用于检测与定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症的荧光介导断层成像技术

摘要

靶向特异性探针是分析多种疾病（例如，炎症、感染和肿瘤发生）中分子机制（如蛋白质表达）的一种创新工具。本研究描述了一种利用F4/80特异性荧光介导断层成像技术，对结肠炎小鼠模型中肠道巨噬细胞浸润进行定量三维断层评估的方法。

摘要

疾病的小鼠模型在科学研究中不可或缺。然而，许多诊断工具（如内窥镜或断层成像）在动物模型中并未常规使用。传统的实验检测通常依赖于 死后 和 离体 分析，从而避免了无法对个体进行重复随访检查的问题，并减少了研究所需的实验动物数量。荧光介导断层成像技术可实现对荧光探针的无创、可重复、定量、三维评估。该技术具有高灵敏度，并可利用分子标记物，从而实现对特定分子靶点的特异性检测与表征。特别是靶向探针，已成为研究炎症、自身免疫性疾病、感染、血管疾病、细胞迁移、肿瘤发生过程中基因激活与蛋白表达的创新工具， 等等本文中，我们为这一复杂的成像技术提供了逐步操作指南 体内 炎症的检测与表征即， 在一种常用的肠道炎症小鼠模型中，F4/80阳性巨噬细胞浸润。该技术也可应用于其他研究领域，例如免疫细胞或干细胞示踪。

引言

动物模型在科学研究中被广泛应用，许多非侵入性方法可用于监测疾病活动性和动物活力，例如体重变化的定量分析，或血液、尿液和粪便的检测。然而，这些仅是间接的替代性指标，且易受个体间差异的影响。通常需要通过组织标本的死后分析加以补充，而这阻碍了在多个时间点进行连续观察，以及对生理或病理过程进行在体直接观察。近年来发展出一系列先进的小型动物成像技术，包括断层成像、光学成像和内窥镜技术，这些技术能够直接可视化上述过程，并允许对同一只动物进行重复分析^1,2,3。此外，能够在同一只动物身上反复监测多种疾病状态，可能减少实验所需动物数量，从动物伦理的角度来看，这一点具有重要意义。

目前存在多种不同的光学成像技术用于活体荧光成像。最初，共聚焦成像被用于研究表面及次表面的荧光现象^4,5。然而近年来，已开发出可实现定量三维组织评估的断层成像系统⁶。这一进展得益于能够在近红外（NIR）光谱范围内发射光的荧光探针的发展，同时结合了低吸收特性、高灵敏度探测器以及单色光源^....

方案

所有动物实验均根据德国动物保护法（Tierschutzgesetz）获得北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（LANUV）的批准。

1. 材料与实验设置

1. 动物护理。
   1. 使用体重为20-25 g、性别和年龄相匹配的任何对DSS敏感品系的小鼠（例如，C57BL/6）。
   2. 每个实验组至少计划使用五只或更多小鼠，并根据当地动物护理指南进行饲养。
   3. 提供标准啮齿类动物饲料和高压灭菌的饮用水，自由摄取（ad libitum）。
   4. 在扫描前至少三天，移除标准饲料并替换为无苜蓿饲料，以减少管腔内自发荧光。
2. 急性DSS诱导结肠炎的建立。
   1. 将2 g DSS（分子量约40,000 Da）溶解于100 mL高压灭菌饮水中，配制成2%（w/v）溶液。
   2. 仅向小鼠提供该DSS溶液作为饮用水，每只小鼠每日预计消耗5 mL。对照组小鼠则给予不含DSS的相同饮用水¹⁰。
      注意：实验期间每日监测小鼠状态直至实验结束。根据当地适用的动物福利指南，对体重减轻超过初始体重20%或出现濒死状态（即持续弓背姿势、活动减少、呼吸困难、毛发....

