方法文章

人原代成肌细胞的分离、成肌分化评估及牵张激活钙内流检测

DOI：

10.3791/55918

⸱

2017年7月26日

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们介绍一种从成人肌肉组织中获取纯化人成肌细胞群体的方法。这些细胞可用于研究 体外 骨骼肌分化，特别是研究参与钙离子（Ca）相关过程的蛋白质2+ 信号传导。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

卫星细胞（SC）是位于肌纤维质膜与周围基底膜之间的肌肉干细胞，对肌肉再生至关重要。当骨骼肌频繁发生损伤时，SC被激活，增殖形成成肌细胞，并进一步分化以修复肌肉损伤。在肌肉分化过程中发生的诸多事件中，胞质内Ca2+ 信号具有重要意义。这些Ca2+ 信号来源于Ca2+ 内质网钙释放2+ 储存，以及来自Ca2+ 来自细胞外空间的进入，特别是由储存库调控的 Ca2+ 进入（SOCE）。本文描述了一种从骨科手术后获取的肌肉样本中分离出纯度较高的人肌母细胞的方法。组织经过机械和酶消化处理后，细胞被扩增，并根据特定膜标志物的表达情况通过流式细胞术进行分选。获得的人肌母细胞随后进行扩增，并通过去除培养基中的生长因子诱导其向分化方向发展。特定转录因子的表达水平以及 体外 免疫荧光用于评估对照条件下以及沉默参与Ca相关蛋白后的成肌分化过程2+ 信号传导。最后，我们详细阐述了Fura-2作为比率型Ca2+ 提供可靠且可重复的SOCE测量结果的探针。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人类骨骼肌由成群的可收缩的多核肌纤维组成，这些肌纤维由成肌前体细胞融合形成。由于骨骼肌干细胞（SCs）的存在，骨骼肌在损伤后具有再生能力；这些干细胞位于肌纤维质膜（肌膜）与基底膜之间。在未受损的肌肉中，SCs 主要处于静息状态。当受到机械应力或损伤刺激时，SCs 被激活（成为成肌细胞），开始增殖，并进一步分化形成新的肌纤维，或通过自我更新来补充 SC 池1,2。多年来，已发展出多种技术用于从骨骼肌活检组织中分离 SCs 及其子代细胞——成肌细胞。随着对这些细胞表面标志物的深入认识以及荧光激活细胞分选技术（FACS）的发展3,4,5，目前已有可能从人类肌肉样本中分离出高纯度的成肌细胞群体。

钙信号调控骨骼肌的发育、稳态与再生。特别是，Ca2+ 在细胞内储存钙耗竭后被激活的通道，即储存操作性钙进入（SOCE），具有重要意义6 对于这些过程。细胞受到刺激后，Ca2+ 内质网/肌浆网（ER/SR）中的钙水平下降，进而激活质膜Ca2+ 允许 Ca 的通道2+ 进入以补充内质网/肌浆网7参与SOCE的两种主要蛋白是内质网/肌浆网Ca2+-感应型基质相互作用分子1（STIM1）蛋白和质膜Ca2+ 通道Orai1。骨骼肌大量表达这两种蛋白，以及同一家族的其他蛋白（STIM2和Orai2-Orai3）。8,9 以及几种Ca2+瞬时受体电位经典型（TRPC）家族的可通透通道10,11,12,13钙2+ 通过SOCE途径的离子内流对肌肉形成/再生具有重要意义14STIM1 或 Orai1 蛋白的突变对肌肉功能具有有害影响，主要导致肌张力低下15SOCE 功能受损的动物模型也表现出肌肉质量与力量下降，以及疲劳性增强6,16,17如前所述，骨骼肌中还表达其他STIM和Orai蛋白以及多种TRPC通道，但它们各自的功能迄今尚未明确。通过降低这些蛋白的表达水平，可进一步研究它们在SOCE中的作用及其在人类骨骼肌细胞分化过程中的功能。

