靶向特异性探针是分析多种疾病（例如，炎症、感染和肿瘤发生）中分子机制（如蛋白质表达）的一种创新工具。本研究描述了一种利用F4/80特异性荧光介导断层成像技术，对结肠炎小鼠模型中肠道巨噬细胞浸润进行定量三维断层评估的方法。
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摘要
摘要
疾病的小鼠模型在科学研究中不可或缺。然而，许多诊断工具（如内窥镜或断层成像）在动物模型中并未常规使用。传统的实验检测通常依赖于 死后 和 离体 分析，从而避免了无法对个体进行重复随访检查的问题，并减少了研究所需的实验动物数量。荧光介导断层成像技术可实现对荧光探针的无创、可重复、定量、三维评估。该技术具有高灵敏度，并可利用分子标记物，从而实现对特定分子靶点的特异性检测与表征。特别是靶向探针，已成为研究炎症、自身免疫性疾病、感染、血管疾病、细胞迁移、肿瘤发生过程中基因激活与蛋白表达的创新工具， 等等本文中，我们为这一复杂的成像技术提供了逐步操作指南 体内 炎症的检测与表征即， 在一种常用的肠道炎症小鼠模型中，F4/80阳性巨噬细胞浸润。该技术也可应用于其他研究领域，例如免疫细胞或干细胞示踪。
引言
动物模型在科学研究中被广泛应用，许多非侵入性方法可用于监测疾病活动性和动物活力，例如体重变化的定量分析，或血液、尿液和粪便的检测。然而，这些仅是间接的替代性指标，且易受个体间差异的影响。通常需要通过组织标本的死后分析加以补充，而这阻碍了在多个时间点进行连续观察，以及对生理或病理过程进行在体直接观察。近年来发展出一系列先进的小型动物成像技术，包括断层成像、光学成像和内窥镜技术，这些技术能够直接可视化上述过程，并允许对同一只动物进行重复分析1,2,3。此外，能够在同一只动物身上反复监测多种疾病状态，可能减少实验所需动物数量，从动物伦理的角度来看，这一点具有重要意义。
目前存在多种不同的光学成像技术用于活体荧光成像。最初，共聚焦成像被用于研究表面及次表面的荧光现象4,5。然而近年来，已开发出可实现定量三维组织评估的断层成像系统6。这一进展得益于能够在近红外（NIR）光谱范围内发射光的荧光探针的发展，同时结合了低吸收特性、高灵敏度探测器以及单色光源7。传统断层成像技术（如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）或超声（US））主要依赖物理参数并用于可视化形态结构，而光学成像则可利用内源性或外源性荧光探针，提供有关潜在分子过程的额外信息8。
分子生物学的进步有助于为越来越多的靶标开发出智能且具有靶向性的荧光分子探针。例如，可通过碳菁衍生物标记的抗体来可视化特定靶区域中受体介导的摄取与分布过程9。大量可获得的抗体经标记后可作为特异性示踪剂，用于体内原本难以到达的区域，从而在肿瘤发生以及神经退行性、心血管、免疫和炎症性疾病模型中，前所未有地揭示分子与细胞水平的生物学过程7。
本研究中，我们描述了在结肠炎小鼠模型中使用荧光介导断层成像技术的方法。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎是一种标准的化学诱导型小鼠肠道炎症模型，其特征类似于炎症性肠病（IBD）10。该模型特别适用于评估先天免疫系统在肠道炎症发生过程中的作用11。由于单核细胞和巨噬细胞的募集、活化及浸润是IBD发病机制中的关键步骤，因此可视化这些细胞的募集过程及其浸润动力学，对于监测潜在治疗物质在临床前研究中的效果至关重要12。我们描述了DSS诱导结肠炎的方法，并展示了利用荧光分子断层成像技术对巨噬细胞浸润肠黏膜的过程进行断层成像表征，以特异性可视化单核细胞/巨噬细胞标志物F4/8013。此外，我们还介绍了辅助性和补充性操作步骤，包括抗体标记、实验装置设置，以及图像的分析与解读，并将其与疾病活动指数、流式细胞术、组织学分析和免疫组织化学等常规检测结果进行关联比较。我们还讨论了该技术的局限性及其与其他成像方式的比较。
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方案
