本方案描述了在小体积循环缓冲液中稳定氧浓度的方法，以及在浸没式急性海马脑片中记录活动依赖性突触可塑性的技术要点。
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摘要
摘要
尽管自1951年以来脑片实验已被广泛应用，但在进行场电位或细胞内记录以分析突触传递调制时，仍存在一些问题，降低了获得稳定且成功结果的可能性。本文描述了若干方法学方面的改进措施，可能有助于优化急性脑片的维持条件，并在商用浸没式记录舱（配备出流式碳氧混合气体供气装置）中记录兴奋性突触后场电位。出流式碳氧混合气体供气装置有助于稳定实验中的氧气水平，特别适用于依赖小体积缓冲液循环以提高药物实验成本效益的实验体系。此外，本文还展示了代表性实验，探讨了不同碳氧混合气体供气模式和刺激范式对突触传递的活动依赖性突触可塑性的影响。
引言
1951年，首次报道了急性脑切片实验1. 1971年，成功之后 体外 来自梨状皮层的记录2,3 并发现海马神经元沿其隔颞轴横向相互连接4，最早之一 体外 记录海马神经元活动5神经元在相似神经生理或神经结构参数下的表现 体内 和 体外 条件仍存在一些争议6，但在1975年，Schwartzkroin7 表明神经元的基础特性得以维持 体外 以及高频刺激（即， 海马结构中传入纤维的强直刺激可诱导突触电位的持久性增强8神经元活动的电生理记录 体外 极大地拓展了对依赖于神经活动的突触可塑性细胞机制的研究9,10，该现象由Bliss于1973年发现 等11 在 体内 兔子实验。
对脑切片中神经元活动或信号通路的研究，尤其是急性海马切片的研究，现已成为一种标准工具。然而令人惊讶的是，体外实验尚未实现标准化，这一点从目前仍存在的多种急性海马切片制备与维持方法中可见一斑。Reid 等（1988）12综述了在不同类型的切片记录室中维持急性脑切片所面临的方法学挑战，包括灌流液的选择、pH值、温度和氧浓度等参数的设定。由于体外切片记录装置通常包含大量自制组件，这些参数在记录室中仍然难以精确控制。已有文献报道了一些可能有助于克服部分方法学难题的新技术，例如描述了新型浸没式切片记录室，包括间质三维微灌流系统13、具有增强层流和供氧能力的记录室14、配备计算机化温度控制的系统15以及多腔室记录系统16。由于这些装置构建复杂，大多数科研人员仍依赖于 commercially available 切片记录室。这些记录室可安装于显微镜系统上，从而实现膜片钳电生理与荧光成像技术的结合17,18,19。由于此类记录室需将脑切片完全浸没于人工脑脊液（aCSF）中，因此需要维持较高的灌流速度，这增加了药物应用的成本。为此，我们引入了一种带有出液端碳氧混合气体（carbogen）再饱和功能的循环灌流系统，该系统可在使用相对少量aCSF的情况下，为浸没式切片记录室中长期记录场电位提供足够的稳定性。此外，我们还总结了该实验用碳氧混合气体/灌流系统对依赖神经元活动的突触可塑性结果的影响10，以及真核延伸因子-2激酶（eEF2K）抑制如何调节突触传递的机制20。
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方案
动物的饲养和操作均遵循中国上海复旦大学脑科学研究院和医学神经生物学国家重点实验室制定的动物护理与实验操作标准。
1. 溶液配制
注意：参见材料表。
- 制备切片缓冲液（改良的Gey溶液）：92 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、30 mM NaHCO3、25 mM葡萄糖、20 mM HEPES、3 mM Na+-丙酮酸盐、10 mM MgSO4和0.5 mM CaCl2。
- 使用1 M NaOH调节pH至7.6，不进行碳合气体饱和处理。
- 将缓冲液储存在4 °C。
注：滴定可使浑浊液体变澄清。渗透压为305–310 mOsm。碳合气体21含有5%二氧化碳和95%氧气。 - 通过稀释不含碳酸氢盐和葡萄糖的10倍浓缩aCSF储备液来制备aCSF，最终成分为：124 mM NaCl、2.5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、2 mM MgCl2和1.25 mM KH2PO4。
- 加入碳酸氢盐和葡萄糖，使其终浓度分别为10 mM葡萄糖和26 mM NaHCO3。
- 在加入NaHCO3后，立即通过一端封闭的带孔硅胶管对aCSF进行碳合气体饱和处理。
- 在碳合气体饱和过程中测定pH值（pH 7.3–7.4）。
注：可通过调整NaHCO3的用量略微调节缓冲能力。由于最终pH值具有温度依赖性，因此必须在工作温度（e.g., 30 °C）下进行碳合气体饱和时检测pH值。
2. 急性海马脑片的制备
注意：参见材料表。
- 将切片固定网置于急性脑切片孵育 chamber 中，加入 aCSF 并以碳合气（4–6 L/h）充氧至少 30 分钟22 在 28–30 °C 下。
- 将手术器械冷却至 2-4 °C。
- 将装有冰冷且充有碳氧混合气体的切片缓冲液（2-4 °C）的玻璃烧杯置于冰水混合物中，并放置在振动切片机附近。
- 使用异氟烷将大鼠或小鼠麻醉至角膜反射消失（30-50 s），取 500 µL 异氟烷加入 2 L 玻璃罐中，或取 12.5 µL 加入 50 mL 管中。
- 采用 Mathis 发表的文献中详细描述和图示的方法分离脑组织 等 (2011)23 和 Yuanxiang 等 (2014)24.
