25 cm）3）由坚固的透明材料（如PMMA）制成，用于环绕水浴装置，防止果蝇逃逸至实验室空间。在侧面开一个孔（20 × 30 cm2）位于侧面，空间足够大，便于实验人员操作装有果蝇的瓶子，并将果蝇投放到岛上（图1A).
  3. 制备一个 10 x 15 x 2.5 cm 的 elevated platform3 尺寸合适，由不透水材料（PMMA 或塑料）制成，且密封防水。
    注意：该平台必须具有均匀的白色表面，以确保图像分析时具有良好的对比度。平台尺寸并非必须固定，但应足够大，以确保所有果蝇最初均能落在平台上，并有机会在上面行走。图1A).
  4. 通过将平台粘合到水浴中，或在平台盒内放置重物或其他重物，以防止在实验/拍摄过程中平台位置发生变化。

2. 软件要求与安装

  1. 安装图像记录软件。
    1. 下载用于记录岛屿图像序列的图像记录软件（参见材料表），并将该软件安装在计算机上。
      注意：本实验方案中描述的图像记录软件仅支持 Windows 系统。其他操作系统的用户可参考材料表中提供的替代方案。
  2. "Drosophila Island Assay" 宏的安装。
    1. 从以下网站下载 "Drosophila Island Assay" 宏以及兼容的 Fiji10 版本（1.4 或更高版本）：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。
    2. 将光标移至 "Island assay" 目录，然后点击 "view"。
    3. 点击 "Download all"。文件夹内容将以 .zip 文件形式下载，请解压缩该文件。
    4. 将 "Drosophila Island Assay.ijm" 文件复制到 "Fiji.app/plugins/目录" 中。
      注意：启动 Fiji 时，"Drosophila Island Assay" 宏将出现在插件下拉菜单的底部。
  3. "Island Assay Analysis" 脚本的安装与下载。
    1. 从以下网站下载 R11：https://cran.rstudio.com，并将其安装在计算机上。
    2. 从以下网站下载 RStudio：https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/，并将其安装在计算机上。
      注意："Island test analysis" 脚本仅可在 R 环境中运行。RStudio 拥有更友好的用户界面，为不熟悉 R 的用户提供替代操作方式。
    3. 从以下网站的 "Drosophila Island Assay" 目录中下载 "Island Assay Analysis" 脚本：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。
      注意：完成步骤 2.2 后，也可在名为 "Island assay" 的解压文件夹中找到 "Island Assay Analysis" 脚本。

3. 岛屿实验中待测果蝇的准备

  1. 在低温或二氧化碳（CO₂）条件下收集各实验组不同发育阶段的果蝇2麻醉，如前所述13 （持续1至2天）。
    1. 每个实验条件下至少准备3个样品管，每管包含约15只已分类的果蝇。仅使用翅膀完整、且年龄和性别相近的果蝇。
      注意：本实验所描述的操作中，使用5个样品管，每管含有15只基因型为w的雄性果蝇-；肌动蛋白-Gal4/+（对照）和 w-；肌动蛋白-Gal4/GD11950（tefu RNAi）在羽化当天收集，饲养4天后用于进行孤岛实验。RNAi、对照品系及Actin-gal4驱动系均购自商业来源（见文末） 材料表).
  2. 让果蝇恢复，以避免麻醉剂的影响（使用CO₂时至少需要1天）2在收集果蝇并在目标年龄进行岛屿实验测试之前。

4. 实验设置

注意：参见图1B。

  1. 在浴盘中加入少量肥皂的冷水，并将平台置于中央。
    注意：肥皂可降低水的表面张力，接触水的果蝇会溺亡。这可防止在实验过程中有越来越多的果蝇飞入箱内。
  2. 将透明箱体放置在托盘上方，并使用灯从上方照射平台。
    注意：照明平台主要是为了确保视频具有适当的对比度。普通的12 V LED灯即可满足此需求。
  3. 将网络摄像头直接置于平台正上方（箱体外），并将其连接至计算机。
  4. 在实验开始前，在计算机上创建新文件夹以存储不同的实验数据。
    1. 按照图2A所示示例的结构创建文件夹。例如，若实验设计需要测试两种基因型，每种基因型设五个重复，则首先创建一个以实验日期命名的主文件夹；在主文件夹内创建两个子文件夹（每种基因型一个）；在每个基因型文件夹内再创建五个新的子文件夹，每个重复对应一个文件夹。
      注意：为了后续分析，必须将各个实验对应的图像序列保存在具有唯一名称的文件夹中。

