本研究描述了一种从不同哺乳动物物种的睾丸组织中获取纯化生殖细胞群体的方法的标准化流程。该方法是一种简便的实验方案，结合了睾丸组织的机械解离、Hoechst-33342和碘化丙啶染色以及荧光激活细胞分选（FACS），在雄性生殖生物学的比较研究中具有广泛的应用价值。
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方法文章
通过机械组织解离与流式细胞术对多种哺乳动物雄性生殖细胞进行标准化纯化的方法
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
荧光激活细胞分选（FACS）一直是分离富集哺乳动物睾丸生殖细胞群体的主要方法之一。目前，该方法能够以高得率和高纯度区分多达9种小鼠生殖细胞群体。这种高分辨率的区分与纯化之所以成为可能，是由于在精子发生过程中染色质结构和含量发生了独特的变化。这些变化模式可通过流式细胞术检测经荧光DNA结合染料（如Hoechst-33342，简称Hoechst）染色的雄性生殖细胞来捕捉。本文详细描述了一种近期开发的用于分离哺乳动物睾丸生殖细胞的实验方案。简而言之，首先通过机械解离从睾丸组织制备单细胞悬液，然后用Hoechst和碘化丙啶（PI）双重染色，并进行流式细胞术分析。在FACS分选过程中采用逐级设门策略，包括根据不同的DNA含量（Hoechst荧光强度）筛选活细胞（PI阴性），从而区分多达5种生殖细胞类型。这些细胞类型及其相应的平均纯度（通过显微镜评估确定）分别为：精原细胞（66%）、初级（71%）和次级（85%）精母细胞，以及精子细胞（90%），其中精子细胞进一步分为圆形（93%）和伸长型（87%）亚群。整个操作流程简单易行，使用适当的FACS仪器可在不到2小时内同时分离出4种细胞类型。由于缩短处理时间对于维持离体（ex vivo）细胞的生理状态至关重要，该方法特别适用于雄性生殖细胞生物学的下游高通量研究。此外，标准化的跨物种哺乳动物生殖细胞纯化方案可消除方法学上的变量来源，并允许在不同动物模型中使用同一套试剂。
引言
由于目前缺乏能够代表精子发生过程的体外（in vitro）系统，且睾丸组织中存在高度的细胞异质性，因此对雄性生殖细胞生物学的研究需要采用可靠的技术来分离富集特定类型的细胞群体。荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）已被广泛用于此目的1,2,3,4,5，因其具有高得率和高纯度，并且在可识别和分选的生殖细胞类型数量方面优于其他分离方法6,7,8。流式细胞术分析的基本原理是基于单个细胞经激光激发后产生的不同光信号模式的检测。当细胞通过激光束时，会向各个角度散射光线，其前向散射光（forward scatter, FSC）强度与细胞大小成正比，侧向散射光（side scatter, SSC）强度则与细胞内部复杂性成正比。有关流式细胞术的详细信息可参见 Ormerod9。
在精子发生的不同阶段，雄性生殖细胞的DNA含量、染色质结构、大小和形状会发生特定的改变。因此，可通过结合光散射特性和荧光染料对DNA的染色，识别并分离出不同的细胞群体10,11。目前已有多种染料可用于此目的（详见Geisinger和Rodriguez-Casuriaga的综述3），其中Hoechst-33342（Hoechst）在过去十年中被广泛用于睾丸细胞的流式细胞术分析1,2,4,10,12。Hoechst在紫外光激发下会发出蓝色荧光，其强度与细胞DNA含量成正比，而远红荧光则反映染色质结构和压缩程度的差异1,13,14。因此，在对Hoechst染色的单细胞悬液进行流式细胞分选（Ho-FACS）时，处于不同分化阶段的雄性生殖细胞会呈现出特定的分布模式（Ho-FACS；1,12）。