本文介绍了一种详细且高效的RNA原位杂交实验方案，特别适用于检测昆虫触角中低水平表达的气味受体（OR）基因及其他基因，所用探针为地高辛（DIG）标记或生物素标记的探针。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫已进化出复杂的嗅觉感受系统，用于感知外源性化学信号。这些化学信号由触角上毛发状结构——化学感受器中的嗅觉受体神经元（ORNs）转导。在ORNs的细胞膜上，气味受体（ORs）被认为参与了气味编码过程。因此，鉴定定位于ORNs中的基因对于识别OR基因至关重要，并为进一步功能研究提供基础。 原位 研究。特定基因的RNA表达水平 或昆虫触角中的表达量极低，且昆虫组织的组织学保存具有挑战性。因此，利用RNA难以将嗅觉受体定位于特定类型的感器 原位 杂交。在本文中，一种详细且高效的方法用于RNA 原位 一种特别针对昆虫低表达OR基因的杂交实验方案被引入。此外，一种特异的OR 通过双色荧光实验鉴定出该基因 原位 使用共表达受体基因的杂交实验 Orco，作为标记物。
引言
昆虫的触角是最主要的化学感受器官，其表面分布着许多毛发状结构——称为嗅觉感器（sensilla），这些感器由嗅觉感受神经元（Olfactory Receptor Neurons, ORNs）支配。在昆虫ORNs的细胞膜上，表达着一类含有七个跨膜结构域的蛋白质——气味受体（Odorant Receptors, ORs），它们与一种共受体（ORco）结合形成异源多聚体，发挥气味分子门控离子通道的功能1,2,3。不同的ORs可响应不同类型的化学化合物组合4,5,6。
蝗虫（Locusts）飞蝗主要依靠嗅觉线索来触发重要行为7蝗虫气味受体（ORs）是理解分子嗅觉机制的关键因素。通过RNA将特定的蝗虫OR基因定位到形态学上特定类型感器的神经元中 原位 杂交（RNA原位杂交）是探索嗅觉受体（ORs）功能的第一步。
RNA原位杂交（RNA ISH）利用标记的互补RNA探针，....
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方案
注意：为减少RNA降解，需使用经湿热灭菌（121 °C，60分钟）的蒸馏水配制溶液，并对相关材料进行湿热灭菌处理。
1. RNA 原位杂交反义与正义探针的制备
- 目的基因的扩增与纯化
- 首先，扩增出一段387 bp的双链片段 L. migratoria OR1 (LmigOR1，GenBank：JQ766965）从含有全长cDNA的质粒中 LmigOR1 与一个 Taq 在片段两端添加腺嘌呤的DNA聚合酶
- 使用 100 µL 最终反应体积，包含 50 µ2x反应混合液，4 L µL 每种正向与反向引物表1), 1 µ质粒模板L，以及41 µ无RNase水 L2O. 使用以下 PCR 程序：94 °C 5分钟，随后进行30个循环的94 °C，30 秒，55 °C，30 秒，72 °℃ 1分钟，随后72 °10分钟，C
- 重复这些步骤以获得1,303 bp的双链片段 LmigOR2 (GenBank: JQ766966) 和 1,251 bp 的双链片段 LmigORco （GenBank：JN....
- 首先，扩增出一段387 bp的双链片段 L. migratoria OR1 (LmigOR1，GenBank：JQ766965）从含有全长cDNA的质粒中 LmigOR1 与一个 Taq 在片段两端添加腺嘌呤的DNA聚合酶
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结果
通过显色检测，在每张成虫触角切片中，仅有少量触角细胞被DIG标记的LmigOR1和LmigOR2反义探针标记（图3）。对连续切片进行RNA原位杂交以定位LmigOR1和LmigOR2，结果显示表达这两个基因的触角细胞位于表达LmigORco的嗅觉神经元簇中，表明推测的LmigOR1和LmigOR2确实表达于嗅觉神经元（ORN）中（图4a-4d）。偶尔可观察到被标记的树突样结构（图4e-4f）。LmigOR1和LmigOR2均定位于刺形感器中的神经元（图5a-5b），但在单个感器中二者并不共表达，表明它们存在于不同类型的刺形感器亚型中（<.......