5. 在界面的 "采集设备" 部分设置视频参数

  1. 打开图像采集软件，在 "采集" 选项卡下，点击 "时间序列图像…”，并选择适当的网络摄像头作为 "采集设备"。
  2. 将一只死亡的果蝇放置于小岛上；通过点击 "视频设置" 框来调整视频参数。滚动工具栏，调节亮度、对比度和颜色，使死亡的果蝇在白色背景上呈现为黑色（图2B）。完成调整后，点击 "确定"。

6. 在界面的 "延时摄影" 部分设置录制和视频保存参数

  1. 调整设置 "延时摄影设置" 将实验保存为 .avi 文件。单击 "浏览…," 选择视频将要存储的目录，定义视频名称，然后按下 "保存。"
    注意：视频文件不用于数据的定量分析；但可能有助于了解实验的整体情况。
  2. 调整设置 "延时摄影设置" 部分
    1. 在压缩框中，选择 "Intel IYUV 代码" 用于视频压缩并选择 "每0.1秒采集一帧图像，" 与 "回放速率（每秒图像数）：" 在10时。
    2. 通过点击将实验时间序列保存为 .bmp 帧 "高级……” 选择 "为每个捕获的帧创建一个 .bmp 图像。" 点击 "浏览。" 选择相同的目录 "视频录制过程中" 窗口（在步骤6.1中选择），单击 "开放，" 并按压 "好的。"
      注意：在实验过程中，帧将被保存为 .bmp 文件（数据分析所必需）。程序将帧命名为 "A" 随后是与帧捕获序列对应的编号（例如， "A_数字.bmp") (图2C）。务必将属于不同实验的图像保存在新的文件夹中，以确保之前记录的图像序列不会被覆盖。请注意，除非在设置中选择将图像保存至与视频文件相同的文件夹，否则图像不会自动保存在与视频文件相同的目录中。 "浏览……”点击后 "高级" 盒子

7. 岛屿实验与数据采集

  1. 按下图像记录软件延时成像界面中的开始按钮，以启动记录。
  2. 轻敲装有果蝇的实验小瓶（步骤3）2-3次，确保果蝇位于瓶底。迅速拔去瓶塞，并用力将小瓶在平台表面敲击一下，使所有果蝇同时落入平台（图1C）。
  3. 约30秒后，按下 "停止" 按钮以结束记录。
    注意：如果所有果蝇均已离开平台，可提前终止记录。
  4. 图像记录停止后，手动移除在平台上停留达30秒仍未能离开的果蝇。
  5. 在进行下一个实验记录之前，更改.bmp文件和视频的保存目标目录（参见第6节）。

