通过节段性腺病毒-Cre感染建立结直肠癌基因工程小鼠模型的方案及其监测 通过 高分辨率结肠镜检查被介绍。
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本文内容
摘要
摘要
尽管基于肿瘤细胞注射的结直肠癌小鼠模型具有操作简便和成本低廉的优势，但其存在严重局限性，无法准确模拟肿瘤生物学行为及肿瘤细胞的播散过程。为克服这些局限性，已引入基因工程小鼠模型；然而，这类模型在技术上要求较高，尤其是在结肠等大器官中，若仅需诱导单个肿瘤时尤为困难。
因此，开发出了一种免疫健全的遗传工程小鼠结直肠癌模型，该模型可产生高度均一的肿瘤，适用于肿瘤生物学研究及治疗试验。肿瘤的发生通过在复合条件性突变小鼠中，对远端结肠进行手术性节段性腺病毒-cre（adeno-cre病毒）感染而启动。肿瘤可通过结肠镜检查方便地检测与监测。本文描述了结肠节段性腺病毒-cre感染的手术技术以及肿瘤的监测方法 通过 高分辨率结肠镜检查并展示由此发现的结直肠肿瘤。
引言
结直肠癌（CRC）仍然是西方国家癌症相关死亡的主要原因之一。1 尽管早期疾病患者的预后较好，但许多肿瘤在晚期才被诊断，此时尽管有多种治疗选择，预后仍然有限。2,3,4,5
目前大多数结直肠癌（CRC）小鼠模型依赖于将来源于细胞系或患者肿瘤的肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠体内6,7,8。这会导致局部肿瘤的形成，并且根据注射部位和所用肿瘤细胞的不同，有时还会出现转移性肿瘤9,10。然而，由此建立的异种移植模型存在重大局限性。这些模型必须在免疫缺陷小鼠中建立，因而排除了肿瘤与宿主免疫系统之间复杂的相互作用。此外，由于肿瘤间质来源于宿主细胞，人类肿瘤实质与小鼠间质之间的相互作用存在缺陷，因此不能真实反映疾病状态。使用小鼠来源的细胞系进行注射可避免这些缺陷。然而，目前可用的小鼠CRC细胞系极....
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方案
本研究所涉及的动物实验均经过机构和政府动物护理与使用委员会的独立审查和批准，并依照实验动物科学协会联合会（FELASA）的指南进行。已采取一切可能的措施以尽量减少动物痛苦，包括使用麻醉和镇痛措施，或在必要时实施提前安乐死。
1. 局部肿瘤诱导 通过 手术性腺相关病毒-cre感染
- 手术前动物准备
注意：几乎任何条件性（"floxed"）突变均可通过本方法诱导。建议使用与结直肠癌相关的基因突变，如 Apc、Kras 或 Tp53。Cre 重组效率取决于待切除片段的大小；较大的 floxed 序列切除效率较低。应通过 PCR 在肿瘤组织中确认所有等位基因的重组情况。- 为建立结直肠肿瘤，建议采用以下条件性等位基因杂交，作为结直肠癌（CRC）的基础模型（括号内为 MGI 数据库编号）：
Apctm2Rak (MGI: 3688435)16
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)17
Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)18 - 若需使用荧光报告等位基因（....
- 为建立结直肠肿瘤，建议采用以下条件性等位基因杂交，作为结直肠癌（CRC）的基础模型（括号内为 MGI 数据库编号）：
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结果
如果操作得当， > 85%的动物会形成肿瘤。本文所述手术操作的死亡率为 < 5%；结肠镜检查的死亡率几乎为零。在大多数小鼠中可检测到单个病灶；约30%的小鼠可检测到2至3个小型腺瘤，这些腺瘤通常在肿瘤诱导后2至3周内融合为单个肿瘤。
所形成肿瘤的表型和生物学行为高度依赖于动物的条件性突变。局部cre介导的Apc基因敲除足以诱导肿瘤发生，最初导致腺瘤，可在腺病毒注射后2-4周检测到，并在12-16周内进展为浸润性腺癌。若引入条件性致癌性Kras突变（Kras G12D），所形成的肿瘤将迅速进展为浸润性腺癌。当进一步加入致癌性Tp53 R172H突变时，肿瘤会快速进展为浸润性和转移性癌。生存期在很大程度上取决于肿瘤的基因型；肿瘤诱导后的中位生存期通常为80-200天。大多数病例的死亡原因是肿瘤生长引起的结肠梗阻。
可通过结肠.......
