本研究描述了一种从不同哺乳动物物种的睾丸组织中获取纯化生殖细胞群体的方法的标准化流程。该方法是一种简便的实验方案，结合了睾丸组织的机械解离、Hoechst-33342和碘化丙啶染色以及荧光激活细胞分选（FACS），在雄性生殖生物学的比较研究中具有广泛的应用价值。
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方法文章
通过机械组织解离与流式细胞术对多种哺乳动物雄性生殖细胞进行标准化纯化的方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
荧光激活细胞分选（FACS）一直是分离富集哺乳动物睾丸生殖细胞群体的主要方法之一。目前，该方法能够以高得率和高纯度区分多达9种小鼠生殖细胞群体。这种高分辨率的区分与纯化之所以成为可能，是由于在精子发生过程中染色质结构和含量发生了独特的变化。这些变化模式可通过流式细胞术检测经荧光DNA结合染料（如Hoechst-33342，简称Hoechst）染色的雄性生殖细胞来捕捉。本文详细描述了一种近期开发的用于分离哺乳动物睾丸生殖细胞的实验方案。简而言之，首先通过机械解离从睾丸组织制备单细胞悬液，然后用Hoechst和碘化丙啶（PI）双重染色，并进行流式细胞术分析。在FACS分选过程中采用逐级设门策略，包括根据不同的DNA含量（Hoechst荧光强度）筛选活细胞（PI阴性），从而区分多达5种生殖细胞类型。这些细胞类型及其相应的平均纯度（通过显微镜评估确定）分别为：精原细胞（66%）、初级（71%）和次级（85%）精母细胞，以及精子细胞（90%），其中精子细胞进一步分为圆形（93%）和伸长型（87%）亚群。整个操作流程简单易行，使用适当的FACS仪器可在不到2小时内同时分离出4种细胞类型。由于缩短处理时间对于维持离体（ex vivo）细胞的生理状态至关重要，该方法特别适用于雄性生殖细胞生物学的下游高通量研究。此外，标准化的跨物种哺乳动物生殖细胞纯化方案可消除方法学上的变量来源，并允许在不同动物模型中使用同一套试剂。
引言
由于目前缺乏能够代表精子发生过程的体外（in vitro）系统，且睾丸组织中存在高度的细胞异质性，因此对雄性生殖细胞生物学的研究需要采用可靠的技术来分离富集特定类型的细胞群体。荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）已被广泛用于此目的1,2,3,4,5，因其具有高得率和高纯度，并且在可识别和分选的生殖细胞类型数量方面优于其他分离方法6,7,8。流式细胞术分析的基本原理是基于单个细胞经激光激发后产生的不同光信号模式的检测。当细胞通过激光束时，会向各个角度散射光线，其前向散射光（forward scatter, FSC）强度与细胞大小成正比，侧向散射光（side scatter, SSC）强度则与细胞内部复杂性成正比。有关流式细胞术的详细信息可参见 Ormerod9。
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方案
以下所述所有操作均符合圣路易斯华盛顿大学动物研究委员会的规定。
1. 机械解离实验方案的准备工作
- 预湿一个50 µm的一次性组织解离 cartridge，用于解离整个小鼠睾丸。
注：该一次性组织解离cartridge含有专为切割组织设计的微刀片，以及一个带有约100个六边形孔的固定不锈钢滤网。可根据物种和目标细胞类型选择不同孔径的组织解离cartridge。本文中提及的所有哺乳动物物种均使用50 µm的cartridge。- 将1 mL冰浴的无酚红1×杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）加入50 µm一次性组织解离cartridge中。
注：酚红可能干扰流式细胞术（FACS）中红色荧光的检测。 - 使用一次性3 mL无针注射器从注射器接口处吸出组织解离cartridge中的1× DMEM。
- 将1 mL冰浴的无酚红1×杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）加入50 µm一次性组织解离cartridge中。
- 按下"ON"按钮启动组织解离系统。该系统无需"预热"时间。
- 用冰浴的1× DMEM预湿三个40 µm的一次性滤器。将每个40 µm一次性滤器置于50 mL锥形管上。加入1 mL 1× DMEM，使液体自然滤过。
- 准备一个100 mm × 15 mm的培养皿用于收集睾丸组织。向培养皿中加入500 µL 1× DMEM。
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结果
通过机械解离睾丸组织获得单细胞悬液
图2比较了在不同条件下通过机械解离小鼠睾丸组织获得的单细胞悬液。由新鲜组织制备的样品，未经染色（图2A）或经Hoechst染色（图2B），均显示出处于不同分化阶段的单个细胞，且重要的是，细胞结构似乎得以保留，包括精子的鞭毛。尽管在染色样品中观察到一定程度的细胞聚集和碎片，但解离后加入DNase可减少该现象（图2D），这些结果表明Hoechst染色对单细胞悬液的质量无明显影响。有趣的是，通过机械解离也可从冷冻组织中获得小鼠（图2C）以及其他哺乳动物物种（如大鼠、犬、豚鼠和小型猪）（补充图1）的单细.......