SOCE 的测量可以通过两种不同的方法进行：电生理电流记录和 Ca2+ 检测。电生理学方法无疑更为直接，因为它能够测量目标电流及其相关的电生理特征。然而，该技术在肌细胞中的应用非常困难，主要原因是肌细胞体积较大，而内源性 SOCE 电流非常微弱。细胞质 Ca2+ 成像在技术上易于实现，但其测量结果更具间接性，因为细胞质中测得的 Ca2+ 水平同时反映了 Ca2+ 的内流以及通过泵出细胞或进入细胞内储存库所导致的再摄取过程。

本文介绍了一种方法，包括在酶消化后从小块人骨骼肌组织中分离成肌细胞，并进行扩增和荧光激活细胞分选（FACS）。文中描述了肌肉分化的过程，以及随时间追踪分化标志物表达的免疫荧光实验方案18。最后，阐述了钙库操纵性钙离子内流（SOCE）的测定方法，以及不同离子通道在钙离子（Ca2+）信号传导和骨骼肌分化中的作用。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

人体肌肉样本（取自半腱肌的组织）是在健康患者接受骨科手术期间作为手术废弃物收集的。所有涉及人体研究的方法均遵循瑞士卫生监管机构的指南和规定，并由瑞士日内瓦州当局的州伦理研究委员会批准（方案编号 CER n° 12-259）。所有参与研究的成年受试者均签署了知情且书面的同意书。

1. 从人骨骼肌中分离成肌细胞

  1. 所有操作过程中，均需在二级组织培养罩内进行，并使用无菌培养基和无菌缓冲液，以维持无菌条件。
    注意：本方法可适用于多种人体骨骼肌。

2. 解离方案

  1. 将肌肉样本（2 - 3 g）转移至无菌的6 cm培养皿中。
  2. 用5 - 10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗肌肉样本，重复清洗一次。
  3. 使用弯头剪刀和钳子去除结缔组织和脂肪组织。
  4. 称量肌肉样本（见步骤2.13），并将其转移至新的无菌6 cm培养皿中。
  5. 加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。
  6. 使用剪刀将肌肉组织剪切成小块（小于2 mm）。
  7. 用10 mL移液管将剪碎的肌肉组织转移至含有磁力搅拌子的200 mL解离瓶中。重复此步骤，直至所有剪碎的肌肉组织及共计90 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液均转移至解离瓶中。盖紧解离瓶，于37 °C温和振荡条件下孵育60分钟。
  8. 从水浴中取出解离瓶，加入10 mL胎牛血清（FCS；终浓度10%）以终止酶反应。用移液管混匀混合物。
  9. 准备两个50 mL离心管，每个管上放置一个70 µm细胞筛网。将细胞悬液的一半通过移液反复吹打滤膜，使其完全滤过筛网进入离心管中，另一管同法操作。
  10. 在200 × g、20 °C条件下离心5分钟；吸除并弃去上清液。
  11. 用10 mL生长培养基（GM；表1）重悬细胞，并将细胞悬液通过置于一个50 mL离心管上的40 µm细胞筛网过滤。在200 × g、20 °C条件下离心5分钟；吸除并弃去上清液。
  12. 用10 mL GM重悬细胞，在200 × g、20 °C条件下离心5分钟；吸除并弃去上清液。
  13. 用1 mL GM重悬细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：通常每克肌肉可获得约3 × 105个细胞。得率计算方法为将细胞总数除以肌肉活检样本的重量（见步骤2.4）。
  14. 将2 × 105个细胞接种于含4 mL GM的无菌6 cm培养皿中，置于37 °C、7% CO2条件下培养。根据需要制备相应数量的培养皿。
  15. 3天后更换生长培养基（GM）。
    注意：新解离的细胞需要一定时间才能贴附于培养皿表面。此外，初次成肌细胞的倍增时间约为50 - 60小时；首次分裂后，倍增时间约为20小时。
  16. 5 - 7天后，当细胞融合度达到70 - 80%（约每6 cm培养皿1.5 × 106个细胞）时，开始进行抗体染色和细胞分选（步骤3）。

