利用一种新型转座子介导的方法确定 Escherichia coli 中 DNA 元件的最佳染色体位置

摘要

在此，利用转座子介导的非编码DNA元件随机插入，确定了其在染色体上的最佳位置。

摘要

通过转座子介导的随机插入结合适合度筛选，确定了特定DNA元件的最优染色体位置。在细菌中，遗传背景对遗传元件功能的影响可能难以评估。多种机制，包括拓扑效应、邻近基因的转录干扰和/或与复制相关的基因剂量效应，均可能影响特定遗传元件的功能。本文描述了一种方法，可将DNA元件随机整合到大肠杆菌（Escherichia coli）染色体中，并通过简单的生长竞争实验筛选出最有利的插入位点。该方法利用了一种已被充分表征的基于转座子的随机插入系统，并结合生长优势筛选最具适应性的克隆，此流程可根据实验需求灵活调整。可通过复杂多克隆群体的全基因组测序，或通过简便的基因步行法快速鉴定所筛选克隆，从而确定最优克隆的性质。本文以非编码DNA区域DARS2为例，该区域调控大肠杆菌（E. coli）染色体复制的起始。已知DARS2的功能受复制相关基因剂量的影响：DARS2越接近DNA复制起点，其活性越高。将DARS2随机插入至缺失DARS2的菌株染色体中，将获得的各个插入克隆混合后进行数百代的竞争生长。最终对最具适应性的克隆进行表征，发现其DARS2插入位置接近原始DARS2的天然位点。

引言

任何遗传元件的功能都可能受到其在基因组中位置的影响。在细菌中，这种影响主要源于邻近基因转录的干扰、局部DNA拓扑结构以及与复制相关的基因剂量效应。特别是，DNA复制和分离过程至少部分由非编码染色体区域控制¹，而这些区域的正常功能依赖于其基因组位置或上下文环境。在E.coli中，典型的例子包括：用于姐妹染色体分离的dif位点²；染色体分离所必需的KOPS序列³；以及对染色体复制调控至关重要的datA、DARS1和DARS2区域（见下文；⁴）。本文介绍一种方法，可用于对任意给定遗传元件进行随机重定位、筛选并确定其最佳遗传环境，本文以研究DARS2非编码区域为例进行说明。

在 大肠杆菌， DnaA 是负责在单一复制起点处打开 DNA 链的起始蛋白oriC以及解旋酶 DnaB 的招募^5,6,7DnaA 属于 AAA 家族⁺ (即， 与多种活性相关的ATP酶（ATPases associated with diverse activities）蛋白，能够以相似的高亲和力结合ATP和ADP⁵DnaA 的水平^ATP 起始峰⁸，其中 DnaA^ATP 形成多聚体于 oriC 触发DNA双链解旋⁹启动后， oriC 由于SeqA蛋白与半甲基化DNA结合的机制导致其被隔离，从而暂时无法重新启动复制 oriC^10,11在封存期间，DnaA 的水平^ATP 通过至少两种机制被降低：DnaA的调节性失活（RIDA）^12,13 和 datA依赖型 DnaA^ATP 二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）^14,15RIDA 和 DDAH 均促进 DnaA 的转化^ATP 到 DnaA^ADP在新一轮起始之前，DnaA^ADP 重新激活为 DnaA^ATP 在特定的DnaA再激活序列（DARS): DARS1 和 DARS2^16,17染色体 datA, DARS1,和 DARS2 区域为非编码区，以类似分子伴侣的方式调控 DnaA^ATPDnaA^ADP 相互转化。这些区域位于复制起点之外，能够组装DnaA复合物，以实现失活（datA;¹⁴）或激活（DARS1 和 DARS2;¹⁷DnaA 的缺失。 DARS2 细胞中的质量倍增时间不受影响，但导致复制起始的异步性^15,16,18。然而， DARS2与在丰富培养基中连续生长竞争或在小鼠肠道定植建立过程中相比，缺陷型细胞相较于其他方面同基因型的野生型细胞具有适应性代价¹⁸这表明，即使异步性/起始浓度发生轻微变化，也会对细菌的适应性产生负面影响。在 大肠杆菌，存在维持染色体对称性的选择压力（即， 两条长度几乎相等的复制臂¹⁹。该 datA, DARS1，以及 DARS2 区域具有相同的相对距离 oriC 在所有情况下 E. coli 测序菌株¹⁸尽管染色体大小存在较大差异。