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讨论
鉴于哺乳动物精子发生过程中染色质动态的高度保守性，本研究的目标是建立一种从不同哺乳动物睾丸组织中分离处于不同分化阶段的雄性生殖细胞的实验方案（图1）。将同一工作流程应用于不同动物模型时，主要障碍之一是需要针对不同物种进行特异性优化，尤其是在组织解离方案方面。目前的方法主要依赖酶消化法解离组织，且即使在同一物种内，不同实验方案之间也常存在差异12。为克服这一问题，本文所述方案展示了采用机械法解离组织，以从多种哺乳动物的睾丸样本中获得单细胞悬液。结果表明，使用该系统对新鲜睾丸组织进行机械解离效果良好（图2A-2B），与先前在啮齿类动物中的应用结果相似20。重要的是，Hoechst染色似乎并未显著影响单细胞悬液的质量。尽管在染色样本中可见较多细胞团块（图2B），但通过DNase（图2D
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披露
所有作者均声明无竞争利益。
致谢
作者感谢圣路易斯山边动物医院（密苏里州圣路易斯市）提供犬睾丸组织；感谢圣路易斯华盛顿大学（WashU）Jason Arand 和 Ted Cicero 博士实验室提供大鼠睾丸组织，并感谢 Brianne Tabers 协助样本采集；感谢 WashU 的 Jared Hartsock 及 Salt 博士实验室提供豚鼠睾丸组织；感谢 WashU 比较医学部的 Michael Talcott 博士提供小型猪睾丸组织。作者同时感谢位于密苏里州圣路易斯市的圣路易斯华盛顿大学医学院和巴恩斯-犹太医院的 Alvin J. Siteman 癌症中心，使用其 Siteman 流式细胞分析核心设施提供的由专业技术人员操作的细胞分选服务。Siteman 癌症中心的部分支持来自美国国家癌症研究所癌症中心支持基金 #P30 CA91842。
本研究由FCT博士奖学金[SFRH/BD/51695/2011，授予ACL]、美国国立卫生研究院资助项目[R01HD078641和R01MH101810，授予DFC]以及FCT研究合同[IF/01262/2014，授予AML]资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | VWR | #15710 | 4% PFA，用于固定分选后的细胞 |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | 用于睾丸组织解离的系统 |
| 1X 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Life Technologies | #31053 | DMEM，用于睾丸组织解离 |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | 用于睾丸组织解离的解离滤芯 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | #10082139 | FBS，用于流式细胞分选收集 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoechst，用于流式细胞分选染色 |
| 40 µm 细胞滤筛 | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | 用于睾丸组织解离 |
| 100x 15 mm 培养皿 | Falcon | #351029 | 用于睾丸组织解剖 |
| 5 mL 聚丙烯圆底管 | Falcon | #352063 | 用于流式细胞分选收集 |
| 1.5 mL Eppendorf 管 | VWR | #20170-650 | 用于流式细胞分选收集 |
| 3 mL 无针注射器 | BD Biosciences | #309657 | 用于睾丸组织解离 |
| 50 mL 锥形管 | MIDSCI | #C50R | 用于睾丸组织解离 |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | #L7011 | PI，用于流式细胞分选染色 |
| MoFlo Legacy 细胞分选仪 | Beckman Coulter | #ML99030 | 用于流式细胞分选 |
| Summit 细胞分选软件 | Beckman Coulter | #ML99030 | 用于流式细胞分选 |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS，用于显微镜观察 |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | #12-544-4 | 用于显微镜观察 |
| 盖玻片 | Fisher Scientific | #12-548-87 | 用于显微镜观察 |
| 一次性移液管（3 mL） | Samco Scientific | #225 | 用于睾丸组织解离 |
| DNase I | Roche | #10104159001 | 用于睾丸组织解离 |
| 碳钢外科刀片 | Miltex | #4-111 | 用于睾丸组织解剖 |
| Countess 自动细胞计数仪 | Invitrogen | #C10227 | 用于自动细胞计数 |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma | #T8154 | 用于细胞活力染色 |
参考文献
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
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