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讨论
由于除ORco以外的OR基因表达水平极低，且昆虫触角组织切片难以保存，因此对昆虫触角中的OR基因进行RNA原位杂交（RNA ISH）以定位其表达具有较大难度。此外，TSA检测也十分困难。为解决这些问题，应采取以下措施：选择刚蜕皮成虫期的蝗虫触角，其触角角质层较薄且柔软，可在载玻片上较好地保持形态结构；将冷冻样品切成12 µm厚的切片；使用高灵敏度和高特异性的生物素（biotin）和地高辛（DIG）标记探针；在多个步骤中使用Tween-20和Triton X-100等去污剂以降低背景信号；在TSA检测中，相对于低表达基因，高表达基因应使用biotin-16-UTP进行标记；载玻片应尽快观察，因为荧光信号会迅速淬灭。
DIG和生物素标记探针相较于放射性探针具有更长的保存期限、更高的信噪比以及更优的细胞分辨率18,19本文所述方案相较于整体装片法具有一些优势 原位 杂交。该方案可轻松确定基因在细胞水平上的定位，但难以用于研究基因分布模式.......
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披露
作者无任何披露内容或其他利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（编号：31472037）资助。 本文提及的商品名称或商业产品仅用于提供具体信息，不构成推荐。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, 中国 | TSE004 | |
| 无RNase的H2O | TIANGEN, 中国 | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, 西班牙 | 91622 | |
| 结合缓冲液 | TIANgel Midi 纯化试剂盒, TIANGEN, 中国 | DP209-02 | |
| 平衡缓冲液 | TIANgel Midi 纯化试剂盒, TIANGEN, 中国 | DP209-02 | |
| 洗涤液 | TIANgel Midi 纯化试剂盒, TIANGEN, 中国 | DP209-02 | |
| T载体 | Promega, 美国 | A362A | |
| T4 DNA连接酶 | Promega, 美国 | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, 中国 | CB101 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma, 美国 | A-6140 | |
| 异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 | Inalco, 美国 | 1758-1400 | |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷 | SBS Genetech, 中国 | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, 美国新英格兰 | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, 美国新英格兰 | R0133M | |
| DIG RNA标记试剂盒 | Roche, 瑞士 | 11175025910 | |
| 生物素RNA标记试剂盒 | Roche, 瑞士 | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA标记试剂盒, Roche, 瑞士 | 11175025910 | |
| LiCl | 国药集团, 中国 | 10012718 | |
| 乙醇 | 国药集团, 中国 | 10009257 | |
| 乙酸 | 北京化学试剂公司, 中国 | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, 荷兰 | 4583 | |
| 载玻片 | 天津金昊扬生物科技有限公司, 中国 | FISH0010 | |
| HCl | 国药集团, 中国 | 80070591 | |
| Millex | Millipore, 美国 | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, 美国 | 0777-500ML | |
| 硝基蓝四氮唑氯化物 / 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸-甲苯胺盐 | Roche, 瑞士 | 11175041910 | |
| 甘油 | 国药集团, 中国 | 10010618 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 溶液 | |||
| 1×Tris-乙酸-EDTA | Sigma, 美国 | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-碱 |
| 1×Tris-乙酸-EDTA | 北京化学试剂公司, 中国 | 10000292 | 0.12% 乙酸 |
| 1×Tris-乙酸-EDTA | Sigma, 美国 | 03677 | 乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA) |
| LB (Luria-Bertani) 液体培养基 | 国药集团, 中国 | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB (Luria-Bertani) 液体培养基 | MERCK, 德国 | VM335231 | 10 g/L 酪蛋白胨 (胰蛋白胨) |
| LB (Luria-Bertani) 液体培养基 | MERCK, 德国 | VM361526 | 5 g/L 酵母提取物 |
| LB固体培养基平板 | 国药集团, 中国 | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB固体培养基平板 | MERCK, 德国 | VM335231 | 10 g/L 酪蛋白胨 (胰蛋白胨) |
| LB固体培养基平板 | MERCK, 德国 | VM361526 | 5 g/L 酵母提取物 |
| LB固体培养基平板 | WISENT ING, 加拿大 | 800-010-CG | 15 g/L 细菌级琼脂 |