8. 数据处理：运行 "Drosophila Island Assay" 宏程序

注意：见图1D。

  1. 运行 "创建图像堆栈与投影" 使用亚宏观成像模式 I 生成所采集图像序列的堆栈和投影。
    1. 启动 Fiji，点击 "插件" 在工具栏中，选择 "果蝇 岛屿实验" 在下拉菜单中；将出现一个新窗口。
    2. 输入 "首帧图像时间序列标识符" 宏观图形界面中的设置。
      注意：记录的图像帧将保存为 "A-number.bmp" 根据获取图像的顺序。在 "首帧标识符" 宏观界面，根据程序为第一帧分配的编号及文件扩展名填写设置。填写 "首帧标识符" 与 "-0001.bmp" 由于第一帧被调用 "A-0001.bmp" (图 2C）。如果网络摄像头软件生成其他图像格式（如 .tiff 或 .jpeg），请在第一个图像中指定正确的文件扩展名 "首张图像时间序列标识符"
    3. 仅选择 "创建图像堆栈与投影" 亚宏观，点击 "好的，" 并选择包含所有个体岛式实验子文件夹的主目录。
      注意：每个独立实验文件夹中包含的 .bmp 文件 "首帧标识符" 随后将进行处理。每个独立实验的子文件夹中将出现两个新文件，默认按以下名称命名 "Stack_image_name.tif" 和 "投影图像名称.tif" (图1D）。此步骤完成后，可删除 .bmp 文件。堆叠和投影的 .tif 文件包含所有数据，足以用于后续分析。
  2. 运行 "定义平台" 使用亚宏观 II 选择平台的精确位置。
    1. 打开图形界面 "果蝇 岛状体实验" 仅选择 "定义平台" 复选框，然后按下 "好的。"
    2. 在 "选择目录" 窗口中，选择存储实验子文件夹的主目录，然后按 "选择。"
      注意： "定义平台" 子宏会自动搜索 "投影图像名称.tif" 主目录中所有子文件夹内存储的文件。 "投影图像名称.tif" 存储在第一个文件夹中的图像，以及两个窗口——“定义平台”" 和 "“ROI 管理器”将打开。
    3. 选择 "多边形选择" 使用工具栏中的工具绘制一个与岛式站台相匹配的选择区域。
      注意：必须将平台的边缘区域排除在选择范围之外。参见 图2D.
    4. 选择第一个图像中的平台后，单击 "添加" 在 "ROI 管理器" 窗口；选定区域将以一组数值的形式出现在 ROI 管理器窗口中（图 2D）。按压 "好的" 在 "定义平台" 窗口。宏将进入下一个投影。
    5. 点击数字（图2D) 储存在 "ROI 管理器" 窗口；先前的选择将自动显示在当前图像投影中。
      注意：由于在连续实验中，只要网络摄像头和岛屿的位置保持不变，岛屿平台的大小和位置很可能相同，因此建议将定义该平台的感兴趣区域（ROI）保存在 "感兴趣区域管理器" 通过这种方式，用户可以节省时间；在后续的投影中，只需点击 ROI 管理器中临时存储的选区即可。
    6. 如果岛屿的位置相较于前一次实验略有移动，可通过在选区中心左键单击并拖动选区至所需位置来调整选区位置。
    7. 如果所选区域与平台不匹配，请在所选区域外单击鼠标左键，并使用以下方法重新勾画平台的选区 "多边形选择" 工具。通过点击将新选区存储到 ROI 管理器中 "添加；" 新的选择将出现在 "ROI 管理器" 可连续使用的窗口。
    8. 当选择调整完毕后，单击 "好的" 在 "定义该平台" 窗口并重复该步骤，直至所有平台均被定义。
      注意：请观察平台的二值图像，该图像在黑色背景上以白色显示已勾画的感兴趣区域（ROI），命名为 "Platform_image_name.tif" 在每个处理后的图像所在实验子文件夹中，与第8.1.3步生成的图像堆栈和投影图像位于同一位置出现图1D).
  3. 定义果蝇的最小尺寸。
    注意：此设置定义了果蝇的最小像素尺寸。为避免因噪声导致的假阳性，小于指定最小尺寸的颗粒将被排除在分析之外。
    1. 打开由以下方式创建的图像堆栈 "创建图像堆栈与投影" 亚宏观 I
    2. 单击“图像”>>“类型”>>“8位”，将图像堆栈转换为8位。
    3. 转到菜单，点击图像>>调整>>阈值，确保 "暗背景" 选中该框，然后按 "应用；" 一个名为 "阈值" 会出现。点击 "暗背景" 并按压 "好的。"
      注意：将生成一个二值图像堆栈，其中果蝇以黑色显示，平台以白色显示。如果情况并非如此，则应用 "倒置" 通过点击“编辑”>>“反选”>>“运行”来执行功能。
    4. 点击“分析”>>“设置比例”以设定检测像素数量的比例。应用以下设置：像素距离 = 1，已知距离 = 1，像素纵横比 = 1，长度单位 = pixel。按下 "好的。"
    5. 选择 "棒状物" （描记）工具，点击平台上的一只果蝇（黑色圆点）。按住 Ctrl+M（Windows 用户）或 Cmd+M（Mac 用户）；将弹出一个新窗口 "结果" 窗口将显示所选斑点区域的像素值。依次对多只果蝇进行此操作，并确定果蝇的最小尺寸。
      注意：运行宏时，设置 "最小果蝇尺寸" 设置为观察到的最小果蝇体型减去10%的余量。图2E).
  4. 运行 "分析" 使用亚宏观III来量化果蝇从平台逃逸的数量。
    1. 转到工具栏，选择 "插件" 并选择了 "果蝇 岛屿实验"
    2. 调节 "最小果蝇体型" 根据第8.3步中定义的值进行设置。
      注意：仅当标准设置“最小果蝇尺寸”" 原因 排除位于平台上的果蝇 该宏会将背景信号误检为果蝇。
    3. 在 "每管果蝇数量" 设置时，填写整个实验过程中各试管内果蝇的最大数量。例如，若某次实验的试管中分别含有15只、20只和23只果蝇，则 "每管果蝇数量" 必须标明为23。
    4. 选择 "分析" 复选框并按下 "好的；" 一种新的 "选择目录" 窗口将出现。选择主目录（包含其中所有子文件夹和文件），然后按 "选择。"
      注意：只要子文件夹中包含以下内容，该宏将分析其中存储的所有图像 "堆栈图像名称," "投射图像名称," 和 "平台图像名称" 文件。该宏将逐幅处理图像。宏的输出包括一个名为“result_stack_subfolder_name.tif”的二进制结果图像堆栈，以及一个名为 result 的文本文件 "result_subfolder_name.txt" 每个数据文件夹中出现的文件。 生成的文本文件（.txt）包含与图像堆栈对应的定量测量数据，共有9列。这些列的内容汇总如下 表1. "结果堆栈子文件夹名称.tif" 对应于一个实验的图像时间序列，其中在实验过程中检测到的果蝇以黑点形式呈现在白色背景上（图1E).
    5. 仔细检查结果堆栈，确保未出现任何伪影且宏准确执行图 2F).
      注意：伪影的示例包括并非果蝇但被图像分割算法误识别为果蝇的图像元素（假阳性）。这可能是由于背景信号被检测所致，例如因对感兴趣区域（ROI）的选择不准确而引起。