- 将脑组织置于冰冻切片缓冲液中冷却至2-4 °C（至少2分钟），然后解剖小脑并分离半球。
- 使用冰冷的手术刀沿每个半球背侧边缘以70°角切取一块背侧皮层组织25 以获取海马腹侧和中间部分的横切片，如图所示 图1C 和 E.
- 使用冰冷的牙科水泥调刀，将半球体转移至一张滤纸上，以短暂干燥所形成的表面（1–2 秒）。
- 将两个具有新鲜切面的半脑用速干胶粘剂固定在冰冷的切片平台上，使半脑的尾端朝向剃刀刀片图1D).
- 将切片平台放入振动切片机的冷却室中，并用切片缓冲液（2-4 °C）填充冷却室。使用带孔硅胶管通入碳氧混合气体进行碳酸化处理。
- 使用合适的振动切片机参数切割350 µm厚的切片（例如， 刀片前进速度：1.2 mm/s，刀片振幅：1 mm。
- 使用两根注射套管从下托区和内嗅皮层中分离出海马结构（>28 G）作为剪刀使用。
- 使用巴斯德吸管除去先前准备的孵育 chamber 中切片固定网上的气泡。
- 将切片平台上具有部分透明锥体细胞层的脑片转移至孵育 chamber 的网架上。使用大口径巴斯德移液管吸取 aCSF 和脑片，避免折叠、拉伸、重叠或漂浮。
注意：整个操作过程（步骤 2.5–2.14）可能需要 5–10 分钟；因此，需定期检查缓冲液的温度，以确保其保持在 4 °C。 - 在孵育 chamber 中，将脑片于 30 °C 下孵育至少 1.5–2 小时，并以 4–6 L/h 的流速通入碳氧混合气（carbogen）。
注意：调节碳合气体的流速，以使缓冲液在孵育器中循环，但需防止脑片漂浮。
3. 小型储液器 aCSF 循环的碳氧合改良方法
- 在循环系统的出口处连接一个三通管接头（图2B）。
- 将三通管接头的中臂与碳酰气供应管连接，并使用气体流量计调节流速（3–4 L/h，图2D 和 图4C）。
- 在循环系统的入口处添加第二个三通管接头。将中臂连接至朝向管路加热器的管道，上臂连接至一段细硅胶管（长度10 cm），下臂连接至来自储液槽的进液管（低通滤波器；图4C）。
- 在细硅胶管（外径：2 mm）上放置一个管夹，位置应选择在灌流室中人工脑脊液（aCSF）脉动最小处，该脉动由蠕动泵产生。
注意：出液端碳酰气化（outflow-carb.）改造可降低碳酰气化水平对aCSF储液槽体积、aCSF循环速率以及小体积aCSF储液槽（<50 mL；图3）内管道相对位置的敏感性。关于低通滤波器，细硅胶管中保留一定量的空气可减少aCSF流动的脉动，因此管道应主要充满空气。
4. 在浸没式切片记录室中记录突触反应
注意：参见材料表。
- 将aCSF溶液在水浴中预热至约28-30 °C（以防止记录室中形成气泡）。
- 启动循环系统（4-5 mL/min），并打开在线加热器，使系统平衡至少1小时。
- 将一小片镜头清洁纸和固定在U形铂丝上的尼龙网在浸没式切片室中预浸泡几分钟图4).