3. 抗体染色与细胞分选

  1. 用 PBS 洗涤一次后，将贴壁细胞（在 6 cm 培养皿中）与 1 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 和 7% CO2 条件下孵育 3 分钟（或在 5% CO2 条件下孵育）。加入 2 mL 生长培养基（GM）终止反应，并将细胞收集至 15 mL 离心管中。离心（200 × g，5 分钟）后，用 1 mL 生长培养基（GM）重悬细胞。
  2. 使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）对细胞进行计数。
  3. 以下操作均在冰上进行。
    注意：在流式细胞仪上正确设置荧光补偿是关键步骤，在任何流式细胞仪上的操作原则应相似。试管 1 和 2 用作阴性对照。试管 3 至 7 用于首次实验时在流式细胞仪上设置补偿（表 2）。每种抗体及其相应同型对照的终浓度应保持一致（约为 1 µg/106 个细胞）。
  4. 将 1 × 105 个细胞分装至每管（5 mL 管），共分装试管 1 至 7（表 2）。将剩余的细胞悬液置于试管 8 中，用于细胞分选。
  5. 用 1 mL 冷 FACS 缓冲液（PBS-5% FCS）洗涤细胞。盖紧管盖，在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟；吸除并弃去上清液。
  6. 每管加入 200 µL FACS 缓冲液。根据 表 2 向各管中加入相应的抗体。冰上孵育 30 分钟。
  7. 洗涤细胞：向每管加入 1 mL FACS 缓冲液。盖紧管盖，在 200 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。吸除并弃去上清液。重复此步骤一次。
  8. 用 500 µL FACS 缓冲液重悬细胞。盖紧管盖，冰上保存直至进行细胞分选。准备 4 个 1.5 mL 离心管，每管加入 500 µL 生长培养基（GM），用于细胞分选过程中收集细胞。将这些管置于冰上保存。
  9. 通过流式细胞术分选人成肌细胞（图 1）。首先排除 CD45 阳性的造血细胞，然后根据 CD56 的表达情况分离 CD45 阴性细胞。接着，对 CD56 阳性细胞群进一步设门分析 CD34、CD144 和 CD146 的表达（人成肌细胞定义为 CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144- 的细胞）。重新分析少量分选后的细胞群，以检测分选纯度。
  10. 将含有分选后人成肌细胞的各管合并至一个 15 mL 离心管中，加入 5 mL 生长培养基（GM）洗涤一次。在 200 × g、20 °C 条件下离心 5 分钟；吸除并弃去上清液。
  11. 用 1 mL 生长培养基（GM）重悬细胞，并将细胞接种至一个未包被的 6 cm 培养皿中，培养皿内含 4 mL 生长培养基（每皿接种 2 × 105 个细胞）。在 37 °C 和 7% CO2 条件下孵育。

4. 细胞培养

  1. 每2天更换一半的培养基。从培养皿中移除2 mL旧的生长培养基（GM），并加入2 mL新的GM。
    注意：成肌细胞会分泌对培养条件有益的生长因子。
  2. 当细胞达到70–80%融合度时进行胰酶消化，以避免过早分化。用PBS冲洗一次后，将贴壁细胞（在6 cm培养皿中）与1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C和7% CO2条件下孵育3分钟。加入2 mL GM终止反应，并将细胞收集至15 mL离心管中。离心（200 × g，5分钟）后，用1 mL GM重悬细胞。
  3. 计数细胞，并在4 mL GM中将细胞以每皿2 × 105个接种至6 cm培养皿中。
  4. 人源成肌细胞可传代培养至多6代，或使用含10% DMSO的GM按每毫升1 × 106个细胞的密度冻存。使用程序降温盒（降温速率为1 °C/min）进行细胞冻存；长期保存时，将细胞置于液氮中。

5. 人成肌细胞的siRNA转染

注意：成肌细胞在诱导分化前两天使用商用转染试剂进行转染。针对特定基因的siRNA效应始终与对照siRNA的效应进行比较。siRNA为双链RNA，必须置于冰上保存，并佩戴手套操作。

