传统的凝胶电泳（SGE）实验需要复杂的设备且化学试剂消耗量大。本研究介绍了一种低成本、可在短时间内分离DNA片段的方法。
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摘要
摘要
平板凝胶电泳（SGE）是分离DNA片段最常用的方法，因此被广泛应用于生物学及其他领域。然而，传统的SGE实验步骤繁琐，耗时较长，且化学试剂消耗量大。本研究提出一种基于SGE芯片的DNA片段分离简易方法。该芯片由雕刻机制备，使用两张塑料片分别用于光学信号的激发和发射波长。DNA条带的荧光信号由智能手机采集。为验证该方法的有效性，对50、100和1,000 bp的DNA标准品进行了分离。结果表明，采用该方法可在12分钟内实现5,000 bp以下DNA标准品的高分辨率分离，说明该方法是传统SGE技术的理想替代方案。
引言
平板凝胶电泳（SGE）是分离DNA片段最有效的方法1,2,3,4,5 因此，它被认为是生物化学和生物学分析中的一种多功能工具6,7,8然而，许多实验表明，SGE 受限于以下四个问题：（1）分离过程耗时数小时甚至数天；（2）化学试剂消耗量很大；（3）需要复杂的装置例如， 二维电泳槽、电泳电源和凝胶成像系统）；（4）凝胶成像系统仅能在实验结束后观察分离的DNA片段。此外，SGE中常用的溴化乙锭（EtBr）9,10具有致突变性和致癌性11,12因此，操作含有溴化乙锭（EtBr）的凝胶时应始终佩戴手套。
与传统凝胶电泳（SGE）相比，毛细管电泳（CE）具有多种优势13,14,15,16,17，例如可实现自动化操作、分离时间短、试剂消耗量低。然而，CE仪器价格昂贵。因此，为克服这些局限性，已开发出一种用于DNA分离的系统（图1）。该系统不仅可显著减少化学试剂的消耗，并缩短SGE实验时间（<8 分钟），还能通过智能手机实时追踪琼脂糖凝胶中DNA的分离过程。通过遵循本实验方案所述的操作步骤，学生应能够设计并制备SGE芯片，在芯片中制备琼脂糖凝胶，搭建一个包含智能手机的简易SGE系统，并记录DNA在琼脂糖凝胶中的迁移过程。
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方案
1. SGE芯片的基本设计
- 使用任何透明塑料，例如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）或聚碳酸酯。
注意：SGE芯片在图1B中展示。SGE芯片包含用于TBE缓冲液的圆柱形孔、用于DNA分离的通道，以及沿孔道嵌入的两条用于电极的通道。 - 使用激光雕刻机在PMMA块中加工SGE通道阵列。
注意：芯片的几何参数取决于待分离DNA的大小。例如，当DNA片段小于1,000 bp时，SGE芯片的最佳通道参数为2.5 mm × 4.0 mm × 90 mm（宽 × 深 × 长）。 - 根据SGE设计，加工梳状结构以在芯片中形成加样孔，用于加载DNA样品。
2. 琼脂糖凝胶的制备
- 通过将10×TBE（1×TBE = 89 mM Tris、89 mM 硼酸和 2 mM EDTA；pH 8.4）与蒸馏水按1:19的比例混合，配制0.5×TBE溶液。
- 制备1.0%琼脂糖凝胶，用于分离100 bp DNA Ladder。
注意：在0.5×TBE缓冲液中琼脂糖的浓度取决于待分离DNA片段的大小。 - 将0.1 g琼脂糖放入烧瓶中，并加入10 mL 0.5×TBE缓冲液。
注意：所配制溶液的体积应小于烧瓶容量的1/3。 - 用保鲜膜密封烧瓶，然后将琼脂糖/缓冲液混合物放入微波炉中加热（中火，1.0分钟）。在将烧瓶放入微波炉前，需在保鲜膜上扎几个小孔，以防爆炸。
- 将2.7 mL熔化的琼脂糖溶液倒入SGE芯片的4个通道中。将梳子插入琼脂糖溶液中以形成加样孔。
注意：熔化的琼脂糖溶液在室温下3分钟后将冷却凝固成凝胶状态。 - 从凝胶中取出梳子，并加入0.9 mL 0.5×TBE缓冲液覆盖凝胶表面。
3. 在 SGE 芯片中运行电泳
- 打开LED光源，并在光源上方放置一个425至505 nm的带通滤光片。
- 使用涡旋振荡器将14.4 µL的100 bp DNA Marker与1.6 µL SYBR Green混合。
- 取4 µL混合液加入SGE芯片琼脂糖凝胶的每个加样孔中（图2）。
- 将电极插入SGE芯片的两个电泳通道中。
- 在SGE芯片上方放置一个550至700 nm的带通滤光片。
- 开启电源，将电压设置为180 V（20 V/cm），同时打开智能手机以记录DNA片段的分离过程（图3）。
- 10分钟后电泳结束，关闭电源和LED光源。
- 清洗SGE芯片。
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结果
图4、图5 和 图6 分别展示了50、100和1,000 bp DNA标准品经凝胶电泳后的典型结果。实验完成后，DNA片段得到了良好的分离。此外，相同的样品在SGE芯片的4个通道中被分离，表明相同大小的DNA片段在每次实验中迁移的距离一致。
通过分析DNA片段迁移距离与其大小对数之间的关系，可以评估DNA标准品的分离效果；因此，SGE可用于计算未知DNA片段的大小。图3显示，当DNA片段大小小于700 bp时，迁移距离与DNA大小的对数呈线性关系。
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讨论
琼脂糖凝胶电泳广泛用于分离 DNA、RNA 和蛋白质。本研究提出一种新方法，以替代传统的凝胶电泳流程。结果表明，50、100 和 1,000 bp 的 DNA Marker 可在该小型化组装装置中实现良好分离。该方法的显著优势在于，不仅能够以极少的化学试剂消耗分离核酸，还可记录整个分离过程。尽管在图2中 DNA 片段看起来较宽，但通过优化 SGE 芯片参数和琼脂糖凝胶浓度，结果可进一步改善。此外，若芯片中使用预制胶，整个 SGE 过程不超过 10 分钟。
如果改变芯片中的通道宽度，DNA标准品的分离效果会有显著差异。例如，在分离1,000-bp DNA标准品时，若通道宽度较小，DNA条带会显得更宽。这可能是由于琼脂糖凝胶中的焦耳热效应非常强18，从而影响了分离效果。
本文提出的SGE方法非常简单。如果对该系统进行优化，可开发出便携式微型SGE装置。这种装置可用于即时检验实验室检测。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（编号：21205078）和中国高校博士学科点专项科研基金（编号：20123120110002）的支持。本工作还部分得到了国家重点研发计划（2016YFB1102303）、国家基础研究计划（973计划；2015CB352001）以及国家自然科学基金（61378060）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10×TBE | 北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司 | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio 公司 | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio 公司 | 3422A | |
| 1 kbp DNA标准品 | Takara Bio 公司 | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio 公司 | 5760A | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich 公司 | V900510 |
参考文献
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重印与许可