这里，我们使用 DARS2 区域 E. coli 作为确定其功能最佳染色体位置的示例。 DARS2 插入到 NKBOR 转座子中，得到 NKBOR::DARS2 转座子随后随机插入到 MG1655 Δ 的基因组中DARS2因此，我们建立了一个细胞群，每个细胞均具备 DARS2 位于染色体上不同位置的。一个 体外 竞争实验，即将文库中的所有细胞混合后在LB培养基中连续共同培养约700代，使它们相互竞争。通过Southern印迹、简易基因步移和全基因组测序（WGS）监测/确定竞争实验的结果。 图1）。通过简易基因步移法获得的末端克隆采用流式细胞术进行表征，以评估细胞周期参数。在流式细胞术分析中，可对大量细胞的细胞大小、DNA含量和起始同步性进行测量。在流式细胞术过程中，单个细胞流经适当波长的激光束，激发经染色的DNA，所产生的荧光信号由光电倍增管同步接收，荧光强度反映DNA含量，前提是细胞已进行DNA染色。前向散射光则反映细胞质量。²⁰.

该 体外 我们在此介绍的竞争实验可用于探究遗传元件的染色体位置及基因组环境的重要性。该方法无偏倚且易于使用。

方案

1. 转座子文库的收集

注意：染色体 DARS2 位点被克隆至mini Tn10基于转座子的 NKBOR（位于 pNKBOR 上）²¹，导致 NKBOR::DARS2 (pJFM1)。pNKBOR 可在线获取²²pNKBOR 是一种基于 R6K 的自杀型载体，其复制需要起始蛋白 π²³质粒pJFM1因此能够在 大肠杆菌 菌株（例如， Dh5α λ pir）含有染色体拷贝的 pir 基因。然而，当pJFM1转化至缺乏Pir的野生型MG1655时，pJFM1无法复制，导致通过NKBOR::的随机插入产生卡那霉素抗性克隆被筛选出来DARS2 整合到细菌染色体中。为简便起见，这些称为 DARS2 插入。参见 图1 以图示方式展示该方法的示意图。

1. 从在37 °C下于Lysogeny肉汤（LB）中活跃生长的细胞制备电转化感受态MG1655 ΔDARS2²⁴。
2. 根据Gonzales et al.²⁴的方法将pJFM1电转化至电转化感受态MG1655 ΔDARS2中
   1. 将1 µg pJFM1（溶于1 µL水中）加入40 µL电转化感受态E. coli MG1655 ΔDARS2中，混匀后转移至预冷的无菌0.2 cm间隙电转杯中。将电转杯插入电穿孔仪腔室，设置参数为18 kV、500 Ω、25 µF；时间常数应约为5.0 ms，且不应出现电弧现象。
   2. 迅速将菌液悬浮于1 mL预温的LB肉汤中进行复苏，并转移至15 mL试管中。
   3. 在37 °C、有氧条件下孵育30分钟以使细胞恢复，此阶段不添加抗生素进行筛选。将菌液涂布于添加50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
3. 计数电转化后产生的菌落：一个菌落视为对应一次染色体转座子插入事件。
   注意：菌落可通过肉眼或菌落计数器进行计数。菌落数量与各克隆染色体中转座子之间的平均距离成反比。
4. 向每个平板中加入1 mL LB肉汤，洗下所有菌落；1 mL LB肉汤足以洗脱约100,000个菌落。可重复使用同一份1 mL LB肉汤以提高细菌浓度。将所有菌落收集至同一个50 mL离心管中。
5. 充分涡旋混匀该离心管，并冷冻保存起始材料（t = 0）。冷冻方法：在冰上将1 mL细胞悬液与1 mL 50%甘油混合，随后将离心管置于干冰中冷冻10分钟。待培养物完全冻结后，转移至-80 °C超低温冰箱中保存。
   注意：此步骤中预期细胞浓度至少为50,000 CFU/mL。