有趣的是，由于精原细胞阶段存在一种特异性的染料外排机制，Hoechst的蓝色荧光强度在此类细胞中并不与染色质含量成正比，导致它们在Ho-FACS图谱中表现为侧群细胞15。此外，将Hoechst染色与非渗透性染料碘化丙啶（propidium iodide, PI）联合使用，可在流式分选过程中区分活细胞（PI阴性）与死细胞（PI阳性）1,2,10,12。该策略此前已被用于睾丸生殖细胞的流式细胞分析，并在小鼠中进行了广泛优化，可区分多达9种生殖细胞类型，包括减数分裂I期的4个不同阶段的细胞1,2,4,16。在本研究中，Hoechst染色具有三个主要优势。首先，Ho-FACS已成功应用于小鼠模型中雄性生殖细胞的分离1,2,12，以及其他啮齿类动物如大鼠和豚鼠17,18,19。其次，Hoechst是一种可穿透细胞膜的染料，无需进行膜通透处理，因而能够保持细胞完整性。最后，由于Hoechst优先结合于poly(d[AT]) DNA序列1,20，无需RNase处理，从而保留了RNA，使得除DNA和蛋白质外，RNA也可用于后续生殖细胞分化相关的分子生物学研究。
尽管在哺乳动物物种的流式细胞术分析中观察到DNA倍性和/或染色能力具有相似性（详见Geisinger和Rodriguez-Casuriaga3的综述），但不同研究中所描述的雄性生殖细胞流式细胞术分离方案仍存在较大差异。不同的研究采用了特定的组织解离方法，并在主要模式生物（如小鼠、大鼠和豚鼠）中使用了不同的DNA结合染料（单独或联合使用）以及不同的FACS设门策略。因此，由于方法学之间的差异可能带来未被识别的技术偏差，导致不同物种间的数据难以直接比较。重要的是，哺乳动物精子发生过程中染色质动态变化（2N-4N-2N-1N）具有显著的保守性，这提示一种标准化的实验方案可广泛适用于多种哺乳动物物种。
本研究旨在通过整合并改进已发表的技术2,20，建立一种适用于多种哺乳动物物种的统一实验流程。通过采用机械解离方法处理组织，避免了因物种差异而需对酶消化条件进行优化的问题，从而实现了组织处理方法的标准化5。值得注意的是，已有研究表明，啮齿类动物睾丸组织的机械解离效果优于酶消化法20，且两种方法获得的单细胞悬液在霍奇金-荧光激活细胞分选（Ho-FACS）分析中表现出可比的结果5。作为原理验证，本方案描述了用于分离最多五种生殖细胞群体的实验条件：精原细胞（SPG）；初级（SPC I）和次级精母细胞（SPC II）；以及精子细胞（SPD）——包括圆形（rSPD）和伸长型（eSPD）。重要的是，该方法易于在实验室中实施，主要所需设备为组织解离系统以及配备紫外激光器的细胞分选仪。该工作流程（图1）快速且简便，可在不到2小时内从新鲜睾丸组织中同时分离出4种生殖细胞群体。较短的处理时间对于维持细胞完整性以进行后续实验操作至关重要。此外，该方法已在5种不同物种中成功应用，表明其在哺乳动物类群中具有广泛的适用性，是开展哺乳动物雄性生殖生物学比较研究时分离生殖细胞的理想方法。
本方案除准备步骤外，主要包含三个部分：（1）睾丸组织的机械解离，（2）使用Hoechst和PI对睾丸细胞进行染色，随后（3）通过FACS分选相关生精细胞。收集后，这些富集的不同哺乳动物睾丸生殖细胞可用于多种应用。本方案描述了一种"通用型"解离方法，可用于从多种不同哺乳动物物种中纯化雄性生殖细胞。根据用户希望对分离的生殖细胞开展的研究类型，也可使用其他培养基或缓冲液。以下方案步骤适用于从一个完整的小鼠睾丸制备单细胞悬液。
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方案
以下所述所有操作均符合圣路易斯华盛顿大学动物研究委员会的规定。