  1. 在6 cm培养皿中获得70–80%汇合度的人类成肌细胞单层（约1.5 × 10⁶个细胞），6 细胞）
    注意：5 × 105 每次转染需要一定数量的细胞，以确保在生长培养基中培养2天后获得融合的转染成肌细胞单层。
  2. 准备玻璃盖玻片（具体步骤见第7步钙成像实验中的描述）。
  3. 将GMEM、0.05%胰蛋白酶-EDTA和PBS预热至37 °C。
  4. 在二级生物安全柜中进行以下所有步骤，以保持无菌状态。
  5. 在1.5 mL离心管中，加入500 µL低血清培养基、3 µL转染试剂和1 µL浓度为20 µM的siRNA。轻轻混匀，室温（RT）静置15–20分钟。
  6. 在此孵育期间，准备进行转染的成肌细胞。用PBS洗涤一次后，将贴壁细胞（置于6 cm培养皿中）与1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、7% CO₂条件下孵育2 孵育3分钟。加入2 mL GM终止反应，并将细胞收集至15 mL离心管中。在200 × g离心5分钟后，用1 mL GM重悬细胞。
  7. 使用血细胞计数板进行细胞计数。
  8. 重悬 5 × 105 每次转染使用200 µL GM培养基中的细胞（即， 用于两次转染，重悬于400 µL中）。
  9. 向每500 µL siRNA-转染试剂混合物中加入200 µL细胞悬液。用移液器轻轻吹打混匀2次，室温孵育5分钟。
  10. 将700 µL（细胞 + siRNA-转染试剂复合物）加入含有玻璃盖玻片的3.5 cm培养皿中。加入生长培养基（GM）至终体积为2 mL。
  11. 37 °C、7% CO₂条件下培养24小时后2，用2 mL新鲜的生长培养基完全更换培养基。再经过24小时后，通常可观察到转染细胞形成融合的单层；若如此，通过将生长培养基更换为2 mL分化培养基（DM； 表1).
  12. 在诱导分化后24–48小时或在增殖的成肌细胞上进行钙成像实验。
    注意：通常在诱导分化后48小时进行免疫荧光检测。

6. 分化标志物的免疫荧光染色

注意：免疫荧光染色在分化培养基中培养48小时后进行，但也可在其他分化时间点进行。Myogenin和MEF2是仅在已分化细胞（融合成肌管之前）中表达的核蛋白，其染色可用于评估分化过程。肌球蛋白重链（MyHC）仅在肌管中表达，可用于估算肌管大小和融合指数（肌管内核数/总核数）。

  1. 在分化培养基中培养 48 小时后，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下小心清洗已融合的分化细胞单层两次，注意避免剥离肌管。
  2. 用 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 15 分钟，随后用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
  3. 用含 0.25% Triton X-100 的 1 mL PBS 在室温下透化细胞 45 分钟，并用 1 mL PBS 洗涤三次。
  4. 在室温下用含 0.2% Tween-10 和 2% 山羊血清（封闭液）的 PBS 封闭非特异性结合位点，孵育 30 分钟。
  5. 将一抗用封闭液稀释（每 3.5 cm 培养皿加 600 µL）。
    注意：使用以下一抗：小鼠抗 Myogenin 抗体（1:600）、兔抗 MEF2 抗体（1:300）和小鼠抗 MyHC 抗体（MF20，1:1,000）。可将小鼠抗肌球蛋白重链抗体或小鼠抗 Myogenin 抗体与兔抗 MEF2 抗体共同加入同一封闭液中混合使用。
  6. 吸除封闭液，每 3.5 cm 培养皿加入 600 µL 一抗溶液，在 4 °C 湿润环境中过夜孵育。
  7. 用 1 mL PBS 洗涤细胞三次。在避光条件下，室温下用 600 µL 封闭液稀释的二抗溶液孵育 1 小时，二抗包括：山羊抗小鼠 Alexa 488（1:1,000）、山羊抗兔 Alexa 546（1:1,000）和 DAPI（1:50，储存液浓度为 15 µM）。
    注意：DAPI 为有毒化合物，操作时应佩戴手套。
  8. 吸除液体，并用 1 mL PBS 洗涤细胞三次。
  9. 使用含抗荧光淬灭剂的聚乙烯醇封片剂将玻璃盖玻片封片。样品于 4 °C 避光保存，直至进行细胞成像。