- 移除U形铂丝。
- 关闭循环，将切片放在镜头清洁纸上。
- 立即将切片承载网置于切片上方，打开泵，使切片在不将物镜浸入aCSF的情况下平衡30分钟。
- 填充硼硅酸盐微量移液管（即， 将记录电极（尖端电阻：1-2 MΩ，用aCSF填充至三分之一）用aCSF润洗，并安装到移液电极夹持器中。
- 通过将金属刺激电极放入 NaHCO₃ 溶液中检查其绝缘性3 溶液（>40 mM）。将电极连接至直流电压发生器的负极（1-2 V，正极为银丝或铂丝），并在解剖显微镜下观察电极尖端气泡的形成。>60倍放大倍数）。
- 将测试用的环氧树脂绝缘钨刺激电极置于操纵器夹持器中，参考电极导线置于切片室中。
- 在腔室中添加第二个参考电极，并将其连接至记录电极头级的参考插座图4A).
- 在放大器控制软件中，单击 "零夹紧模式" 盒子，然后通过双击继续 "输出增益列表" 盒。选择一个增益值 "100," 双击 "高通滤波器列表框（Bessel），" 选择 "0.1 Hz," 并双击 "低通滤波器列表框（交流）" 选择 "3 kHz"
- 在录音软件中，单击开启按钮 "获取 | 开放协议" 选择一种具有以下设置的方案：允许进行间歇性刺激，并以10-20 kHz的采样频率对放大后的电位信号进行50-100 ms的数字化采集，且在间歇性记录开始后10 ms自动触发电刺激隔离器。
- 将刺激电极和记录电极平行于锥体细胞层呈直线放置，例如（图4B 和 图5).
- 点击 "获取 | 编辑实验方案" 并选择 "触发" （在弹出窗口中）点击标签页 "触发源" 盒子并选择 "空格键" 作为触发源。点击 "好的" 按钮。单击 "记录" 单击按钮以开始采集，并注意带有触发按钮的弹出窗口。
- 在刺激隔离器软件中，单击 "电压控制" 盒和输入 "0." 点击 "下载" 按钮。单击 "记录软件" 窗口中按空格键。重复此循环，依次输入例如以 1 mV 为步长的 1 到 8 的数值 "电压控制" 盒子
- 将刺激强度与fEPSP斜率值相关联，并确定获得fEPSP斜率最大值40%所需的刺激强度。点击 "电压控制箱" 并输入确定的值。单击 "下载" 按钮。
注意：使用刺激隔离器向脑组织施加短暂的电压或电流脉冲。双相脉冲每相持续时间为100 µs。 - 在记录软件中，单击停止按钮，然后单击 "获取" 菜单。单击 "编辑实验方案" 并选择 "触发" 弹出窗口中的选项卡。单击触发源框并选择 "内部计时器" 作为触发源。点击 "好的" 按钮。例如，点击记录按钮，以开始自动记录场电位，每隔30秒记录一次。点击 "停止" 30-60 分钟后按下按钮。
- 点击 "获取" 菜单，单击 "开放实验方案，" 选择所需的突触可塑性诱导方案，然后单击 "好的" 按钮。单击 "记录" 按钮以自动启动高频刺激与记录。点击 "停止" 按钮。
注意：对于涉及突触可塑性的研究，在长时间记录基线后，应采用标准的长时程增强或长时程抑制诱导范式。突触传递发生相应调制的代表性结果如图所示。 图7 和 图8. - 在记录软件中，单击 "获取 | 开放协议" 并选择与步骤 4.12 相同的程序。点击 "好的" 按钮，然后单击 "记录" 例如，持续自动运行场电位记录 2-4 小时。点击 "停止" 按钮以终止录制。
- 若需持续给予化合物，可在药物学研究中将该化合物直接加入aCSF储液器中图6).
5. 实验装置的清洁与注意事项
注意：请参见下方的一般性建议。
- 每周通过循环10% H清洁系统2O2 不超过20分钟，随后用去离子H2O.
注意：不建议使用乙醇进行清洁。同样不建议将参考电极和目标电极浸入 H2O2. - 用0.1 N HCl去除物镜表面或培养腔周围析出的盐，然后用水冲洗。
- 用蒸馏水或0.1 N HCl清洗碳氧混合气体鼓泡器。
- 将切片孵育室浸入10% H2O2 每周一次，孵育室用去离子水充分冲洗5分钟2O.