1. 机械解离实验方案的准备工作
- 预湿一个50 µm的一次性组织解离 cartridge，用于解离整个小鼠睾丸。
注：该一次性组织解离cartridge含有专为切割组织设计的微刀片，以及一个带有约100个六边形孔的固定不锈钢滤网。可根据物种和目标细胞类型选择不同孔径的组织解离cartridge。本文中提及的所有哺乳动物物种均使用50 µm的cartridge。- 将1 mL冰浴的无酚红1×杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）加入50 µm一次性组织解离cartridge中。
注：酚红可能干扰流式细胞术（FACS）中红色荧光的检测。 - 使用一次性3 mL无针注射器从注射器接口处吸出组织解离cartridge中的1× DMEM。
- 将1 mL冰浴的无酚红1×杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）加入50 µm一次性组织解离cartridge中。
- 按下"ON"按钮启动组织解离系统。该系统无需"预热"时间。
- 用冰浴的1× DMEM预湿三个40 µm的一次性滤器。将每个40 µm一次性滤器置于50 mL锥形管上。加入1 mL 1× DMEM，使液体自然滤过。
- 准备一个100 mm × 15 mm的培养皿用于收集睾丸组织。向培养皿中加入500 µL 1× DMEM。
2. 睾丸组织机械解离方案的制备
- 使用手术剪和镊子解剖雄性小鼠，小心取出新鲜的完整睾丸或睾丸组织碎片（若处理其他哺乳动物物种）。
注意：确保组织无脂肪和坏死。相比冻存组织，新鲜睾丸组织可获得更高质量的单细胞悬液。- 将收集的睾丸/组织碎片转移至已准备好的 100 mm × 15 mm 培养皿中，内含 500 µL 的 1× DMEM。
- 用 1× DMEM 轻柔冲洗组织，以去除红细胞（如存在）。
- 小心去除白膜。不同物种的白膜厚度可能有所不同。
- 用镊子夹住睾丸的一端。
- 在上一步基础上，仍用镊子夹住睾丸一端的同时，用解剖刀刺穿睾丸的另一端。
- 在仍用镊子夹住睾丸一端的情况下（如步骤 2.2.1 所述），用解剖刀刮取睾丸曲细精管。
- 用解剖刀将睾丸曲细精管切成约 2–3 mm3 的小块。
3. 通过机械解离睾丸组织获得单细胞悬液
注意：以下解离步骤适用于一只成年小鼠的睾丸。幼年小鼠或非啮齿类物种的睾丸组织体积应相应调整。幼年动物可能不包含所有阶段的生殖细胞。某些哺乳动物物种在繁殖季节与非交配季节相比，睾丸组织组成会发生变化。
- 用镊子将小的睾丸曲管片段转移至预先润湿的50 µm组织解离柱中，并加入1 mL 1x DMEM。
- 将组织解离 cartridge 装载至组织解离系统，通过旋转旋钮启动并运行 5 min "待机状态" 到 "运行" 模式。
- 从组织解离系统中取出组织解离 cartridge，通过注射端口用一次性无针头3 mL注射器吸取细胞悬液。
- 用移液器反复抽吸数次，以去除组织解离柱中的全部液体。可能无法完全回收组织解离柱中的全部1 mL液体。
- 将吸出的细胞悬液通过两个预先润湿的一次性40 µm滤器过滤。重复过滤两次，以去除任何细胞团块。
- 将一个预先润湿的40 µm滤膜放入50 mL锥形管中。将注射器中吸取的细胞直接加至40 µm滤膜上。使用一次性移液器吸取滤过后的单细胞悬液。
- 移除已使用过的预湿40 µm滤膜，将另一张预湿的40 µm滤膜放入50 mL锥形管中。用移液器将收集的单细胞悬液转移至洁净的40 µm滤膜上。
- 用干净的一次性移液管收集过滤后的单细胞悬液。
- 将过滤后的细胞悬液用移液器重新转移至50 µm组织解离柱中，并在组织解离系统中继续处理5分钟。