所有动物实验均根据德国动物保护法（Tierschutzgesetz）获得北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（LANUV）的批准。
1. 材料与实验设置
- 动物护理。
- 使用体重为20-25 g、性别和年龄相匹配的任何对DSS敏感品系的小鼠（例如，C57BL/6）。
- 每个实验组至少计划使用五只或更多小鼠，并根据当地动物护理指南进行饲养。
- 提供标准啮齿类动物饲料和高压灭菌的饮用水，自由摄取（ad libitum）。
- 在扫描前至少三天，移除标准饲料并替换为无苜蓿饲料，以减少管腔内自发荧光。
- 急性DSS诱导结肠炎的建立。
- 将2 g DSS（分子量约40,000 Da）溶解于100 mL高压灭菌饮水中，配制成2%（w/v）溶液。
- 仅向小鼠提供该DSS溶液作为饮用水，每只小鼠每日预计消耗5 mL。对照组小鼠则给予不含DSS的相同饮用水10。
注意：实验期间每日监测小鼠状态直至实验结束。根据当地适用的动物福利指南，对体重减轻超过初始体重20%或出现濒死状态（即持续弓背姿势、活动减少、呼吸困难、毛发明显竖立）的小鼠实施安乐死。
- 荧光介导断层成像的准备。
- 按照制造商说明书，将目标抗体（例如，大鼠抗小鼠F4/80）标记荧光染料（例如，Cyanine7，λexcitation：750 nm，λemission：776 nm）。将纯化的抗体置于适当的透析膜（截留分子量 < 50-100 kDa）中，用1 L 0.15 M氯化钠溶液透析至少2小时或过夜。
- 将抗体转移至1 L 0.1 M NaHCO3 溶液中，继续透析至少2小时。
- 将所需量的荧光染料溶解于二甲基亚砜（DMSO）中（10.8 µL/mg抗体），然后加入抗体溶液。使用摩尔浓度20倍过量的荧光染料，以获得染料与蛋白比例为1:3的标记产物。
- 在4 °C避光孵育1小时。通过透析（使用1 L 0.15 M氯化钠溶液）或PD-10脱盐柱去除未结合的染料，并将标记后的抗体重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中用于体内应用。
- 通过分光光度法测定最终抗体浓度和标记比率。
- 在250–330 nm波长范围内测定蛋白浓度时，需考虑染料的额外吸收。对于Cyanine7标记，应从280 nm处的最大吸收值中扣除750 nm处最大吸收值的11%，以校正蛋白在280 nm处的真实吸收。
- 测定化合物稀释液（通常为1:10）在250–800 nm范围内的吸收值，并提取750 nm处Cyanine7的浓度。
- 染料与蛋白比率计算公式如下：染料/抗体 = （750 nm处最大吸收值 / 200,000）/ [（280 nm处最大吸收值 - 0.11 × 750 nm处最大吸收值）/ 170,000]。
- 将抗体溶液保存于4 °C，避光存放，防止注射前发生光漂白。
- 在注射前立即用无菌注射器吸取所需抗体溶液，并在使用前保持避光。
- 根据示踪剂的药代动力学，确定探针注射与扫描程序的最佳时间点。
- 使用1.5–2.5%氧气混合的吸入式异氟烷麻醉小鼠，或将其稳妥固定于专用束缚装置中，以便进行尾静脉注射标记抗体。
- 对于全长抗体，应在扫描前至少24小时注射标记抗体，例如用于小鼠结肠炎模型中抗小鼠F4/80巨噬细胞的可视化。通过尾静脉静脉注射（i.v.）给予每只小鼠相当于2.0 nmol染料剂量的标记抗体。
- 使用相同标记的非特异性抗体（例如，大鼠IgG或与一抗来源相对应的其他同型抗体）作为同型对照，剂量与特异性探针一致。
注意：体内注射对照化合物后的扫描结果可作为解释特异性探针成像数据的参考依据。 - 使用电动剃刀剃除小鼠腹部区域的毛发，以最大限度减少光的反射和吸收。
- 按照制造商说明书，将目标抗体（例如，大鼠抗小鼠F4/80）标记荧光染料（例如，Cyanine7，λexcitation：750 nm，λemission：776 nm）。将纯化的抗体置于适当的透析膜（截留分子量 < 50-100 kDa）中，用1 L 0.15 M氯化钠溶液透析至少2小时或过夜。
2. 技术设备
- 使用兽用荧光介导断层成像（FMT）设备进行小动物荧光成像 图4).
