荧光介导的断层扫描对巨噬细胞相关小鼠肠道炎症的检测和定量

Summary

目标特定的探针代表了一种用于分析分子机制的创新工具, 例如各种疾病的蛋白质表达 (例如,炎症、感染和肿瘤发生)。在这项研究中, 我们描述了一个定量的三维层析成像评估肠道巨噬细胞浸润的小鼠结肠炎模型使用 F4/80-specific 荧光介导的断层扫描。

Abstract

小鼠疾病模型对科学研究是必不可少的。然而, 许多诊断工具, 如内窥镜或断层成像, 在动物模型中并不经常使用。传统的实验读数通常依赖于宰后和前体分析, 从而防止个体的随访检查, 增加所需的研究动物数量。荧光介导的断层扫描使非侵入性的, 重复的, 定量的, 三维荧光探针的评估。它是高度敏感的, 并允许使用分子制造商, 这使得特定的检测和表征明确的分子目标。特别是, 有针对性的探针代表了一个创新的工具, 分析基因活化和蛋白表达在炎症, 自身免疫疾病, 感染, 血管疾病, 细胞迁移, 肿瘤,等。在这篇文章中, 我们提供了 step-by 的步骤说明, 对这种复杂的成像技术的在体内检测和定性的炎症 (即, F4/80-positive 巨噬细胞浸润) 在广泛使用的小鼠模型肠道炎症。该技术也可用于其他研究领域, 如免疫细胞或干细胞追踪。

Introduction

动物模型被广泛应用于科学研究, 许多非侵入性的程序都存在于监测疾病的活动和生命力, 如体重变化的量化或血液、尿液和粪便的分析。但是, 这些只是间接的代理参数, 也受个体的可变性。它们必须经常通过对组织标本的验尸分析来补充, 防止在重复的时间点进行连续观察, 并直接观察生理或病理过程在体内。成熟的小动物成像技术已经出现, 包括横断面成像, 光学成像和内窥镜, 这使这些过程的直接可视化, 也允许重复分析相同的动物^1,2,3. 此外, 在同一动物中反复监测各种疾病的可能性可能会减少所需的动物数量, 从动物伦理学的角度来看, 这可能是可取的。

几种不同的光学成像技术存在于体内荧光成像。最初, 共聚焦成像被用来研究表面和地下荧光事件^4,5。然而, 最近, 允许进行定量的三维组织评估的层析系统已经开发成⁶。这是通过开发荧光探针, 在近红外线 (近红外光谱) 频谱发出光, 提供低吸收, 灵敏的探测器, 单色光源⁷。虽然传统的切削成像技术, 如....

Protocol

根据德国动物保护法 (LANUV), 所有动物实验均经 Landesamt Natur、Umwelt 和 Verbraucherschutz (Nordrhein) Westfalen-Tierschutzgesetz。

1. 材料和实验装置

1. 动物护理。
   1. 使用性别和年龄匹配的任何 DSS 敏感株 (例如, C57BL/6) 在20-25 克体重的小鼠。
   2. 根据当地的动物保育指南, 计划每组至少五只小鼠, 并将小鼠置于家中。
   3. 提供标准的鼠粮和蒸压饮用水ad 随意。
   4. 在扫描前至少三天去除标准的 chow, 并将其换成无苜蓿草, 以减少腔荧光。
2. 急性 DSS 诱导的结肠炎。
   1. 溶解2克的 DSS (分子量〜 4万 Da) 在100毫升的蒸压饮用水中获得 2% (瓦特/v 溶液)。
   2. 只用 DSS 解决方案来填满小鼠的饮水供应, 并估计每只老鼠每天5毫升液体。提供相同的饮用水没有 DSS 的控制小鼠¹⁰。
      注意: 每天监测老鼠直到实验结束。根据当地适用的动物指南, 安乐的老鼠会失去超过20% 的初始体重或变得奄奄一息 (即....

Results

结肠炎的评估:

DSS 诱导的结肠炎是一种化学诱导的小鼠肠道炎症模型, 类似于人 IBD, 导致体重下降, 直肠出血, 表面溃疡, 和粘膜损害的敏感的老鼠¹⁵。研究先天免疫系统对肠道炎症发育的贡献特别有用^10,11。为了能诱发 colitic 炎症, 小鼠在整个实验过程中都被连续地管理 DSS。降低体重和粪便潜血作为炎症的临床指标。如图 1A所示, 小鼠在结肠炎诱导后四天开始减肥, 而仅接受水的控制动物体重则没有明显的变化。此外, colitic 动物的粪便 (图 1B) 的排泄量增加, 使用以下 hemoccult 评分系统评估: 0 .......