2. LB 培养基中的竞争实验

1. 从 -80 °C 冰箱中取出转座子文库，在冰上解冻。用移液器吹打混匀。
2. 将100 µL转座子文库转移至15 mL离心管中的10 mL LB培养基中。
3. 在37 °C、持续振荡（250 rpm）的条件下培养细胞，培养8小时至对数后期/稳定期（即， 光密度₆₀₀ = ~4.0）。可根据需要针对不同的生长条件调整这些参数。
4. 每约10个世代，将菌液群体通过连续转接到新鲜的预温培养基中进行传代。具体操作为：取10 µL上一轮的静止期培养物，接种至10 mL新鲜LB培养基中，继续培养8小时至进入静止期（即， 光密度₆₀₀ = ~4.0).
   注意：由于起始和结束时的光密度相同，1,000倍稀释相当于约10代的生长（2¹⁰ = 1,024）。细菌群体可直接接种至新鲜的预温培养基中，也可保存在0–4 °C（冰上）并于次日接种。本实验使用LB培养基，以确保在尽可能短的时间内获得最多的细胞倍增（倍增时间接近22分钟）。
5. 每经历100代竞争后，取5份1 mL样品，于-80 °C保存（具体操作见步骤3.3）。
6. 如果预期含有单个转座子插入的细胞之间的适合度差异较小，则应延长竞争持续时间；此处使用了700代（t = 700）。

3. 随时间监测竞争实验的Southern印迹分析

1. 通过使用特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，制备用于Southern印迹的探针（NKBOR的1-kb片段）：NKBOR_Probe_FW：gatgttggacgagtcggaat 和 NKBOR_Probe_RV：cgttacatccctggcttgtt。
   1. 先在98 °C孵育30秒进行初始变性。然后进行35个循环：98 °C 10秒，60 °C 30秒，72 °C 45秒。最后在72 °C延伸10分钟。
      注：PCR反应的模板为纯化的pNKBOR质粒²¹。
   2. 根据Smith²⁵的方法，使用随机引物系统将扩增产物用[α-32P]dATP进行标记。
2. 按照Løbner-Olesen和von Freiesleben²⁶的方法，分别在t = 0以及竞争实验至预计700代的若干时间点，提取总细胞DNA。
3. 使用PvuI酶切总细胞DNA，该酶在目标区域之外仅切割一次含有NKBOR的片段；每1 µg底物DNA完全消化需使用1单位的PvuI。
   注：探针将识别包含部分转座子及不同长度染色体DNA的片段，具体长度取决于插入位点。
4. 按照Løbner-Olesen和von Freiesleben²⁶的方法，使用0.7%琼脂糖凝胶进行Southern印迹。

4. 最适克隆的鉴定

1. 使用Harrison所述的简易基因步移法 等²⁷，以鉴定 DARS2 单克隆（在LB平板上分离）经过约700代竞争后的插入位点；Southern印迹中条带越多，为覆盖所有转座子插入位点所需的分离株数量就越多。
   1. 提取基因组DNA作为PCR模板。将细菌涂布于含有50 µg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 °C振荡培养过夜，随后取20 µL菌液加入200 µL经高压灭菌的蒸馏水中（或按照步骤3.2进行DNA纯化）。
      1. 涡旋混匀。在100 °C加热10分钟，然后以最大速度离心5分钟。将细胞裂解液保存于-20 °C，以备后续使用。
   2. 设计三对巢式引物，使其与所选转座子内的区域退火（参见 图2 （以图示形式展示PCR策略）。
      注意：设计巢式引物时，应确保巢式引物3最靠近转座子DNA已知的5'端，随后依次为巢式引物2和巢式引物1。巢式引物3与已知转座子DNA 5'端之间的距离应足够长，以实现从已知DNA序列到未知DNA序列的测序读长（用于确定染色体上转座子插入的具体位点）。对于NKBOR，所使用的巢式引物如下：pNKBOR_Nested3_RV：gcagggctttattgattcca，pNKBOR_Nested2_RV：tcagcaacaccttcttcacg，以及pNKBOR_Nested1_RV：actttctggctggatgatgg。同时使用含有已知限制性内切酶识别位点的随机引物。为确保获得结果，应至少使用两种不同的随机引物。限制性内切酶的限制性位点（例如，Sau3AI 和 HindIII）应位于3'端，其上游为十个随机碱基，因此引物序列为5'-NNNNNNNNNNGATC-3'和5'-NNNNNNNNNNAAGCTT-3' Sau3AI 位点 (GATC) 和一个 HindIII 酶切位点（AAGCTT），其中 N = A、T、G 或 C。
   3. 使用200 ng基因组DNA进行20 µL的PCR反应。初始变性在98 °C下孵育30 s。进行25个循环，每个循环包括98 °C变性30 s、50 °C退火15 s和72 °C延伸4 min。最终延伸在72 °C下进行10 min。引物对由Nested Primer 1与其中一个随机引物组成。
   4. 使用巢式引物2与第二次扩增中相同的随机引物组成引物对，以前一次反应产物1 µL作为模板进行扩增。
   5. 使用由巢式引物3和同一随机引物组成的引物对，重复步骤4.1.4。
   6. 将最终PCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并用溴化乙锭染色。切下100-800 bp范围内的条带，按照制造商说明书，使用任意商业化的DNA凝胶回收试剂盒提取DNA。将DNA溶解于15 µL水中。
      注意：溴化乙锭具有毒性，必须小心操作。
   7. 使用商业测序服务，以嵌套引物3（Nested Primer 3）作为测序引物，对前一步（步骤4.1.6）中分离出的条带进行Sanger测序。
2. 进行全基因组测序（WGS）。
   1. 对竞争实验期间采集的选定样品中提取的总DNA进行全基因组测序（WGS），具体方法参照Frimodt-Møller的描述 等⁴.
3. 进行测序分析。
   1. 使用 Bowtie2 将成对末端测序读段比对至紧邻 NKBOR 的 150 个 N 碱基连续序列（AF310136.1 1,904…2,204）²⁸ 种子子串之间的间隔（S,1,1.15）以及最大模糊字符数（L,0,0.9）。
   2. 选择比对后的读段，然后使用 blastN 重新比对至 MG1655 ref|NC_000913.3 和 NKBOR gb|AF310136²⁹
   3. 在MG1655-NKBOR连接处指定转座插入位点。