- 为每个项目点击创建一项新研究 "新研究" 按钮，并在研究描述中包含相关示踪剂信息，以及成像参数和剂量，以供将来参考。
- 在本研究中，根据相应研究设计建立研究分组（例如， 针对特异性示踪剂和非特异性同型对照）通过点击 "新研究组" 按钮。为每个研究组配备相应数量的动物。
- 校准示踪构建体的系统。
- 对每批示踪剂进行校准，以校正标记效率的差异，并实现从光学成像数据中进行定量测量。
- 遵循仪器制造商关于各个系统校准的指导说明；在选定后 "添加新的示踪剂，" 系统将引导完成各个步骤。提供所用抗体溶液的稀释倍数以及探针中示踪剂的计算绝对浓度。
- 对于FMT，使用具有确定厚度和吸收特性的仿组织模型（类似活体组织），并用特定体积的抗体溶液填充。在FMT设备上进行测量。
注意：该系统将结合所提供探针的参考测量值与给定浓度，计算后续实验中示踪剂的绝对浓度 体内 测量。
- 使用可加热的检查盒，温度设置为 42 °C。
注意：这可以防止小鼠在检查过程中出现低体温。
3. 动物麻醉
- 使用1.5–2%体积浓度的异氟烷（[2-氯-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷]）与1.5 L/min的氧气，持续通气2/min 以麻醉小鼠。使用专为啮齿类动物麻醉设计的吸入式麻醉系统（异氟烷蒸发器），以便轻松控制麻醉深度，并最大限度减少对操作人员的暴露。
- 将小鼠放入防漏的诱导室中，打开异氟烷蒸发器（100% (v/v)，5% 体积浓度氧气，3 L/min）。持续观察小鼠，直至其侧卧且失去意识。
- 将其置于断层扫描用检查暗盒中，通过鼻罩持续吸入异氟烷，剂量为100% v/v，1.5 vol% 溶于氧气，流速1.5 L/min，以尽量减少检查过程中因动物移动产生的伪影。对于持续时间超过5分钟的操作，需在小鼠眼部涂抹眼膏，以防止角膜损伤。
- 通过检查反射评估麻醉深度。将小鼠仰卧放置；若麻醉充分，小鼠不应翻转体位。轻捏小鼠脚趾间部位；若麻醉充分，其腿部不会回缩（达到外科手术耐受阶段）。
4. 荧光介导断层扫描
注意：根据所使用的替代荧光反射成像设备或FMT系统，对本研究中FMT系统的具体参数（见材料表）进行相应调整。
- 将麻醉后的小鼠仰卧放置于检测盒中。
- 执行扫描程序。
- 将检测盒插入成像系统并立即关闭，以确保持续麻醉。从先前创建的研究组中选择相应的样本。从下拉菜单中选择所使用的示踪剂，以确保示踪剂浓度值被正确计算。
- 在适当波长下（Cyanine7 为 720 nm）获取荧光反射图像用于扫描规划，并通过点击 "获取图像" 按钮划定扫描区域。
- 确认扫描区域作为叠加层显示在荧光反射图像上。将其调整至感兴趣区域（e.g., 结肠或腹部），避免包含空气或残留毛发的区域。根据成像目标，在右侧菜单中选择粗、中或精细扫描分辨率，以设定扫描区域内数据点的数量。
注意：请注意，精细扫描分辨率虽可提供更高的空间分辨率，但会显著延长扫描时间。 - 通过点击 "扫描" 开始在选定波长下进行数据/图像采集。
注意：对整个腹部进行中等至精细扫描所需时间约为 5 分钟；在此期间，每个数据点将被激发激光单独照射，并记录所产生的荧光信号。 - 扫描结束后将动物从成像盒中取出，并在将其放回笼子前确保其完全恢复。
- 若实验需要，可在不同时间点重复进行 FMT 扫描（e.g., 第 0、5 和 9–10 天（实验结束时）），但需考虑抗体在体内的累积效应，这可能导致背景荧光信号增强。
5. 扫描后处理
- 将小鼠置于单独的笼子中，笼下垫有纸巾，并放置于红光加热灯下，监测小鼠是否出现不适或痛苦迹象，直至完全恢复。待小鼠完全清醒后，将其放回原有笼具中。
- 实验结束时，通过输送 CO 对小鼠实施安乐死2 以100%（v/v）、100 vol%、3 L/min的剂量通入隔离器中。切勿用CO预充满腔室2, 突然暴露于高浓度CO2 可能会引起痛苦。在小鼠停止呼吸后，需通过二次安乐死方式（如快速颈椎脱位）确认其死亡。
- 通过腹部剖腹手术取出结肠并进行 离体 按照步骤4.2.1–4.2.4所述，对取出的结肠进行扫描。使用梅岑鲍姆手术剪纵向切开每个结肠，并用生理盐水彻底冲洗，然后进行后续分析的准备工作。
- 使用手术刀从远端结肠切取一段0.5 cm的组织片段，并立即放入1.5 mL冻存管中。置于液氮中速冻，随后于-70 °C保存备用。例如，髓过氧化物酶（MPO）检测
- 使用木棒从远端向近端卷起其余纵向打开的结肠，使黏膜朝外（"瑞士卷技术"），用于组织学分析。将样本置于固定剂中（参见 材料表）并在 -80 °C 冻存14.