9. 使用"Island Assay Analysis"进行数据分析

  1. 按照图2A所示结构组织数据，以便使用"Island Assay Analysis"脚本进行分析。创建一个主目录，并在其下建立子文件夹，每个子文件夹对应一个待分析的实验条件。
  2. 在子文件夹中，建立包含独立实验重复组（图2A）以及由"Drosophila Island assay"宏生成的results.txt文件的文件夹。
    注： "Island Assay Analysis"宏将一次性处理主目录中所有实验条件。
  3. 启动R或R Studio。在工具栏中点击文件>>打开文件…，然后选择"Island Assay Analysis"脚本。
    1. 首次运行"Island Assay Analysis"脚本时，需安装ggplot2和matrixStats软件包。在控制台窗口中输入以下命令：
      > install.packages("ggplot2")，回车
      > install.packages("matrixStats")，回车。
  4. 在脚本中指定数据和分析输出文件的路径。在以下脚本行中插入：
    1. 第16行：插入包含待分析和比较实验的主目录路径（在图2A中，该路径指向"Island Assay"文件夹）。
    2. 第19行：插入分析输出文件存储文件夹的路径。
      注：第16行指定的目录只能包含待分析的文件夹。如果第16行和第19行中插入的路径相同，脚本将无法正常运行。
  5. 通过点击工具栏中的代码>>运行区域>>运行全部来执行脚本。
    注：请注意，在第19行定义的目录中会出现三个.csv文件和一个.txt文件（图1E）。这些文件分别是：(I) "data_all_conditions.csv"文件，其中包含对应于每个实验条件和实验重复组的处理后数据，其组织方式如表2所述。(II) "Statistics summary.csv"文件，汇总了每个实验条件下停留在平台上的果蝇百分比的均值、标准差（SD）和均值标准误（SEM）。(III) "AUC.csv"文件，包含每个实验重复组的曲线下面积（AUC）。(IV) 根据主文件夹中条件的数量，脚本将导出一个"Welch_t-test_results.txt"文件（2个条件）或一个"AUC_anova_results.txt"文件（多于2个条件），其中包含t检验或ANOVA分析结果，用于比较不同实验条件之间的曲线下面积。请注意，在第19行定义的路径中还会出现四种不同类型的.tiff图像文件（图1E），其名称分别为："Name_Of_Data_Folder.tiff"（其中Name_Of_Data_Folder代表用户指定的文件夹名称）、"AUC.tiff"、"Escape_response_all_conditions.tiff"和"AUC_anova.tiff"。有关这些图表内容的详细信息，请参见本文的代表性结果部分及图3。

