一个<em秀丽隐杆线虫</em基于营养状态的铜反转测定

摘要

在这里，我们提出了一种秀丽隐杆线虫特异性测定法，用于评估铜厌恶行为的变化和定位常见食物来源的能力，因为生物体从充足的营养状态进入饥饿的营养状态。

摘要

为了确保生存，生物必须能够避免不利的栖息地，同时确保一致的食物来源。 秀丽隐杆线虫在检测到各种环境刺激后改变其运动模式，并可以调整其对饥饿状况的行为反应套件。当从食物源中取出超过30分钟时，线虫通常表现出降低的反应反应。观察响应于不断变化的营养状况的行为变化可以提供对调节从喂养到饥饿状态的过渡的机制的了解。

我们已经开发了一种测定线虫测量过渡障碍（ 即铜），然后在长时间内达到食物来源的能力。该协议基于以前的工作，通过以允许随着生物向a转移的持续数据收集的方式整合多个变量来构建n越来越饿了。此外，该测定允许增加的样品量，使得可以同时评估较大的线虫种群。

检测或响应铜的能力的生物有机体立即穿越化学屏障，野生型线虫最初被排斥。随着野生型蠕虫越来越缺乏，它们开始越过障碍并达到食物来源。我们设计了这种检测方法来评估一种不能应对各种环境线索的突变体，包括食物感觉或厌恶性化学物质的检测。当通过该方案进行评估时，有缺陷的生物体立即越过障碍物，但也不能检测食物来源。因此，尽管临时达到食物来源，这些突变体重复地跨越化学屏障。该测定可以直接测试蠕虫群体，以评估与厌恶和饥饿相关的潜在途径缺陷。

引言

秀丽隐杆线虫已经被用作研究神经生物学数十年的模型，因为分析仅由302个神经元组成的神经系统的电路相对容易¹ 。只要生物依赖于环境线索的响应，大部分神经系统都致力于调节环境信号的整合² 。尽管神经系统的简单， C.线虫可以检测和响应各种环境信号，包括驱避剂³ ，引诱剂⁴ ，温度⁵ ，甚至湿度⁶ 。正确地整合环境信号的故障一直挂在哺乳动物模型系统^7-9一些行为障碍和神经退行性条件。有一系列可用的神经疾病模型 在线虫中的 ^10种和线虫药物筛选¹¹的发展，这种生物体已被证明是用于研究神经生物学的有用系统。鉴于线虫连接群¹的可用性和线虫基因组^12中几乎每个基因的突变，我们对线虫神经系统的理解以及我们自己的扩展都受到创造性地适合测定的设计的限制。

一些趋化实验已经开发在过去40年的线虫响应评估，以多样化的厌恶刺激^{3，4，13，14，15。}初步实验涉及引入急性环境刺激，而单个蠕虫在琼脂板上漫游= “外部参照”> ^{3，14，16。}记录了对运动反应的立即改变。例如，可以将挥发性气味辛醇施用于头发，并在线虫鼻前摆放，以刺激野生型蠕虫¹⁷中向后运动的开始。更复杂的实验也已经发展到包含多个变量作为评估行为选择¹⁸的手段。该测定的变化需要使用铜溶液以产生厌恶的中线屏障⁴ 。引诱剂，即二乙酰基，被放置在化学屏障的一侧，蠕虫从二乙酰基源转移出去。蠕虫对铜的厌恶反应有缺陷，马上越过障碍达到二乙酰，而野生型蠕虫最初被屏障排斥。当蠕虫第一次接近铜屏障时，响应得分没有长期观察。

蠕虫在经历饥饿状况后进行评估，对环境刺激的敏感性降低¹⁹ 。当厌恶的化学辛醇在线虫鼻前飘荡时，野生型生物体在食物中会在3-5秒内刺激向后的运动。在这些生物从食物中取出10分钟后，它们的延迟反应为8 - 10秒²⁰ 。因此，随着饥饿的增加，线虫对有害环境信号的反应显示出减少的反应，因为对食物的追求变得对生存更为重要。相反，过表达神经肽受体9（ npr-9）的线虫对食物上或食物上的辛醇没有反应，并且表现出无法应对许多厌恶刺激²¹ 。这些npr-9（GF）生物体也不会在食物存在的情况下调节其逆转频率，但可以反对刺激刺激的刺激表示他们能够向后运动²¹ 。鉴于它们表现出异常下降的食物反转频率，但可以在食物²¹的情况下调节其行为，因此我们还评估了npr-9（LF）突变体。耦合引进急性外界刺激的蠕虫的营养状况阐明由食品相关的途径大致可以调节感官信号传导机制已经资助途径^22，23。食物在线虫环境中的存在也被用于评估乙醇提取反应²⁴ 。在该实验中，将蠕虫在不同浓度的乙醇中孵育，然后置于具有被称为“食物种族测定”的食品的琼脂平板上。食物贴片放置在盘子的一个边缘，而线虫w远离食物来源。通过测量蠕虫到达食物块所需的时间来评估乙醇抽出。