- 从组织解离卡盒中回收全部液体。
4. 使用 Hoechst 和碘化丙啶（PI）染色
- 将从50 µm组织解离 cartridge 中回收的细胞悬液转移至一个洁净的1.5 mL离心管中。可回收约1-1.5 mL单细胞悬液。
- 将回收的单细胞悬液均分至四个1.5 mL或5 mL离心管中。
- 对于前三个离心管，每管加入150 µL单细胞悬液，剩余的单细胞悬液（约550 µL）全部加入第四个离心管。
注意：第四个离心管中单细胞悬液的体积可能因步骤3.6中细胞悬液回收效率的不同而有所变化。
- 对于前三个离心管，每管加入150 µL单细胞悬液，剩余的单细胞悬液（约550 µL）全部加入第四个离心管。
- 将四个离心管中的第一个设为FACS实验的未染色对照管。
- 制备单染染料（PI或Hoechst）细胞悬液作为对照。向每个离心管（第二和第三个）中分别加入2.5 µL Hoechst或1 µL PI。
- 制备双染管，用于收集生殖细胞亚群。向第四个离心管中加入2.5 µL Hoechst和1 µL PI。
注意：Hoechst的保存有效期为2-3个月。使用过期的染料储备液将导致FACS实验过程中出现显著异常。 - 室温避光孵育30分钟。将样品置于旋转混匀仪上，或每5-10分钟轻轻颠倒混匀1.5 mL离心管。
- 使用预先润湿的40 µm滤膜过滤细胞悬液，并将滤后溶液置于冰上避光保存，直至进行FACS检测。
注意：过滤步骤对于防止FACS过程中细胞结团至关重要。此外，可使用DNase（见图1）或2-萘酚-6,8-二磺酸二钾盐（NDA20）处理以减少细胞聚集。长时间等待会影响FACS检测中的荧光信号，并可能导致细胞死亡率升高。
5. 荧光激活细胞分选（FACS）设置与睾丸细胞纯化
- 准备 FACS 收集管
- 用400 µL FBS包被5 mL聚丙烯圆底管或1.5 mL离心管，用于细胞收集。包被后倒掉多余的FBS。
- 加入FACS收集培养基（1x DMEM + 10%） 胎牛血清 FBS）加入管中：5 mL 管加 1 mL，1.5 mL 管加 100 µL。
- 在细胞分选仪及其软件中设置适当的分选条件。
注意：其他细胞分选仪和分析软件也可采用与下述相似的设置和设门策略。此处所述条件改编自 Gaysinskaya 和 Bortvin。 2，Geisinger 和 Rodriguez-Casuriaga 3，和 Getun， 等4- 加载紫外激光，配备463/25 nm带通滤光片用于检测Hoechst蓝，680 nm长通带通滤光片用于检测Hoechst红和PI。
- 使用555DLP二向色镜区分蓝色和红色荧光。
- 使用70 µm喷嘴，以每秒1000-2000个细胞的速率分选细胞。
注意：分选效率直接受流速影响。较高的流速（>3500 事件/秒）可提高分选速度，但会导致群体污染。参见参考文献 12 如需进一步信息。
- 使用对照样品设置门控。
- 加载并运行未染色样品。
- 根据FSC与SSC图谱模式排除细胞碎片。细胞碎片将出现在图谱的左下象限。用户或细胞分选技术人员可自行设定细胞碎片的阈值。
- 通过调整FSC和脉宽的阈值对单细胞进行门控。不同的细胞分选仪区分单细胞的方法各异。由于脉宽反映细胞通过激光所需的时间，单细胞的脉宽值较多个细胞聚集的团块更低。在FSC与脉宽的散点图上调节阈值，可用于筛选单细胞。 关键词：单细胞门控，FSC，脉宽，阈值调节，细胞分选，单细胞筛选
- 设置最佳光电倍增管（PMT）电压。
- 使用未染色和单染细胞确定 PI 或 Hoechst 荧光信号的阈值。