结果

在本方案中，Drosophila 岛实验数据的获取与处理分为三个步骤。首先，将 Drosophila 投放到岛状平台后，使用网络摄像头记录其飞行逃避反应，并以单个 .bmp 图像文件形式存储（方案第 1–7 节）。其次，“Drosophila 岛实验”宏（第 8 步）处理这些图像帧，生成一个“result.txt”文本文件 (表 1)，其中汇总了每帧中检测到的物体数量，同时生成一个图像堆栈“Result_stack.tiff”，显示每帧中在平台区域内检测到的物体。第三，“岛实验分析”脚本（方案第 9 节）处理存储在各个实验“results.txt”文件中的宏输出数据。该脚本包含多个步骤，用于对数据进行筛选和整合，以进行统计分析。脚本会识别出果蝇被投放到平台上的第一帧，并将其定义为时间点 1；早于该帧的所有帧将从数据集中剔除。随后选取时间点 1 之后的 100 帧（对应 10 秒）用于分析。若检测到平台上初始果蝇数量少于 5 只，则该实验自动被排除，以剔除因样本量不足而导致结果不可靠的实验。若检测到的初始果蝇数量超过设定的“每管果蝇数量”加 3 只的容差范围，该实验也将被排除，以消除因将噪声颗粒误识别为果蝇而造成的误差。接着，脚本计算每个时间点检测到的果蝇数量占该序列中最大检测数量的百分比。对于因果蝇进出感兴趣区域（ROI）导致的数据错误（表现为平台上的果蝇百分比先下降后上升），脚本会将其修正为在早期阶段始终存在于平台上的状态。所有属于特定实验条件的重复数据集将在主目录中被合并，并导出至“data_all_conditions.csv”文件，其列对应 表 2 中描述的变量。脚本还将为每个实验条件生成一条折线图，图名根据包含数据的文件夹命名。该图显示相应文件夹中各实验重复组在时间进程中停留在平台上的果蝇百分比（即飞行逃避反应）(图 3A-B)。各实验条件的均值、标准差（SD）和标准误（SEM）将被计算并汇总至“Statistics summary.csv”文件中。一张名为“Escape_response_all_conditions.tiff”的折线图展示了主文件夹中最多 12 个实验条件的平均飞行逃避反应 (图 3C)。最后，计算主文件夹中所有实验条件的曲线下面积（AUC），并汇总至“AUC.csv”文件中。根据主文件夹中实验条件的数量，脚本将执行双尾非配对 Welch t 检验（2 个条件）或带 Tukey 多重检验校正的方差分析（ANOVA）（超过 2 个条件），以判断不同实验条件之间是否存在显著差异。这些结果分别汇总在“Welch_t-test_results.txt”或“AUC_anova_results.txt”文件中。执行方差分析时，脚本还会导出一个“AUC_anova.tiff”文件，展示被比较实验条件之间的平均 AUC 差异及其 95% 置信区间。所有实验条件下各实验重复组的绝对曲线下面积值将以单个数据点形式展示，并在“AUC.tiff”图中标出中位数 图 3D。

共济失调毛细血管扩张症（Ataxia Telangiectasia, AT）是一种常染色体隐性遗传运动障碍，由共济失调毛细血管扩张突变基因（Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM）突变引起，其特征为早发性小脑共济失调。ATM) 基因14. 突变体的 果蝇 同源基因 ATM, tefu，表现出运动能力和寿命的缺陷15. 为了评估 "果蝇 岛屿实验" 宏观，a 果蝇 AT 模型在岛状实验中进行了测试，将宏程序输出的数据与人工计数结果进行了比较。结果表明，广泛存在的 tefu 基因敲低（w-；肌动蛋白-Gal4/GD11950） 显著降低了这些果蝇离开平台的能力，与其遗传背景对照（w）相比-；肌动蛋白-Gal4/+) (图4). 1秒后，对照组果蝇有50%已逃离平台，而 <1% tefu-RNAi 果蝇。重要的是，利用宏程序获得的数据与手动计数获得的数据高度一致，表明该宏程序是一种可靠的工具，可用于岛屿实验数据的定量分析及运动缺陷的评估 (图4 A-B).