7. 钙成像

  1. 提前培养，准备直径为25 mm的玻璃盖玻片。将盖玻片置于70%乙醇中48 h，以去除表面油脂和污物，避免影响细胞在盖玻片上的贴附。
  2. 用水多次冲洗盖玻片后，将其放回水中并进行灭菌（高压灭菌）。
  3. 每个3.5 cm培养皿中放入一片盖玻片，使其干燥。将培养皿保存以备后续实验使用，或立即使用。
  4. 加入转染的成肌细胞（5 - 6 x 105 细胞）贴附到玻璃盖玻片上。
    注意：实验在诱导分化后24–48小时进行，或在增殖的成肌细胞上进行。
  5. 进行Ca2+ 成像前，用 PBS 或直接用实验所用培养基（含钙培养基）洗涤细胞 2 次； 表3)。在避光、室温条件下，用 2 µM Fura-2/AM 加 1 µM pluronic acid 孵育细胞约 30 分钟。
    注意：Pluronic 酸有助于增溶 Fura-2。Fura-2/AM 和 Pluronic 酸溶于含钙培养基中。
  6. 用不含 Fura-2/AM 和普洛尼克酸的相同培养基洗涤细胞两次，然后置于暗处静置 10 至 15 分钟，以使 Fura-2/AM 完成脱酯化反应。
  7. 如果Fura-2的负载效率过低，可添加更多Fura-2（例如， 4 µM）和/或延长细胞孵育时间（例如， 40 分钟。
  8. 从培养皿中取出盖玻片，安装到实验腔室中。加入约1 mL含钙培养基（根据实验腔室的体积调整）。将腔室置于显微镜载物台上，开始记录。
    注意：荧光 Ca2+-敏感探针 Fura-2 在 340 nm 和 380 nm 处交替激发，发射光在 510 nm 处收集。由于 Ca 的波动2+ 浓度变化相对较慢，每2秒获取1个比值。
  9. 为了激活SOCE，需采用以下经典的毒胡萝卜素（thapsigargin）/Ca2+ 重新添加方案如下：将细胞置于含钙培养基中孵育 2-3 分钟，随后更换为无钙培养基孵育 1-2 分钟。
    1. 加入1 µM 毒胡萝卜素以耗竭细胞内钙库。
      注意：Thapsigargin 是肌浆网/内质网 Ca²⁺-ATP 酶的不可逆抑制剂。2+ ATP酶（SERCA）泵活性。8–10分钟后，迅速将培养基更换为含钙培养基。Ca2+ 将通过SOCE通道进入细胞。实验终止前等待约5分钟。
      注意：毒胡萝卜素是一种有毒化合物，操作时应佩戴手套。