5. 流式细胞术

1. 收集样本用于流式细胞术。
   1. 通过使每种培养物保持在指数生长期至少10代来达到平衡。检测OD₆₀₀ 并确保其始终不超过0.3。
   2. 收集两种类型的流体样本。
      1. 对于利福平耗尽实验，将1 mL培养物转移至含有30 µL RIF-CEF（含300 µg/mL利福平和36 µg/mL头孢氨苄溶于12.5 mM NaOH中）的15 mL离心管中。在37 °C下振荡培养至少4 h。
         注意：利福平通过间接阻断染色体复制的起始，同时允许正在进行的复制轮次继续至终止。头孢氨苄抑制细胞分裂，导致复制耗尽（RIF-耗尽），并使染色体完全复制的细胞发生积累。完全复制的染色体数量等于使用利福平和头孢氨苄处理时的复制起始位点数量。²⁰.
      2. 对于指数生长期样品，将1 mL指数生长期培养物转移至预冷的1.5 mL离心管中，置于冰上。
2. 按如下步骤固定细胞。在4 °C下以15,000 × g离心5分钟收集细胞。将沉淀重悬于100 µL预冷的10 mM Tris（pH 7.5）中，加入1 mL预冷的77%乙醇。样品于4 °C保存，待用。
3. 按如下步骤对细胞进行染色。取100–300 µL固定后的细胞，于15,000 × g离心15分钟，收集细胞。弃去上清液，将沉淀重悬于130 µL缓冲液中 "DNA染色液" （90 µg/mL mithramycin，20 µg/mL ethidium bromide，10 mM MgCl₂，以及10 mM Tris（pH 7.5）。将样品置于冰上并避光；10分钟后即可用于流式细胞术分析。
   注意：除溴化乙锭和放线菌素外，也可使用其他DNA染料^30,31.
4. 通过流式细胞术分析确定每个细胞的复制起点数量、相对细胞质量及相对DNA含量。
   1. 按照先前所述方法进行流式细胞术³². 按照流式细胞仪制造商的说明，运行RIF-runout和EXP-samples. 对于经mithramycin和溴化乙锭染色的细胞，使用395 nm和440 nm的激发波长，并收集565 nm以上的荧光信号。
      1. 为确定相对细胞质量和相对DNA含量，对EXP样品进行检测，获得至少30,000个与细胞信号对应的单参数前向散射光-细胞数量直方图及荧光强度-细胞数量直方图。
      2. 利用前向散射光单参数分布测量细胞的平均相对质量。
         注意：前向散射光是细胞平均质量的测量指标²⁰.
      3. 利用荧光强度单参数分布测量平均DNA含量²⁰.
      4. 以平均DNA含量与平均细胞质量的比值确定DNA浓度²⁰.
   2. 确定每细胞中的复制起点数量。
      1. 运行 RIF-runout 样本，获得至少 30,000 个对应于细胞信号的事件的单参数荧光强度相对于细胞数量的直方图。
      2. 利用荧光强度单参数分布确定每个细胞中的染色体数目²⁰.
5. 计算非同步指数（Ai）。
   1. 根据 Løbner-Olesen 的方法计算 Ai 等³²，使用RIF-runout样本的荧光强度单参数分布及公式Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8)，其中fx表示具有x条完全复制染色体的细胞比例。当A值表明起始事件为异步时 >0.1.