6. 数据重建与解读
- 使用相应成像软件的重建工具，从原始成像数据生成荧光分布的三维图谱；扫描时若启用该功能，扫描数据将自动添加至重建工具中 "添加到重建队列" 被选中。
- 否则，从相应研究及研究组下方的下拉菜单中选择扫描图像，右键单击该扫描图像，然后选择 "添加到重建中。"
- 为进一步分析，将数据集载入分析软件。从顶部工具栏的下拉菜单中选择相应研究，然后从右侧菜单中选择研究组别及个体动物；该动物的所有扫描数据将显示出来。选择正确的扫描图像并点击 "加载"
注意：示踪剂分布的三维重建结果将作为叠加图像显示在左侧，与最初获取的荧光反射图像重合。该模型可旋转和放大，以便于分析。 - 识别非特异性标记物聚集的焦点（例如， 肝脏或尿 bladder）在重建的3D图谱上，并与目标组织区分开例如， 肠道
- 从顶部工具栏中选择最适合目标区域的ROI形状。在分析软件中使用相应的测量工具标记目标组织为感兴趣区域（ROI）；软件将提供该ROI的荧光强度，以及根据扫描校准所得到的示踪剂（皮摩尔或摩尔）含量。
- 选择在适当ROI中经ROI大小归一化的示踪剂总量，作为评估疾病活动性（与炎性浸润相关，组织学）的最合适指标。
注意：如果其他 ROI 特征适合代表特定模型，也可选择使用。
7. 离体 分析
- 苏木精和伊红染色以及免疫荧光染色
- 将切片置于70%乙醇（EtOH）中2分钟以脱蜡；随后用蒸馏水冲洗。用苏木精溶液染色5分钟，再用温自来水冲洗10分钟。
- 用蒸馏水冲洗，用伊红溶液复染2分钟，再用蒸馏水冲洗。
- 置于70% EtOH、96% EtOH、99% EtOH和二甲苯（两次）中各2分钟，以脱水并透明切片。用树脂封片剂封片。
- 免疫荧光染色
- 使用先前获得的组织切片（"瑞士卷"用于免疫荧光染色，并制备7 µm的冷冻切片。
- 用5.0%大鼠血清封闭丙酮固定的冷冻结肠切片，10分钟；随后加入稀释（1/500，v/v）的生物素标记的大鼠抗小鼠F4/80一抗，4 °C孵育过夜。用Tris缓冲盐水（TBS）洗涤切片3次，再在含0.1%（w/v）牛血清白蛋白的PBS中加入链霉亲和素-FITC（1:100，v/v），4 °C孵育过夜。
- 用 TBS 清洗切片，然后使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1000 v/v）染色以获得对比度。在共聚焦显微镜下分析荧光图像（参见 材料表；40倍放大；使用激发波长为515 - 560的N2.1滤光片组，计数每高倍视野中F4/80阳性细胞数。
注意：联合使用抗体时，建议采用相同克隆号和相同形式的抗体 体内 FMT 和 死后 组织学分析，如免疫组织化学或免疫荧光染色，具体方法取决于目标分子。用于检测F4/80阳性巨噬细胞 体内 和 离体，使用了不同的格式。
- 结肠样本中MPO的测定
- 使用新鲜获取的、经 PBS 冲洗的结肠样本或解冻后的标本进行 MPO 检测。称量所有样本，并在 ELISA 试剂盒提供的裂解缓冲液中匀浆组织（参见 材料表每毫克组织加入20 µL裂解缓冲液。
- 超声处理15秒（超声频率：20 kHz，功率：70 W），然后在4 °C、200 × g条件下离心10分钟。
- 使用市售的ELISA试剂盒（参见 材料表）按照制造商说明书进行操作。实验重复两次。
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结果
结肠炎的评估：
DSS诱导的结肠炎是一种化学诱导的小鼠肠道炎症模型，类似于人类炎症性肠病（IBD），可在易感小鼠中引起体重减轻、直肠出血、浅表溃疡和黏膜损伤15研究先天免疫系统在肠道炎症发生发展中的作用时，该方法尤为有用10,11为了强烈诱导结肠炎性炎症，小鼠在整个实验过程中持续给予DSS。体重下降和粪便隐血作为炎症的临床指标。如图所示 图1A小鼠在结肠炎诱导后第4天开始出现体重下降，而仅接受水的对照组动物体重无明显变化。此外，结肠炎动物粪便中隐血排出量增加（图1B)，根据以下隐血评分系统进行评估：0分（无出血）、1分（隐血试验阳性）、2...
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讨论
尽管近年来医学成像技术发展迅速，但我们仍然难以在炎症过程、肿瘤以及其他疾病发展的最早阶段对其进行检测。然而，这对于理解肿瘤的生长、侵袭或转移形成，以及炎症性疾病和退行性、心血管及免疫系统疾病中细胞过程的发展至关重要。传统成像技术依赖于物理或生理参数，而分子成像则能够实现对特定分子标志物在体内的可视化in vivo20。
在小动物成像中，可利用放射性核素驱动的方法（例如，单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET））、超声成像以及荧光介导成像来可视化特定的分子靶标结构。由于全长抗体作为最常用的示踪剂骨架具有较长的血液循环时间和缓慢的组织渗透性，导致示踪剂注射后成像时间延迟，因此需要持久的标记。典型的成像用放射性核素因而并不适用于抗体分布的体内成像。使用半衰期较长的同位素（如Cu64或In111）虽可实现基于抗体的示踪，但需要复杂的基础设施，涵盖同位素制备、标记过程前后辐射安全防护，以及探针注射后动物的屏蔽饲养。相比之下，更具成本效益且更安全的选择是荧光介导成像...