- 对于金属刺激电极，在每次实验后用去离子水冲洗刺激电极尖端，并用浸有乙醇的棉球轻轻擦拭刺激电极尖端，以去除残留组织。
- 通过用砂纸小心擦拭去除商用金属刺激电极尖端的绝缘层，以降低其电阻。
- 通过将硅胶管更换为聚四氟乙烯管，减少aCSF在管路循环过程中碳合气的流失。
- 将记录电极和参考电极的银丝置于次氯酸钠溶液中浸泡数天，以在导线表面形成氯化银（AgCl）。
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结果
在实验方案部分，我们描述了从雄性 C57BL/6 小鼠和雄性 Wistar 大鼠（5–8 周龄）海马结构的腹侧和中间区域制备急性海马脑片的方法（图 1）。将半脑固定在切片机平台上的特定位置，有助于保持其稳定性，无需使用琼脂或琼脂糖进行额外固定。灌流系统本身采用蠕动泵驱动，需以高转速运行以提供所需的液体流速。标准硅胶管在泵中高速运转下易迅速老化，造成显著问题，我们通过使用非硅胶材质的管道（内径：1.02 mm）解决了该问题。流出液的负压由两根并联连接、内径为 2.79 mm 的管道产生，这两根管道连接至记录室中的套管，以实现液体的抽吸（图 4A）。储液罐中 aCSF 的碳合气体（carbogen）通气速率必须在数小时内保持稳定，若使用微孔通气石或微孔管则难以实现。由于本方法的流出液碳合气体交换不依赖微孔结构，因此碳合气体的流速随时间保持稳定（图 2）。当实验使用较...
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讨论
尽管界面式切片记录舱能产生更稳定的突触反应25,26,27,28，但浸没式记录舱在膜片钳记录和荧光成像方面提供了更大的便利性。因此，我们描述了使用商用浸没式切片记录舱在急性海马脑片中进行场电位记录的多个方面，该方法可轻松扩展应用于神经元中荧光探针的成像17,18,19。除了脑片制备25之外，在长时间记录过程中维持记录舱内恒定的碳氧混合气体（carbogen）水平是另一项挑战。由于碳氧混合气体水平仅能通过初始饱和aCSF储液槽来控制，因此在不同实验日之间容易出现aCSF中氧气浓度的差异。因此，建议使用溶氧仪以加快故障排查，并调节相关条件（例如
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
W.W. 设计并实施了实验，进行了数据分析，并撰写了手稿。D.X. 和 C.P. 协助完成图表制备并参与了实验操作。本研究工作由国家自然科学基金（31320103906）和“111 计划”（B16013）对 T.B. 的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 所需试剂 | |||
| NaCl | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10019318 | |
| KCl | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10016318 | |
| KH2PO4 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10012818 | |
| CaCl2 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10005861 | |
| NaHCO3 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10018960 | |
| 葡萄糖 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10010518 | |
| NaH2PO4 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 20025118 | |
| NaOH | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10019718 | |
| 解剖用工具与材料 | |||
| 断头器 | Harvard apparatus | 55-0012 | 用于大鼠断头 |
| 纱布剪 | SCHREIBER | 12-4227 | 用于小鼠断头 |
| 双刃刀片 | 飞鹰，中国 | 74-C | |
| 虹膜剪 | RWD，中国 | S12003-09 | |
| 咬骨钳 | RWD，中国 | S22002-14 | |
| 勺子 | Hammacher | HSN 152-13 | |
| 牙科水泥抹刀 | Hammacher | HSN 016-15 | |
| 双头牙科挖匙 | Blacksmith Surgical，美国 | BS-415-017 | |
| 振动切片机 | Leica，德国 | VT1200S | |
| 手术刀片 | RWD，中国 | S31023-02 | |
| 手术刀柄 | RWD，中国 | S32007-14 | |
| 电生理设备与材料 | |||
| 垂直拉管仪 | Narishige，日本 | PC-10 | |
| 防震台 | Meirits，日本 | ADZ-A0806 | |
| 浸没式记录室 | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 四轴显微操作器 | Sutter，美国 | MP-285, MP-225 | |
| 铂丝 | World Precision Instruments | PTP406 | |
| 放大器 | Molecular Devices，美国 | Multiclamp 700B | |
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| 硼硅酸盐玻璃微电极 | Sutter，美国 | BF150-86 | 膜片钳 |
| 钨电极 | A-M Systems，美国 | 575500 | |
| 蠕动泵 | 兰格，中国 | BT00-300T | |
| 蠕动泵管 | ISMATEC，Wertheim，德国 | SC0309 | 1根进液管，内径：1.02 mm |
| 蠕动泵管 | ISMATEC，Wertheim，德国 | SC0319 | 2根出液管，内径：2.79 mm |
| CCD相机 | PCO，德国 | pco.edge sCMOS | |
| 镜头清洁纸 | Kodak | ||
| 50 mL 锥形离心管 | Thermo scientific | 339652 | |
| 预加热室 | Warner Instruments | BSC-PC | |
| 管路加热器 | Warner Instruments | SF-28 | |
| 温度控制器 | Warner Instruments | TC-324B |
参考文献
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