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讨论
尽管基于细胞系注射的经典结直肠癌（CRC）小鼠模型通常易于构建和维持，但其具有人为特性，无法完全模拟人类疾病。因此，人们开发了基因工程小鼠模型（GEMMs）。首个结直肠癌GEMM是ApcMin小鼠，该小鼠在Apc基因中携带一个杂合的无效突变，从而模拟人类遗传性疾病家族性腺瘤性息肉病（FAP）。21 然而，ApcMin小鼠 invariably 会发展出多个肠道腺瘤，且病变不仅局限于结肠；此外，腺瘤形成的时间和确切位置具有随机性，且肿瘤极少进展为恶性病变，因为小鼠往往在腺瘤进一步进展之前即因良性肿瘤负荷而死亡。因此，ApcMin小鼠是FAP的模型，而非散发性结直肠癌的模型。其他模型则携带DNA错配修复基因的突变。22,23 尽管其中一些小鼠是遗传性胃肠道癌症的优良模型，但它们并不能代表散发性结直肠癌。
除了潜在的遗传改变外，遗传损伤的位置是区分散发性和综合.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作献给 Moritz Koch 教授以示纪念。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/耗材 | |||
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%，酚红） | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 0.9%生理盐水（E154） | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| 注射用水 | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre（腺病毒，c = 2E+11 PFU/mL） | 基因转移载体中心 爱荷华大学 | ||
| 15 mL、50 mL 离心管 | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf管 1.5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| 培养皿 PS 100/15 mm（无菌，Nuclon） | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL 注射器（无死体积） - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G注射针 | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 镇痛 / 麻醉 | |||
| 七氟烷（Sevoflurane AbbVie） | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| 医用氧气 | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| 布托啡诺（Temgesic） | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - 眼科软膏 | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| 带氧气快速冲洗功能和七氟烷蒸发器的台式科研麻醉机 | 帕克兰科学 | V3000PS/PK | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 手术器械 | |||
| 纤维素拭子 | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| 胰岛素注射器 EMG 1 mL（带30G套管） | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| 细孔管（内径：0.28 mm；外径：0.61 mm） | 史密斯医疗德国分公司 | 800/100/100 | |
| 微型阿德森镊 | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| 虹膜剪 - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar持针器 | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip 试剂盒 | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1（外科缝线） | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| 弯曲微型微血管钳 | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty动脉夹 | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| 伊西斯 - 毛发剃除器 | Aesculap - Braun | - | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 结肠镜检查 | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | 卡尔·史托斯结肠观察系统，美因茨 |
| 光纤光源导管 | Karl Storz | 69495NL | 卡尔·史托斯结肠视图系统，美因茨 |
| TRICAM 三芯片摄像机头 | Karl Storz | 20221030 | 卡尔·史托斯结肠观察系统，美因茨 |
| TRICAM SLII 相机控制单元 | Karl Storz | 20223011-1 | 卡尔·斯托斯结肠观察系统，美因茨 |
| 15" 平板显示器 EndoVue | Karl Storz | 9415NN | 卡尔·史托斯结肠观察系统，美因茨 |
| HOPKINS 直视望远镜 直径 1.9 mm；长度 10 cm 可高压灭菌的 光纤光传输集成 | Karl Storz | 64301AA | |
| 保护与检查鞘管 | Karl Storz | 61029C |
参考文献
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al.
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