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图1：岛屿实验的需求、实验流程及分析流程图。（A）岛屿实验设备。（B）岛屿实验的实验装置。（C）岛屿实验。（D）使用“Drosophila Island Assay”宏处理岛屿实验数据。“Drosophila Island Assay”宏由3个子宏组成：1）生成图像栈与投影图，2）定义平台区域，3）分析。（E）使用“Island Assay Analysis”脚本进行数据处理与统计评估。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：实验流程中所需的不同调整示例。（A）岛屿实验数据处理与分析时必须采用的目录结构。（B）调整视频设置时，果蝇应在白色背景上呈现为黑色。（C）由本文所述图像记录软件保存的图像帧输出文件。（D）黄色轮廓显示了平台的选择区域，“ROI Manager”中已保存的平台选择区域以蓝色高亮显示。（E）在调整“最小果蝇尺寸设置”时，果蝇以白色圆点表示。结果窗口显示果蝇面积（单位：像素）。（F）单帧原始记录图像（左图）与使用“Drosophila Island Assay”宏处理后所得图像堆栈中的对应帧（右图）的示例。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：使用“Island Assay Analysis”脚本进行数据处理后获得的结果图像。（A）显示各对照组实验重复样本飞行逃避反应的折线图。（B）显示各tefu RNAi实验重复样本飞行逃避反应的折线图。（C）不同实验条件下平均飞行逃避反应；误差线表示标准误（SEM）。（D）点图表示对照组与突变组条件下曲线下面积的分布情况。tefu RNAi组和对照组的实验重复均以单个数据点（黑色）显示，中位数用红线表示。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：普遍性敲低tefu基因的果蝇表现出显著降低的离台能力。 数据表示对照组（w-; Actin-Gal4/+）和tefu RNAi组（w-; Actin-Gal4/GD11950）果蝇在平台上停留的比例随时间（秒）的变化情况（重复次数 = 5；误差棒表示标准误SEM）。(A) 使用“Drosophila Island Assay”宏获得的原始数据。(B) 使用“Drosophila Island Assay”宏生成的对照组与tefu RNAi条件下的曲线下面积分布点图（Welch非配对t检验，**p <0.01）。(C) 通过人工逐秒计数岛上果蝇数量获得的原始数据。(D) 通过手动计数获得的对照组与Tefu RNAi条件下的曲线下面积分布点图（Welch非配对t检验，**p <0.01）。误差棒表示标准误SEM。请点击此处查看该图的放大版本。

列名称描述
切片帧名称。
计数在平台（ROI）范围内检测到的对象数量。
总面积在平台（ROI）范围内检测到的对象的总面积（以像素为单位）。
平均大小在平台（ROI）范围内检测到的对象的总面积除以对象数量。
% 面积对象所占面积占平台（ROI）总面积的百分比。
周长在平台（ROI）范围内检测到的对象的总周长（以像素为单位）。
最小果蝇大小用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的最小果蝇大小（以像素为单位）。
ROI 面积在运行子宏“define platform”期间由用户定义的平台（ROI）面积（以像素为单位）。
果蝇数量用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的每次实验所使用的果蝇数量。

表1：由“Drosophila Island Assay”宏测量的参数。 本表中描述的参数将在运行“Drosophila Island Assay”宏后出现在“results.txt”文件中。

列名描述
Slice帧编号。
Count在平台（ROI）范围内，当前帧中检测到的果蝇数量。
X.Area在平台（ROI）范围内，当前帧中检测到的果蝇总面积（以像素为单位）。
Min. Fly Size用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的最小果蝇尺寸（以像素为单位）。
Area ROI用户运行子宏“define platform”时定义的平台区域（ROI，以像素为单位）。
Number of Flies用户在“Drosophila Island Assay”宏的图形界面中设定的每次实验所使用的果蝇数量。
X.Count相对于实验过程中在平台上检测到的最多果蝇数，当前切片/帧中位于平台上的果蝇所占百分比。
Timepoint时间点1表示被分析的第一帧，对应果蝇首次出现在平台上的帧。每份重复样本共分析100帧（在使用所述设置时，相当于10秒）。
Experiment每种条件下重复实验的次数。
Condition表示实验条件的名称（根据包含数据的文件夹的用户自定义名称确定）。

表2：使用“Island Assay Analysis”脚本处理数据后获得的变量说明。 本表中描述的参数在使用“Island Assay Analysis”脚本处理数据后，会出现在“data_all_conditions.csv”文件中。

讨论

本方案描述了 "果蝇 岛屿实验" 定量评估的宏 果蝇 岛屿实验中的运动行为。该宏程序可随时间自动准确计数平台上的果蝇，使岛屿实验具有高度敏感性，适用于运动缺陷的定量高通量评估。该方法可用于比较不同遗传和/或环境条件下培养的果蝇（包括药物暴露条件）的各种实验情况。因此，该检测方法在进行大规模遗传学或药物筛选研究时尤为有用。 果蝇 运动障碍及其他神经系统疾病的模型，或在研究运动或飞行行为时。