注意：为了为每种染料建立适当的荧光范围，优化目标细胞的基线光电倍增管（PMT）电压至关重要。这对于实现最佳信号检测和灵敏度具有关键作用。未染色细胞及单染对照细胞可用于确定经PI和/或Hoechst染料染色的阴性与阳性细胞范围，并最大限度降低信号噪声。有关利用对照细胞优化PMT电压的进一步说明，请参见Gaysinskaya和Bortvin的研究。 2 - 根据PI染色（PI阴性）和FSC图对活细胞进行门控。死细胞将呈PI荧光阳性。
- 通过绘制基于Hoechst蓝色荧光的细胞计数直方图来设定DNA含量门控。应出现三个荧光强度递增的峰，分别代表单倍体（1C）、二倍体（2C）和四倍体（4C）细胞。设置三个门控，每个峰对应一个门控。
- 在对生殖细胞群体进行设门之前，需在FSC与SSC图上观察至少500,000个事件。
- 分选不同的生殖细胞群体。
- 加载经 Hoechst/PI 染色的样本。
- 设置所有群体共用的前3个父代门。
- 根据FSC与SSC图排除细胞碎片。根据FSC与脉宽图选中单细胞群体。通过圈选PI阴性细胞选取活细胞。
- 定义精原细胞门控。
- 根据Hoechst蓝色和红色荧光强度绘制PI阴性细胞。精原细胞表现为侧群（See 图1).
- 定义其余生殖细胞群体的门控。注：门控的详细图示参见图1和补充图2。
- 在DNA含量门控中绘制PI阴性细胞。
- 对于精子细胞，选择Hoechst荧光强度最低（1C）的峰作为门控范围。
- 对于次级精母细胞，选取 Hoechst 荧光强度中等（2C）的峰进行分选。
- 对于初级精母细胞，选取Hoechst荧光最强（4C）的峰进行圈选。
- 根据DNA含量门控结果，绘制Hoechst蓝光与红光荧光强度图，以进一步区分精母细胞和精子细胞群体。
- 将选定的亚群门控细胞收集到先前准备好的收集管中。每只睾丸平均需要45分钟至1.5小时，以收集约0.5–6.0 × 106 每个亚群的细胞。
注意：细胞长时间暴露于Hoechst可能导致不同细胞群的位置随时间发生轻微偏移。在流式细胞分选（FACS）进行20-30分钟后，需重新调整设置。各亚群的最大得率取决于解离步骤的效率。
6. 纯化细胞的显微镜评估
- 在 4 °C 条件下，以 500–600 × g 离心收集的细胞 10 分钟。
- 用 1 mL 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）或 1× DMEM 重悬细胞沉淀。
注意：可根据分选细胞的数量和所需的最终浓度，调整重悬体积。 - 将 40 µL 洗涤后的细胞滴加至洁净的玻璃载玻片上，并加盖盖玻片。
- 用 4% 多聚甲醛（PFA）固定剩余细胞，并将固定后的细胞置于 4 °C 避光保存，以备后续参考。
- 直接向收集管中加入 100 µL 4% PFA。
- 短暂涡旋混匀管内液体，或反复吹打数次，确保细胞悬液充分混合。
- 使用配备紫外光源的显微镜，在 63× 物镜下观察制备好的载玻片，检测 Hoechst 荧光。有关如何鉴定特定生殖细胞类型的更多细节，请参见结果部分——分选生殖细胞群体的形态学评估。
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结果
通过机械解离睾丸组织获得单细胞悬液
图2比较了在不同条件下通过机械解离小鼠睾丸组织获得的单细胞悬液。由新鲜组织制备的样本，未经染色（图2A）或经Hoechst染色（图2B），均显示出处于不同分化阶段的单个细胞，且重要的是，细胞结构似乎得以保留，包括精子的鞭毛。尽管在染色样本中观察到一定程度的细胞聚集和碎片，但解离后加入DNase可减少该现象（图2D），这些结果表明Hoechst染色并未显著影响单细胞悬液的质量。有趣的是，通过机械解离也可从冷冻组织中获得小鼠（图2C）以及其他哺乳动物物种（如大鼠、犬、豚鼠和小型猪）（补充图1）的单细...