结果

通过Southern印迹验证DARS2在转座子文库（t = 0）中是否随机分布于染色体上，并确认最适合的克隆能否随时间延续。Southern印迹使用从初始转座子库（t = 0）以及每约100代（共700代竞争过程）提取的DNA进行分析（图3）。实验中，各时间点的总细胞DNA均用PvuI限制性内切酶消化，该酶在探针未覆盖区域对转座子NKBOR::DARS2仅切割一次。Southern印迹使用放射性标记的DNA片段作为探针，该片段与NKBOR的一部分序列互补。如图3所示，初始的DARS2文库（t = 0）未出现明显的条带，表明DARS2在染色体上为随机插入。随着时间推移，初始大量DARS2克隆逐渐演变为仅有一个或少数几个持续存在的DARS2克隆（图3；t = 0至t = 70...

讨论

本方法利用前沿技术，回答关于遗传元件最佳基因组插入位点的难题。通过转座子介导的遗传元件随机插入，可快速、简便地获得数千个克隆，随后使这些克隆相互竞争，从而筛选出被研究遗传元件的最佳插入位置。即， 最适克隆

在此，将 DARS2 插入基于 mini-Tn10 的转座子 NKBOR 中。转座子的选择对于插入位点的下游分析至关重要。在转座子定向插入位点测序（TraDIS）实验中，已使用过多种不同的转座子，例如 mini-Tn5Km2³⁴，以及更常用的选择——Himar I Mariner 转座子^35,36（有关此内容的最新综述，请参见 van Opijnen 和 Camilli³⁶）。我们目标是获得 70,000 个初始随机插入的 DARS2，这相当于在 MG1655 基...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌的 Milli-Q 水		无
电穿孔比色皿，0.1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulser 电穿孔系统	Bio-Rad	165-2100
LB 肉汤	Thermo Fisher Scientific	12780029
LB 琼脂粉（Lennox L 琼脂）	Thermo Fisher Scientific	22700025
甘油	Thermo Fisher Scientific	17904
Fisherbrand 塑料培养皿	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc 冻存管	Sigma-Aldrich	V7634
Phusion 高保真 DNA 聚合酶（2 U/µL）	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000 Ci/mmol 10 mCi/mL，250 µCi	PerkinElmer	BLU012H250UC
DECAprime II DNA 标记试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1455
分光光度计  SF/MBV/03.32	Pharmacia
Hermle 离心机    SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich 离心机  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorf 管 1.5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorf 管 2.0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
氯化钠	Merck	6404
96% 乙醇	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
超纯苯酚	BRL	5509UA
氯仿	Merck	2445
核糖核酸酶 A II 型	Sigma-Aldrich	R5000
十二烷基硫酸钠（SDS）	Merck	13760
溶菌酶	Sigma-Aldrich	L 6876
异丙醇	Sigma-Aldrich	405-7
0.5 M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	10106801001
PvuI（10 U/µL）	Thermo Fisher Scientific	ER0621
UltraPure 琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	16500500
DNA 凝胶上样染料（6×）	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tris-硼酸-EDTA 缓冲液	Sigma-Aldrich	T4415
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E7637
盐酸	Sigma-Aldrich	433160
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	71687
Whatman 3MM 滤纸	Sigma-Aldrich	WHA3030931
SSC 缓冲液 20× 浓缩液	Sigma-Aldrich	S6639
Amersham Hybond-N+	GE Healthcare	RPN119B
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F8016
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma-Aldrich	PVP40
牛血清白蛋白 - 第 V 组分	Sigma-Aldrich	85040C
鲑鱼精来源的脱氧核糖核酸钠盐	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak  BioMax  X 射线胶片	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute  凝胶回收试剂盒	Sigma-Aldrich	NA1111
GenElute  PCR 纯化试剂盒	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  梯度 PCR 仪	Bio-Rad
SmartSpec Plus 分光光度计	Bio-Rad
利福平	Serva	34514.01
头孢氨苄	Sigma-Aldrich	C4895
mithramycin	Serva	29803.02
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	246964
Apogee A10 仪器	Apogee