本文所介绍的孤岛实验方案相较于现有或替代方法具有多项优势。例如，视频追踪运动行为的方法耗时更长，且不适合大样本量的检测。孤岛实验是一种高通量筛选工具，从这一角度而言，其与快速互动负向趋地性（RING）实验具有可比性16。两者的区别在于，孤岛实验能够检测更广泛的运动功能障碍；果蝇无法离开平台的现象可能由飞行、跳跃或行走行为的缺陷引起，而这些缺陷可源于翅膀（肌肉/神经）和/或腿部（肌肉/神经）的功能异常。相比之下，RING实验仅用于评估由腿部（肌肉/神经）缺陷导致的攀爬或行走行为障碍。如果研究者希望获取多种行为表型读数，孤岛实验也可轻松与其他实验方法（如RING实验）联合使用。此外，用于光遗传学研究的激光装置可方便地安装在孤岛实验箱内，且该装置结构简单，易于转移至可精确控制温度与光照条件的实验环境中。

为确保本文所述岛屿实验的成功与可重复性，应遵循若干建议。至少在实验前一天，将果蝇分装并转移至实验用小瓶中，以避免CO₂麻醉对实验结果的影响。2 或低温麻醉。实验小瓶中不可放入过多果蝇（每瓶10–15只果蝇为宜；最好始终保证每瓶果蝇数量一致）。始终将果蝇饲养在新鲜培养基上。若尚未熟练掌握实验操作，可预先练习将果蝇抛掷到平台上的动作，以提高成功率。同时需练习在投掷后迅速将手移开，因为手部滞留会影响后续数据分析（图像分析和果蝇计数仅在手离开画面后才开始）。在需要相互比较的实验中，应保持环境条件和实验条件完全一致（例如， 对照组与突变体，或不同年龄测试的基因型）。实验应在每天的同一时间进行，并将试管置于温度和湿度受控的条件下。为保证统计功效，每个生物学重复至少进行三次技术重复。

为确保此处所述宏的顺利运行，必须调整网络摄像头和图像设置以实现最大对比度：果蝇在白色平台上呈现为黑色物体。当宏未能正确计数果蝇数量时，应调整对比度设置，检查感兴趣区域（ROI）是否正确选择，并确保平台上果蝇的大小超过指定的最小果蝇尺寸设置（参见本实验方案的第8.3步）。这些设置仅需定义一次，只要网络摄像头与平台之间的距离保持不变，即可适用于所有实验。Circularity_min 和 max 设置用于定义参与分析的颗粒（颗粒 = 被计数的果蝇）的圆形度（果蝇 = 被计数的对象）。1 代表完美的圆形，0 代表一条直线17。由于果蝇始终具有一定程度的圆形度（果蝇不可能呈现为一条直线），因此将 "Circularity_max" 设置为 1，"Circularity_min" 设置为 0.4。用户通常无需调整这些设置。

当果蝇位于平台边缘附近时，该宏偶尔会在计数时出现错误。如果果蝇无法飞行，而是在用户定义的感兴趣区域（ROI）内来回爬行，就可能发生这种情况。大多数情况下，重新选择ROI（尽可能将其与平台贴合）即可轻松解决此问题。然而， "岛屿实验分析" 该脚本能够较好地检测并校正果蝇进出感兴趣区域（ROI）所导致的不正确数据计数。尽管此处使用的网络摄像头分辨率已足够高，能较清晰地区分位置相近的果蝇，我们仍在图像处理流程中引入了额外的算法 "果蝇 岛屿实验" 宏，例如分水岭和侵蚀函数17这些有助于准确区分停留在平台上的、彼此靠近的果蝇。 此外，该宏程序无法区分果蝇是从平台跳下还是飞离平台。然而，通常观察到健康年轻的果蝇品系被放置在平台时会立即飞走，而年老的果蝇或具有运动缺陷的果蝇则会在平台上停留较长时间，最终跳跃或跌落离开平台。尽管存在这些局限性，该实验方法及分析仍能非常准确地测量果蝇的运动行为。