结果

结肠炎的评估：

DSS诱导的结肠炎是一种化学诱导的小鼠肠道炎症模型，类似于人类炎症性肠病（IBD），可在易感小鼠中引起体重减轻、直肠出血、浅表溃疡和黏膜损伤¹⁵研究先天免疫系统在肠道炎症发生发展中的作用时，该方法尤为有用^10,11为了强烈诱导结肠炎性炎症，小鼠在整个实验过程中持续给予DSS。体重下降和粪便隐血作为炎症的临床指标。如图所示 图1A小鼠在结肠炎诱导后第4天开始出现体重下降，而仅接受水的对照组动物体重无明显变化。此外，结肠炎动物粪便中隐血排出量增加（图1B)，根据以下隐血评分系统进行评估：0分（无出血）、1分（隐血试验阳性）、2.......

讨论

尽管近年来医学成像技术发展迅速，但我们仍然难以在炎症过程、肿瘤以及其他疾病发展的最早阶段对其进行检测。然而，这对于理解肿瘤的生长、侵袭或转移形成，以及炎症性疾病和退行性、心血管及免疫系统疾病中细胞过程的发展至关重要。传统成像技术依赖于物理或生理参数，而分子成像则能够实现对特定分子标志物在体内的可视化in vivo²⁰。

在小动物成像中，可利用放射性核素驱动的方法（例如，单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET））、超声成像以及荧光介导成像来可视化特定的分子靶标结构。由于全长抗体作为最常用的示踪剂骨架具有较长的血液循环时间和缓慢的组织渗透性，导致示踪剂注射后成像时间延迟，因此需要持久的标记。典型的成像用放射性核素因而并不适用于抗体分布的体内成像。使用半衰期较长的同位素（如Cu64或In111）虽可实现基于抗体的示踪，但需要复杂的基础设施，涵盖同位素制备、标记过程前后辐射安全防护，以及探针注射后动物的屏蔽饲养。相比之下，更具成本效益且更安全的选择是荧光介导成像.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
无苜蓿饲料	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
Bepanthen 眼膏	Bayer, Leverkusen, Germany	80469764
葡聚糖硫酸钠（DSS）	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
伊红	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 4382
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Germany	B506
苏木精	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek 包埋剂	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583	组织学分析固定剂
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza, Verviers, Belgium	4629
0.9% 氯化钠溶液	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
碳酸氢钠粉末	Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany	S5761
标准饲料	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek 冷冻模具	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Hemoccult（愈创木脂纸检测）	Beckmann Coulter, Germany	3060
生物素标记大鼠抗小鼠 F4/80 抗体	Serotec, Oxford, UK	MCA497B
生物素标记大鼠抗小鼠 GR-1 抗体	BD Pharmingen, Heidelberg Germany	553125
链霉亲和素-Alexa546	Molecular Probes, Darmstadt, Germany	S-11225	激发/发射最大值：  556/573 nm
TC 抗 CD11b 大鼠抗小鼠抗体	Calteg, Burlingame, USA	R2b06
纯化抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend, London, UK	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	D9542
FITC 标记抗 Ly6C 大鼠抗小鼠抗体	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	553104
FACS 缓冲液	BD Pharmingen, Heidelberg, Germany	342003
Cy7 NHS 酯	GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany	PA17104
MPO ELISA 试剂盒	Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany	K 6631B
Cy5.5 标记抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend, London, UK	123127	即用型标记抗体（替代方案）
抗小鼠 F4/80 抗原 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Waltham, USA	45-4801-80	即用型标记抗体（替代方案）
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	67-68-5
异氟烷	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	792632
乙醇	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	64-17-5
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	A4612
Tris 缓冲盐溶液（TBS）	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	SRE0032
名称	公司	货号	备注
设备
FACS Calibur 流式细胞仪系统	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
FMT 2000 活体成像系统	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	FMT2000
True Quant 3.1 成像分析软件	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	包含于 FMT2000
Leica DMLB 荧光显微镜	Leica,  35578 Wetzlar, Germany	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Germany	HD 2070	超声匀浆器
一次性手术刀 10 号	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z692395-10EA
Metzenbaum 剪刀 14 cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany	22398330
5 ml 鲁尔锁注射器	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z248010
注射器针头	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany	Z192368
Falcon 管 50 ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070