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讨论
鉴于哺乳动物精子发生过程中染色质动态的高度保守性，本研究的目标是建立一种从不同哺乳动物睾丸组织中分离处于不同分化阶段的雄性生殖细胞的实验方案（图1）。将同一工作流程应用于不同动物模型时，主要障碍之一是需要针对不同物种进行特异性优化，尤其是在组织解离方案方面。目前的方法主要依赖酶消化法解离组织，且即使在同一物种内，不同实验方案之间也常存在差异12。为克服这一问题，本文所述方案展示了采用机械法解离组织，以从多种哺乳动物的睾丸样本中获得单细胞悬液。结果表明，使用该系统对新鲜睾丸组织进行机械解离效果良好（图2A-2B），与先前在啮齿类动物中的应用结果相似20。重要的是，Hoechst染色似乎并未显著影响单细胞悬液的质量。尽管在染色样本中可见较多细胞团块（图2B），但通过DNase（图2D
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披露
所有作者均声明无竞争利益。
致谢
作者感谢圣路易斯山边动物医院（密苏里州圣路易斯市）提供犬睾丸组织；感谢圣路易斯华盛顿大学（WashU）Jason Arand 和 Ted Cicero 博士实验室提供大鼠睾丸组织，并感谢 Brianne Tabers 协助样本采集；感谢 WashU 的 Jared Hartsock 及 Salt 博士实验室提供豚鼠睾丸组织；感谢 WashU 比较医学部的 Michael Talcott 博士提供小型猪睾丸组织。作者同时感谢位于密苏里州圣路易斯市的圣路易斯华盛顿大学医学院和巴恩斯-犹太医院的 Alvin J. Siteman 癌症中心，使用其 Siteman 流式细胞分析核心设施提供的由专业技术人员操作的细胞分选服务。Siteman 癌症中心的部分支持来自美国国家癌症研究所癌症中心支持基金 #P30 CA91842。
本研究由FCT博士奖学金[SFRH/BD/51695/2011，授予ACL]、美国国立卫生研究院资助项目[R01HD078641和R01MH101810，授予DFC]以及FCT研究合同[IF/01262/2014，授予AML]资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | VWR | #15710 | 4% PFA，用于固定分选后的细胞 |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | 用于睾丸组织解离的系统 |
| 1X 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Life Technologies | #31053 | DMEM，用于睾丸组织解离 |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | 用于睾丸组织解离的解离滤芯 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | #10082139 | FBS，用于流式细胞分选收集 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoechst，用于流式细胞分选染色 |
| 40 µm 细胞滤筛 | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | 用于睾丸组织解离 |
| 100x 15 mm 培养皿 | Falcon | #351029 | 用于睾丸组织解剖 |
| 5 mL 聚丙烯圆底管 | Falcon | #352063 | 用于流式细胞分选收集 |
| 1.5 mL Eppendorf 管 | VWR | #20170-650 | 用于流式细胞分选收集 |
| 3 mL 无针注射器 | BD Biosciences | #309657 | 用于睾丸组织解离 |
| 50 mL 锥形管 | MIDSCI | #C50R | 用于睾丸组织解离 |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | #L7011 | PI，用于流式细胞分选染色 |
| MoFlo Legacy 细胞分选仪 | Beckman Coulter | #ML99030 | 用于流式细胞分选 |
| Summit 细胞分选软件 | Beckman Coulter | #ML99030 | 用于流式细胞分选 |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS，用于显微镜观察 |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | #12-544-4 | 用于显微镜观察 |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | #12-548-87 | 用于显微镜观察 |
| 一次性移液管（3 mL） | Samco Scientific | #225 | 用于睾丸组织解离 |
| DNase I | Roche | #10104159001 | 用于睾丸组织解离 |
| 碳钢外科刀片 | Miltex | #4-111 | 用于睾丸组织解剖 |
| Countess 自动细胞计数仪 | Invitrogen | #C10227 | 用于自动细胞计数 |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma | #T8154 | 用于细胞活力染色 |
参考文献
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