为确保实验顺利进行 "岛屿实验分析" 脚本中，用户必须确保在方案指定的脚本行中输入正确的输入和输出文件路径，并按照指定的文件夹格式提供数据（如方案中所示）。 图2）。如果用户认为用于过滤不可靠实验数据的标准过于严格（第68行：第一个值 "计数" 列小于或等于5；第71行：该行第一个值 "计数" 柱中的数值高于平台上投放的果蝇总数+3），则通过在第68行和第71行的文本前添加#号来关闭这些筛选设置 "岛屿实验分析" 脚本。在这种情况下，所有数据集都将被纳入分析。或者，可根据用户需求调整第68行和第71行中的数值来更改筛选设置。计数值中可能存在的异常信号 "results.txt" 由生成的 "黑腹果蝇 岛屿实验" 宏也可以手动调整，并且可以对调整后的数据重新运行脚本。当用户希望处理超过10 fps或超过10秒的数据时，所处理的帧数将由 "岛屿实验分析" 脚本应进行调整。统计分析也可由用户自定义的替代方法替换。

在以下网站可以找到一个名为 "Examples Island Assay," 的文件夹，其中包含使用岛屿实验（island assay）获得的图像时间序列示例：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1。请下载“Examples Island Assay”文件夹，并按照本方案中描述的步骤操作，以快速熟悉文件存储结构、使用“Drosophila Island assay”宏处理图像，以及运行“Island Assay Analysis”脚本的方法。

岛状实验结合所开发的宏程序与分析脚本，可用于评估并量化某种生物异常的运动行为 果蝇 共济失调-毛细血管扩张症模型。由于该检测方法可高效应用于不同年龄阶段，因此非常适用于分析表型可能存在的进行性发展特征。

总之，岛状培养实验与 "果蝇 岛屿实验" 宏观与微观 "岛屿实验分析" 脚本是一种经济、可靠且高效的检测方法，可客观分析和量化运动缺陷 果蝇 以高通量方式建立运动障碍模型。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢维也纳 黑腹果蝇 资源中心与布卢明顿 果蝇 NIH P40OD018537 资源中心提供 果蝇 菌株。我们感谢Klämbt实验室向我们介绍岛式实验，感谢Martijn Eidhof搭建岛式实验装置。本研究部分得到了E-RARE-3联合跨国资助项目的支持 "常染色体隐性共济失调的治疗准备" 由荷兰科学研究组织（NWO 9003037604）的PREPARE项目、荷兰科学研究组织（NWO）的TOP资助项目（912-12-109）以及两份DCN/拉德堡德大学医学中心博士奖学金资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定及稿件撰写过程中均未发挥作用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 x 95 mm 果蝇 小瓶Flystuff32-116SB-
罗技 C525 高清网络摄像头罗技-任何具有 USB 连接的网络摄像头均适用。
用于固定网络摄像头的支架---
台灯--12 V LED 灯合适
击打垫--任何鼠标垫均可使用
岛屿实验箱--尺寸 40x35x2.5 cm。孔洞 20x30 cm。透明。
岛式实验浴槽--尺寸 42x38x25 厘米。非白色。
岛屿/平台--尺寸 42x38x25 厘米。均匀白色。
肥皂--标准洗碗洗涤剂即可适用。
计算机--脚本可在 Windows 和 Mac 系统上运行
图像录制软件：HandiAvi®AZcendant®-HandyAvi 仅兼容 Windows 系统，本文中已对此软件进行了详细描述。可从以下网址下载：http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html（版本 5.0）
图像记录软件：WebcamCapture--可用于 Mac 系统以替代 HandyAvi 进行图像记录的 Fiji/ImageJ 插件，可从以下网址下载：https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/。使用该方法时，用户须采用本文所述的相同文件夹结构和图像记录设置，唯一例外是：对于每个实验重复，所捕获的图像堆栈应作为 Stack.tiff 导出至相应的实验重复文件夹中。运行 "果蝇 岛屿实验" 此数据的宏中，不应包含任何文本 "首帧标识符" 设置。
Fiji--版本 1.4 或更高版本，可从以下网址下载：https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio--可从以下网址下载：https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R--版本 3.3.2，可从以下网址下载：https://cran.rstudio.com

参考文献

  1. Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
  2. Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
  3. He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
  4. Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
  5. Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
  6. Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
  7. Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
  8. Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
  9. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
  10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  11. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
  12. RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
  14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159(2016).
  15. Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
  16. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
  17. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).

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