Discussion

尽管近年来医学成像技术发展迅速, 但在早期的发育阶段, 我们在检测炎症过程或肿瘤以及其他疾病方面的能力仍然有限。然而, 这对于了解肿瘤的生长, 侵袭, 或转移的发展和细胞过程中的炎症性疾病和退化, 心血管和免疫疾病的发展至关重要。虽然传统的成像技术依赖于物理或生理参数, 分子成像使特定分子标记的可视化在体内²⁰。

对于小动物的成像, 放射性核素驱动的方法 (例如, s单身光子发射计算机断层扫描 (SPECT) 和正电子发射断层扫描 (PET)), 超声, 和荧光介导的成像可以用来可视化特定分子靶结构。使用全长抗体作为最有效的示踪骨架, 需要持久的标签, 因为长循环时间和缓慢的组织穿透延迟成像的时间后, 示踪剂应用。因此, 典型的成像放射性核素不适合于体内的抗体分布成像。使用运行同位素, 如 Cu64 或 In111, 使抗体示踪剂, 但要求一个复杂的基础设施跨越同位素生成, 辐射安全之前和期间的标记程序, 和保护动物住房后, 探针的应用。更 cost-effective 和更安全的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
无紫花苜蓿饮食	Harlan Laboritories，美国麦迪逊	2014
Bepanthen 眼膏	拜耳，勒沃库森，德国	80469764
葡聚糖硫酸钠 （DSS）	TdB 咨询，瑞典乌普萨拉	DB001
曙红	西格玛 - Aldrich，戴森霍芬，德国	E 4382
乙二胺四乙酸 （EDTA）	Sigma - Aldrich， Deisenhofen， 德国	E 9884
Florene 100V/V	Abbott， Wiesbaden， Germany	B506
苏木精	Sigma - Aldrich， Deisenhofen， Germany	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek 化合物	Sakura， Zoeterwonde， 荷兰	4583	用于组织学分析的固定剂
磷酸盐缓冲盐水，PBS	Lonza，Verviers，比利时	4629
氯化钠 0,9%	Braun，Melsungen，德国	5/12211095/0411
碳酸氢钠粉末	Sigma Aldrich Deisenhofen，德国	S5761
标准饮食	Altromin，Lage，德国	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura， 莱顿， 荷兰	4566
Hemoccult （愈创木杆试纸）	Beckmann Coulter， 德国	3060
生物素大鼠抗小鼠抗 F4/80 抗体	Serotec， 英国牛津	MCA497B
生物素大鼠抗小鼠抗 GR-1	BD Pharmingen，德国海德堡	553125
Streptavidin-Alexa546	Molecular Probes，德国达姆施塔特	S-11225	最大激发/发射波长：  556/573nm
抗CD11b大鼠抗小鼠抗体TC	Calteg，美国伯灵格姆	R2b06
纯化的抗小鼠F4/80抗体	BioLegend，英国伦敦	123102
DAPI	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	D9542
FITC偶联的抗Ly6C大鼠抗小鼠抗体	BD Pharmingen，德国海德堡	553104
FACS缓冲液	BD Pharmingen，德国海德堡	342003
Cy7 NHS酯	GE Healthcare 欧洲，德国弗莱堡	PA17104
MPO ELISA	Immundiagnostik AG，德国本斯海姆	K 6631B
Cy5.5 标记的抗小鼠 F4/80 抗体	BioLegend，英国伦敦	123127	即用型标记抗体（替代药物）
抗小鼠 F4/80 抗原 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience，美国沃尔瑟姆	45-4801-80	即用型标记抗体（替代）
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	67-68-5
异氟烷	Sigma-Aldrich，德国	792632
乙醇	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	64-17-5
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	A4612
Tris 缓冲盐水溶液 （TBS）	Sigma-Aldrich，德国戴森霍芬	SRE0032
名称	公司	目录号<	strong>评论
>设备
FACS Calibur流式细胞仪系统	BD Biosciences GmbH，德国海德堡
FMT 2000 活体成像系统	PerkinElmer Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	FMT2000
True Quant 3.1 成像分析软件	PerkinElmer Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，	包含在FMT2000
Leica DMLB 荧光显微镜	Leica，  35578 Wetzlar，Germany	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin， 12207 Berlin， Germany	HD 2070	超声波均质器
一次性手术刀 No 10	Sigma-Aldrich， Deisenhoffen， Germany	Z692395-10EA
Metzenbaum 剪刀 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH， Geislingen， Germany	22398330
鲁尔锁注射器 5ml	Sigma-Aldrich， Deisenhoffen，德国	Z248010
注射器针头	Sigma-Aldrich， Deisenhoffen， 德国	Z192368
Falcon 管 50ml	BD Biosciences，Erembodegem，比利时	352070