在小型循环灌流浸没式切片记录系统中记录急性海马脑片的突触可塑性

摘要

本方案描述了在小体积循环缓冲液中稳定氧浓度的方法，以及在浸没式急性海马脑片中记录活动依赖性突触可塑性的技术要点。

摘要

尽管自1951年以来脑片实验已被广泛应用，但在进行场电位或细胞内记录以分析突触传递调制时，仍存在一些问题，降低了获得稳定且成功结果的可能性。本文描述了若干方法学方面的改进措施，可能有助于优化急性脑片的维持条件，并在商用浸没式记录舱（配备出流式碳氧混合气体供气装置）中记录兴奋性突触后场电位。出流式碳氧混合气体供气装置有助于稳定实验中的氧气水平，特别适用于依赖小体积缓冲液循环以提高药物实验成本效益的实验体系。此外，本文还展示了代表性实验，探讨了不同碳氧混合气体供气模式和刺激范式对突触传递的活动依赖性突触可塑性的影响。

引言

1951年，首次报道了急性脑切片实验¹. 1971年，成功之后 体外 来自梨状皮层的记录^2,3 并发现海马神经元沿其隔颞轴横向相互连接⁴，最早之一 体外 记录海马神经元活动⁵神经元在相似神经生理或神经结构参数下的表现 体内 和 体外 条件仍存在一些争议⁶，但在1975年，Schwartzkroin⁷ 表明神经元的基础特性得以维持 体外 以及高频刺激（即， 海马结构中传入纤维的强直刺激可诱导突触电位的持久性增强⁸神经元活动的电生理记录 体外 极大地拓展了对依赖于神经活动的突触可塑性细胞机制的研究^9,10，该现象由Bliss于1973年发现 等¹¹ 在 体内 兔子实验。

方案

动物的饲养和操作均遵循中国上海复旦大学脑科学研究院和医学神经生物学国家重点实验室制定的动物护理与实验操作标准。

1. 溶液配制

注意：参见材料表。

1. 制备切片缓冲液（改良的Gey溶液）：92 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、30 mM NaHCO₃、25 mM葡萄糖、20 mM HEPES、3 mM Na⁺-丙酮酸盐、10 mM MgSO₄和0.5 mM CaCl₂。
2. 使用1 M NaOH调节pH至7.6，不进行碳合气体饱和处理。
3. 将缓冲液储存在4 °C。
   注：滴定可使浑浊液体变澄清。渗透压为305–310 mOsm。碳合气体²¹含有5%二氧化碳和95%氧气。
4. 通过稀释不含碳酸氢盐和葡萄糖的10倍浓缩aCSF储备液来制备aCSF，最终成分为：124 mM NaCl、2.5 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、2 mM MgCl₂和1.25 mM KH₂PO₄。
5. 加入碳酸氢盐和葡萄糖，使其终浓度分别为10 mM葡萄糖和26 mM NaHCO_3<....

结果

在实验方案部分，我们描述了从雄性 C57BL/6 小鼠和雄性 Wistar 大鼠（5–8 周龄）海马结构的腹侧和中间区域制备急性海马脑片的方法（图 1）。将半脑固定在切片机平台上的特定位置，有助于保持其稳定性，无需使用琼脂或琼脂糖进行额外固定。灌流系统本身采用蠕动泵驱动，需以高转速运行以提供所需的液体流速。标准硅胶管在泵中高速运转下易迅速老化，造成显著问题，我们通过使用非硅胶材质的管道（内径：1.02 mm）解决了该问题。流出液的负压由两根并联连接、内径为 2.79 mm 的管道产生，这两根管道连接至记录室中的套管，以实现液体的抽吸（图 4A）。储液罐中 aCSF 的碳合气体（carbogen）通气速率必须在数小时内保持稳定，若使用微孔通气石或微孔管则难以实现。由于本方法的流出液碳合气体交换不依赖微孔结构，因此碳合气体的流速随时间保持稳定（图 2）。当实验使用较.......

讨论

尽管界面式切片记录舱能产生更稳定的突触反应^25,26,27,28，但浸没式记录舱在膜片钳记录和荧光成像方面提供了更大的便利性。因此，我们描述了使用商用浸没式切片记录舱在急性海马脑片中进行场电位记录的多个方面，该方法可轻松扩展应用于神经元中荧光探针的成像^17,18,19。除了脑片制备²⁵之外，在长时间记录过程中维持记录舱内恒定的碳氧混合气体（carbogen）水平是另一项挑战。由于碳氧混合气体水平仅能通过初始饱和aCSF储液槽来控制，因此在不同实验日之间容易出现aCSF中氧气浓度的差异。因此，建议使用溶氧仪以加快故障排查，并调节相关条件（例如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
所需试剂
NaCl	国药集团化学试剂有限公司，中国	10019318
KCl	国药集团化学试剂有限公司，中国	10016318
KH2PO4	国药集团化学试剂有限公司，中国	10017618
MgCl2·6H2O	国药集团化学试剂有限公司，中国	10012818
CaCl2	国药集团化学试剂有限公司，中国	10005861
NaHCO3	国药集团化学试剂有限公司，中国	10018960
葡萄糖	国药集团化学试剂有限公司，中国	10010518
NaH2PO4	国药集团化学试剂有限公司，中国	20040718
HEPES	Sigma	H3375
丙酮酸钠	Sigma	A4043
MgSO4	国药集团化学试剂有限公司，中国	20025118
NaOH	国药集团化学试剂有限公司，中国	10019718
解剖用工具与材料
断头器	Harvard apparatus	55-0012	用于大鼠断头
纱布剪	SCHREIBER	12-4227	用于小鼠断头
双刃刀片	飞鹰，中国	74-C
虹膜剪	RWD，中国	S12003-09
咬骨钳	RWD，中国	S22002-14
勺子	Hammacher	HSN 152-13
牙科水泥抹刀	Hammacher	HSN 016-15
双头牙科挖匙	Blacksmith Surgical，美国	BS-415-017
振动切片机	Leica，德国	VT1200S
手术刀片	RWD，中国	S31023-02
手术刀柄	RWD，中国	S32007-14
电生理设备与材料
垂直拉管仪	Narishige，日本	PC-10
防震台	Meirits，日本	ADZ-A0806
浸没式记录室	Warner Instruments	RC-26GLP
四轴显微操作器	Sutter，美国	MP-285, MP-225
铂丝	World Precision Instruments	PTP406
放大器	Molecular Devices，美国	Multiclamp 700B
数据采集系统	Molecular Devices，美国	Digidata 1440A
分析软件	Molecular Devices，美国	Clampex 10.2
荧光显微镜	Nikon，日本	FN1
LED光源	Lumen Dynamics Group，加拿大	X-cite 120LED
微量移液管	Harvard apparatus	GC150TF	细胞外记录
硼硅酸盐玻璃微电极	Sutter，美国	BF150-86	膜片钳
钨电极	A-M Systems，美国	575500
蠕动泵	兰格，中国	BT00-300T
蠕动泵管	ISMATEC，Wertheim，德国	SC0309	1根进液管，内径：1.02 mm
蠕动泵管	ISMATEC，Wertheim，德国	SC0319	2根出液管，内径：2.79 mm
CCD相机	PCO，德国	pco.edge sCMOS
镜头清洁纸	Kodak
50 mL 锥形离心管	Thermo scientific	339652
预加热室	Warner Instruments	BSC-PC
管路加热器	Warner Instruments	SF-28
温度控制器	Warner Instruments	TC-324B