8. Ca2+ 测量分析

注意：使用采集软件进行分析。

  1. 打开实验。在无细胞区域（背景区域）绘制区域1，并在待分析细胞的细胞质中绘制其他区域（可在任意图像上绘制：340 nm、380 nm 或比值图像）。进入 "运行实验" > "参考图像"。在340和380通道下选择 "区域1"，然后点击 "减去背景"。
  2. 运行整个实验（F4：正向播放），确保没有干扰物进入背景区域，例如荧光灰尘斑点穿过背景区域，同时确保细胞在实验期间未发生移动。
    注意：所选感兴趣区域不应包含暗区；否则，比值结果将出现噪声，因为部分背景会被纳入测量范围。
  3. 点击 "记录数据"，再次播放整个实验。
    注意：这将打开一个电子表格，其中记录了时间和比值数据。也可保存单独的340 nm和380 nm波长数据。
  4. 为获取SOCE相关信息，从实验中提取两个关键参数：Ca2+重新添加后的响应幅度以及Ca2+内流阶段的斜率（图3）。
  5. 通过用Ca2+重新添加后Ca2+升高最大比值减去添加前的比值，计算响应幅度。通过拟合Ca2+重新添加后最初几秒的线性回归，获得最大斜率。
    注意：Thapsigargin反应曲线下的面积也是一个有价值的参数，可反映肌浆网（SR）中储存的游离钙总量。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在对人肌肉样本进行酶解离后，细胞在GM中扩增。通过FACS获得定义为CD56+/CD146+/CD45-/CD34-/CD144-的人肌母细胞。肌母细胞占分析细胞群体的60%以上。图1。将原代人成肌细胞重新接种，培养至融合后，在分化培养基（DM）中继续培养48小时。经免疫染色检测转录因子MEF2和骨骼肌特异性蛋白肌球蛋白重链（MyHC）的表达后，我们观察到大部分细胞形成了肌管 体外 （MyHC阳性细胞），融合指数值为60.9 ± 1.3%（n = 5； 图2）。我们还观察到，约40%的人成肌细胞（称为储备细胞）逃避了这种终末分化，保持为未分化的单核细胞。在功能研究中，我们分析了Ca2+ 成肌细胞或肌管在分化开始后48小时的反应。 图3 展示了用于诱导SOCE的代表性实验方案以及从此类记录中提取的关键参数。为了区分与SOCE相关分子的信息，细胞被转染了针对目标分子的siRNA。 图...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从成人骨骼肌中分离和培养人成肌细胞提供了一种 体外 用于研究肌肉分化和肌肉再生的模型。本文提供了一种简单且成本可控的方法，用于高效纯化大量人源成肌细胞。此外，该技术在成肌细胞分离率及其成肌分化效率方面具有良好的可靠性和可重复性。事实上，经细胞分选后，我们获得了约60%的人源成肌细胞。这些细胞在体外培养中可维持至6代（约30次倍增），并保持其分化能力。此外，当培养基由生长培养基（GM）更换为分化培养基（DM）后，成肌分化迅速发生；在DM中培养2至3天后，成肌细胞融合达到峰值。在此模型中，约60%的成肌细胞在DM中培养2天后融合形成肌管。另一优势在于，这些原代人源细胞易于转染siRNA。本实验室所用的GM和DM培养基均为自制；也可选用商品化培养基，但我们从未测试过其在人源原代细胞培养中的效率。

上述方法的一个缺点是在组织酶解过程中使用胰蛋白酶（trypsin）。该步骤会去除大量细胞表面标志物，因此需要将细胞培养数天后才能进行流式细胞分选（...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由瑞士国家科学基金会（资助号 310030-166313）、瑞士肌肉疾病研究基金会、“Marcel Levaillant 基金会”以及骨关节研究基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Ham’s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106批号 41G5532K
BSASigmaO5482
胎球蛋白SigmaF3385
EGFCorning354001
地塞米松SigmaD1756
胰岛素SigmaI9278
肌酸Sigma27900
丙酮酸SigmaP4562
尿苷SigmaU3003
庆大霉素ThermoFisher Scientific15710-049
0.05% 胰蛋白酶-EDTAThermoFisher Scientific25300-062
70 μm 细胞滤器Falcon352350
40 μm 细胞滤器Falcon352340
Falcon 50 mL 管Falcon352070
Falcon 15 mL 管Falcon352096
Falcon 5 mL 管（FACS）Falcon352058
培养基：OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
转染试剂：RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBSThermoFisher Scientific14190-094
封片剂Fluka10981
小鼠抗 MyHC *DSHBMF20 浓缩液
小鼠抗肌细胞生成素BD Pharmigen556358
兔抗 MEF2Santa Cruz BiotechC-21
羊抗小鼠 Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
羊抗兔 Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
小鼠抗人 CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
小鼠抗人 CD146-PECy7BD Pharmingen562135
小鼠抗人 CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
小鼠抗人 CD34-APCBD Pharmingen345804
小鼠抗人 CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 小鼠 IgG1kBD Pharmingen557702
PECy7 小鼠 IgG1kBD Pharmingen557872
PE-CF594 小鼠 IgG1kBD Pharmingen562292
APC 小鼠 IgG1kBD Pharmingen550854
PE 小鼠 IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542注意：  有毒化合物
多聚甲醛Fluka762400
Fura-2 AMThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
毒胡萝卜素SigmaT9033注意 ：有毒化合物 
比率成像采集软件：Metafluor 6.3Molecular Device
* ：MF 20 由 Fischman, D.A. 提交至 DSHB 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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