这种基于营养的铜避免测定建立在食物种族测定的基础上，以整合额外的环境变量，即食物和铜，同时评估随时间推移的行为变化。这是整个线虫群落中常用协议的改编⁴ 。该方案已被用于评估厌恶反应和食物在四小时内的检测²¹ 。由于蠕虫在食物剥夺30分钟后出现饥饿行为²⁵ ，我们还可以评估营养状况的变化如何影响环境反应。该测定的条件测量实验生物随时间改变对厌恶刺激的反应性，因此评估行为变化生物进入饥饿状态（并持续测量长时间的饥饿）。由于npr-9（GF）动物不会改变他们对食物或许多厌恶线索的行为，我们试图确定这些行为缺陷是否会在饥饿的背景下持续存在。最终，该测定设计已经被配制为特异性地评估npr-9（GF）突变体，但是可以进一步适用于表征新菌株。

方案

1.实验生物的制备

1. 在开始测定前24小时挑选每个菌株10只L4分期线虫，以确保生物体是年轻成年人。对于每个突变体或对照线虫，选择10个L4（对照为10个，测定为10个）。
   1. 维持使用标准方法^26，在标准琼脂平板²⁷ 24小时与OP50 大肠杆菌接种L4生物体。如果在随后的洗涤步骤中生物体丢失，则通过增加起始样品量来补偿（ 即挑选20个蠕虫而不是10个）。
      注意：行为是一种天生变异的表型。在三个不同的日子对每个菌株执行一式三份的方法。包括新的菌株的附加控制菌株和条件，如讨论部分所强调的。
2. 在测定之前，转移实验组织在没有细菌的琼脂平板上，允许线虫自由移动1分钟以除去多余的细菌。
   1. 如果实验生物在测定前24小时内发生污染状况，请丢弃。
3. 移取1 mL M9到无菌板上，将蠕虫洗至微量离心管中。
4. 以3,000 xg离心1分钟。蠕虫应在管的底部形成颗粒。吸出M9溶液而不破坏蠕虫颗粒。向蠕虫颗粒中加入1 mL M9，将反应管与溶液混合。
5. 重复步骤1.4三次。
   1. 如果过多的细菌最初用蠕虫转移，重复总共5次。不要将细菌转移到铜食品赛道板上。如果将食物转移到测定板上，则会干扰准确的数据收集。
6. 最终洗涤后，吸出上清至10081; M的M和蠕虫颗粒残留。
   注意：饥饿相关行为30分钟后变得明显。因此，一旦洗涤步骤完成，蠕虫应立即从溶液中转移。

2.测定板的制备

1. 在测定前两天准备标准的NGM琼脂平板。
   1. 如果将板保持在潮湿的环境中，在测定前3天制备琼脂板。或者，取下板的盖子3-6小时以确保适当的干燥（如果在无菌环境中）。
2. 使用厚的永久标记，沿着外边缘在板的下侧形成一条线，另一条形成中线屏障（ 图1 ）。中线屏障应与板的每个边缘等距。使用标尺来确保精确的测量。这些生产线将作为传递细菌和铜溶液的指南。只要那个大肠杆菌在铜溶液前转移，这些线将作为指标。
3. 种子板与50μL的OP50 大肠杆菌仅在铜屏障的一侧形成均匀的草坪（ 图2 ）。细菌浓度在测定中应保持一致;然而，随着浓度的轻微差异，观察到很小的变异性。
   1. 使用板下面的标记线，以确保细菌不与铜溶液接触。只要铜溶液排列在板的边缘并形成中线屏障，转移细菌使得铜溶液不会与食物源接触。
4. 标记第二组平板，不转移OP50 大肠杆菌 （ 图2 ）。这些板块将用于评估阴性对照。这些盘子也应该有一个标记在板的一半上，以表示初始转移来源。
5. 允许细菌干燥，然后在37℃孵育平板过夜。确保转移到37°C的孵化器或房间时细菌斑块不会受到干扰。过度的干扰可能会改变食物贴片的位置或形状。