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Sonja Dufentester 女士、Elke Weber 女士和 Klaudia Niepagenkämper 女士提供的出色技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 无苜蓿饲料 | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen 眼膏 | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| 葡聚糖硫酸钠（DSS） | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| 伊红 | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| 苏木精 | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek 包埋剂 | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | 组织学分析固定剂 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| 0.9% 氯化钠溶液 | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| 碳酸氢钠粉末 | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| 标准饲料 | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek 冷冻模具 | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult（愈创木脂纸检测） | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| 生物素标记大鼠抗小鼠 F4/80 抗体 | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| 生物素标记大鼠抗小鼠 GR-1 抗体 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| 链霉亲和素-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | 激发/发射最大值： 556/573 nm |
| TC 抗 CD11b 大鼠抗小鼠抗体 | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| 纯化抗小鼠 F4/80 抗体 | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC 标记抗 Ly6C 大鼠抗小鼠抗体 | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS 缓冲液 | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS 酯 | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA 试剂盒 | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 标记抗小鼠 F4/80 抗体 | BioLegend, London, UK | 123127 | 即用型标记抗体（替代方案） |
| 抗小鼠 F4/80 抗原 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | 即用型标记抗体（替代方案） |
| DMSO（二甲基亚砜） | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris 缓冲盐溶液（TBS） | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 设备 | |||
| FACS Calibur 流式细胞仪系统 | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 活体成像系统 | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 成像分析软件 | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | 包含于 FMT2000 | |
| Leica DMLB 荧光显微镜 | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | 超声匀浆器 |
| 一次性手术刀 10 号 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum 剪刀 14 cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| 5 ml 鲁尔锁注射器 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| 注射器针头 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon 管 50 ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
参考文献
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