| 10×磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.1) | 国药集团, 中国 | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.1) | Sigma, 美国 | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.1) | Sigma, 美国 | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris缓冲盐溶液 (TBS, pH 7.5) | Sigma, 美国 | V900483-1KG | 1 M Tris-碱 |
| 10×Tris缓冲盐溶液 (TBS, pH 7.5) | 国药集团, 中国 | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| 检测缓冲液 (DAP) 显色检测 pH 9.5 TSA检测 pH 8.0 | Sigma, 美国 | V900483-1KG | 100 mM Tris-碱 |
| 检测缓冲液 (DAP) 显色检测 pH 9.5 TSA检测 pH 8.0 | 国药集团, 中国 | 10019392 | 100 mM NaCl |
| 检测缓冲液 (DAP) 显色检测 pH 9.5 TSA检测 pH 8.0 | Sigma, 美国 | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×柠檬酸钠-盐水 (pH 7.0) | 国药集团, 中国 | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×柠檬酸钠-盐水 (pH 7.0) | Sigma, 美国 | V900095-500G | 0.3 M 柠檬酸钠 |
| 4% 多聚甲醛溶液 (PFA, pH 9.5) | Sigma, 美国 | V900894-100G | 4% 多聚甲醛 |
| 碳酸钠缓冲液 | Sigma, 美国 | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| 碳酸钠缓冲液 (pH 10.2) | Sigma, 美国 | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| 碳酸钠缓冲液 (pH 10.2) | Sigma, 美国 | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| 甲酰胺溶液 (pH 10.2) | MPBIO, 美国 | FORMD002 | 50% 去离子甲酰胺 |
| 甲酰胺溶液 (pH 10.2) | 5×柠檬酸钠-盐水 | ||
| TBS中的封闭缓冲液 | Roche, 瑞士 | 11175041910 | 1% Blot |
| TBS中的封闭缓冲液 | AMRESCO, 美国 | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| TBS中的封闭缓冲液 | 1×Tris缓冲盐溶液 | ||
| 碱性磷酸酶溶液 | Roche, 瑞士 | 11175041910 | 1.5 U/mL 抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体 |
| 碱性磷酸酶溶液 | TBS中的封闭缓冲液 | ||
| 碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶溶液 | Roche, 瑞士 | 11175041910 | 1.5 U/mL 抗地高辛碱性磷酸酶偶联抗体 |
| 碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶溶液 | TSA试剂盒, Perkin Elmer, 美国 | NEL701A001KT | 1% 抗生物素链霉亲和素辣根过氧化物酶偶联抗体 |
| 碱性磷酸酶/辣根过氧化物酶溶液 | TBS中的封闭缓冲液 | ||
| 杂交缓冲液 | MPBIO, 美国 | FORMD002 | 50% 去离子甲酰胺 |
| 杂交缓冲液 | 2×柠檬酸钠-盐水 | ||
| 杂交缓冲液 | Sigma, 美国 | D8906-50G | 10% 硫酸葡聚糖 |
| 杂交缓冲液 | invitrogen, 美国 | AM7119 | 20 µg/mL 酵母t-RNA |
| 杂交缓冲液 | Sigma, 美国 | D3159-10G | 0.2 mg/mL 沙丁鱼精子DNA |
| 2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐/4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物底物 | Roche, 瑞士 | 11758888001 | 1% 2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐 (10 mg/mL) |
| 2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐/4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物底物 | Roche, 瑞士 | 11758888001 | 1% 4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物 (25 mg/mL) |
| 2-羟基-3-萘甲酸-2'-苯基苯胺磷酸盐/4-氯-2-甲基苯基重氮半锌氯化物底物 | 检测缓冲液 | ||
| 酪胺信号放大底物 | TSA试剂盒, Perkin Elmer, 美国 | NEL701A001KT | 2% 荧光素-酪胺 |
| 酪胺信号放大底物 | TSA试剂盒, Perkin Elmer, 美国 | NEL701A001KT | 扩增稀释液 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 仪器 | |||
| 冷冻切片机 | Leica, Nussloch, 德国 | Jung CM300 冷冻切片机 | |
| 分光光度计 | Thermo SCIENTIFIC, 美国 | NANODROP 2000 | |
| 光学显微镜 | Olympus, 东京, 日本 | Olympus IX71显微镜 | |
| 共聚焦显微镜 | Olympus, 东京, 日本 | Olympus BX45共聚焦显微镜 |
参考文献
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven trans....
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