趋化因子测定

1. 在测定开始时间前新鲜制备0.5M硫酸铜（II）溶液。如果每个板使用125μL的溶液，则根据使用的测定板的数量（ 例如 5个测定板，625μL）来放大该体积。
2. 吸取100μL硫酸铜（II）溶液在琼脂边缘，以产生外部铜屏障。铭牌的下侧应作为指导。
3. 移取25μL硫酸铜（II）溶液以产生中线屏障。
   1. 确保硫酸铜（II）溶液不接触细菌贴片。使用斑点技术可能会因为琼脂上的凹痕/划痕而影响运动。
4. 让铜溶液干燥到板上。时间段可能因板材和实验室条件而异。转移后每5分钟检查干燥。
   注意：铜溶液显示蓝色色调，易于识别。使用实验室组织轻轻地吸取板边缘附近的溶液，以辨别干燥。
5. 将20μL蠕虫颗粒从管底移取到无细菌检测板的一半。
   1. 确保将10个蠕虫转移到测定板上。如果意外包含额外的蠕虫，请用卤代烃油取出，以确保没有细菌添加到板上。在测定期间，每个测定应具有一致数量的线虫。
      注意：如果传染虫数太少，在测定过程中发生错误，增加初始样品量将减轻洗涤和转移期间的潜在损失。
6. 用实验室组织从板上清除多余的M9。 M9不应与硫酸铜（II）溶液接触。
   注意：确保蠕虫和琼脂表面在执行此步骤时不受影响。如果使用过度苛刻，实验室组织可能会对板的琼脂表面产生压痕，并可以去除蠕虫。应该丢弃通过 KimWipe意外删除的蠕虫。
7. 一旦M9溶液被去除并且所有的蠕虫已经开始非液体运动模式，启动测定秒表。
   1. 最佳地，在一分钟内取出M9溶液。基本参数是识别正弦运动。蠕虫在液体中不同， 例如颠簸而不是正弦波。每次实验器官开始测定停止观察战争停止颠簸。
8. 每30分钟检查一次测定板。
   1. 对于具有细菌斑块的测定板，如果在4小时内到达食物贴片，则对生物有积极的作用。对于阴性对照板，如果他们已经越过障碍物，则对生物有积极的作用。

结果

我们利用野生型（N2）， npr-9（tm1652）和npr-9过表达菌株， 即 npr-9（GF） （IC836- npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp），以评估对饥饿和铜厌恶的反应。野生型生物体能够检测并响应于所述厌恶铜阻挡，而NPR-9（GF）的突变体不发起超过4小时测定²¹至铜厌恶响应。饥饿30分钟后，大约50-60％的野生型（N2）生物体穿过铜屏障并到达食物贴片。在2小时的标记中，75％的野生型线虫到达食物来源。在测定结束时，100％的N2生物体已经重新定位到食物来源。相比之下，大多数npr-9（GF）生物体不会调节运动食物的运动模式，即使在与食物接触之后也会继续穿过厌恶的屏障资源。在4小时测定中， npr-9（GF）蠕虫不断改变其运动以响应食物，并且在任何给定时间只有30％的测试生物在食物中发现。 npr-9（LF...

讨论

该测定设计修改了食物种族测定^24，以包括铜溶液以产生厌恶的中线屏障并围绕板的边缘以防止线虫的丢失。测试生物体在四小时内穿过障碍物并达到食物补丁的能力。在npr-9（GF）的上下文中，我们利用该测定来评估饥饿条件如何影响厌食反应和食物检测。如果我们以前将npr-9（GF）表征为对食物和厌恶线索的反应性有缺陷，我们将多个环境线索与营养状况相结合，以评估饥饿是否可以调节缺陷型npr-9（GF）行为。此法依赖于病毒的检测和化学刺激和食物线索^3,4反应能力。考虑到不同变量的分析，必须精心控制生物体，以消除混杂因素。对于未表征的突变体， 即具有不良反应或食物反应性的突变体，需要使用其他对照菌株。逆转缺陷菌株， 如 che-2或odr-3 ²⁸ ，以及不改变食物中的运动模式的突变体（ 如 t...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
M9 溶液 [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O 至 1 升。使用前用高压灭菌器进行灭菌。]			实验室生产
硫酸铜	Sigma	C-1297	用水适当悬浮至 0.5M 浓度