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方法文章

一种用于散发性结直肠癌的基因工程小鼠模型

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DOI：

10.3791/55952

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2017年7月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2Department of General, Gastrointestinal and Transplant Surgery, University of Heidelberg, 3Department of Pathology, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4German Cancer Consortium (DKTK), 5German Cancer Research Center (DKFZ)

本文内容

摘要

通过节段性腺病毒-Cre感染建立结直肠癌基因工程小鼠模型的方案及其监测 通过 高分辨率结肠镜检查被介绍。

摘要

尽管基于肿瘤细胞注射的结直肠癌小鼠模型具有操作简便和成本低廉的优势，但其存在严重局限性，无法准确模拟肿瘤生物学行为及肿瘤细胞的播散过程。为克服这些局限性，已引入基因工程小鼠模型；然而，这类模型在技术上要求较高，尤其是在结肠等大器官中，若仅需诱导单个肿瘤时尤为困难。

因此，开发出了一种免疫健全的遗传工程小鼠结直肠癌模型，该模型可产生高度均一的肿瘤，适用于肿瘤生物学研究及治疗试验。肿瘤的发生通过在复合条件性突变小鼠中，对远端结肠进行手术性节段性腺病毒-cre（adeno-cre病毒）感染而启动。肿瘤可通过结肠镜检查方便地检测与监测。本文描述了结肠节段性腺病毒-cre感染的手术技术以及肿瘤的监测方法 通过 高分辨率结肠镜检查并展示由此发现的结直肠肿瘤。

引言

结直肠癌（CRC）仍然是西方国家癌症相关死亡的主要原因之一。1 尽管早期疾病患者的预后较好，但许多肿瘤在晚期才被诊断，此时尽管有多种治疗选择，预后仍然有限。2,3,4,5

目前大多数结直肠癌（CRC）小鼠模型依赖于将来源于细胞系或患者肿瘤的肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠体内6,7,8。这会导致局部肿瘤的形成，并且根据注射部位和所用肿瘤细胞的不同，有时还会出现转移性肿瘤9,10。然而，由此建立的异种移植模型存在重大局限性。这些模型必须在免疫缺陷小鼠中建立，因而排除了肿瘤与宿主免疫系统之间复杂的相互作用。此外，由于肿瘤间质来源于宿主细胞，人类肿瘤实质与小鼠间质之间的相互作用存在缺陷，因此不能真实反映疾病状态。使用小鼠来源的细胞系进行注射可避免这些缺陷。然而，目前可用的小鼠CRC细胞系极少，且与大多数现有的人类CRC细胞系类似，具有单克隆性和高度未分化特征11。综上所述，目前大多数可用的CRC小鼠模型具有高度人工特性，无法完全代表人类疾病的真实情况。

结直肠癌（CRC）的基因工程小鼠模型（GEMMs）可避免上述缺点，因为这些模型具有真正的小鼠肿瘤，肿瘤通过在结肠中诱导CRC的关键突变而形成。12,13,14 这可通过在结直肠黏膜中利用Cre重组酶激活条件性（floxed）生殖系突变来实现。尽管在许多其他肿瘤类型的GEMMs中，通常使用组织特异性启动子驱动生殖系（可诱导）Cre表达，但在结肠中不能使用生殖系Cre，因为这会导致整个结肠出现大量腺瘤，使小鼠在很年轻时即因良性肿瘤负荷而死亡。因此，在本模型中，采用表达Cre的腺病毒载体感染一段较短的结肠节段。这使得肿瘤发生可在黏膜的该节段中由研究者定义的时间点被诱导，最终形成进展为浸润性和转移性癌的腺瘤。这些肿瘤为真正的小鼠肿瘤，在完整的微环境中生长，因此能够模拟整个结直肠肿瘤发生过程，包括肿瘤-宿主相互作用和转移级联反应。因此，该模型是癌症生物学研究和临床前治疗试验的理想平台。

结直肠癌（CRC）转基因小鼠模型的一个主要缺点是其技术复杂性。既往已有报道，在携带floxed Apc等位基因的小鼠中通过直肠给予腺病毒-cre灌肠来实现局部cre重组酶递送；然而，该方法所诱导的肠道肿瘤在发生率、多发性及位置分布上可能存在高度变异性。15 因此，已发展出一种通过手术夹闭目标肠段以限制腺病毒-cre感染范围的技术。13 我们对该方法进行了改良，旨在改善动物福利，同时降低死亡率并减少肿瘤数量。采用本方案后，所有具备小型啮齿类动物手术经验的实验室均应能够成功复制该模型，并获得高度可重复且便于进行结肠镜观察的肿瘤。根据用于肿瘤发生的条件性突变类型，可观察到从腺瘤、浸润性癌到转移的完整肿瘤谱系。由于肿瘤位于远端结肠，因此在此模型中可方便地进行系列内镜评估。

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方案

本研究所涉及的动物实验均经过机构和政府动物护理与使用委员会的独立审查和批准，并依照实验动物科学协会联合会（FELASA）的指南进行。已采取一切可能的措施以尽量减少动物痛苦，包括使用麻醉和镇痛措施，或在必要时实施提前安乐死。

1. 局部肿瘤诱导 通过 手术性腺相关病毒-cre感染

  1. 手术前动物准备
    注意：几乎任何条件性（"floxed"）突变均可通过本方法诱导。建议使用与结直肠癌相关的基因突变，如 Apc、Kras 或 Tp53。Cre 重组效率取决于待切除片段的大小；较大的 floxed 序列切除效率较低。应通过 PCR 在肿瘤组织中确认所有等位基因的重组情况。
    1. 为建立结直肠肿瘤，建议采用以下条件性等位基因杂交，作为结直肠癌（CRC）的基础模型（括号内为 MGI 数据库编号）：
      Apctm2Rak (MGI: 3688435)16
      Krastm4Tyj (MGI: 2429948)17
      Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)18
    2. 若需使用荧光报告等位基因（例如，用于检测微转移灶），请使用以下等位基因：
      Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)19
      注意：上述所有品系均可通过美国国家癌症研究所（NCI）小鼠资源库或杰克逊实验室获取。无需术前禁食，因所有残留粪便可在腺病毒感染前冲洗干净。术前禁食会增加围手术期死亡率，并对小型啮齿动物造成极大应激。
    3. 使用 3 - 3.5 vol% 的七氟烷进行全身麻醉。趾夹反射消失表明麻醉已充分。
    4. 在首次切口前，皮下注射 0.05 mg/kg 的丁丙诺啡。
    5. 用眼用软膏覆盖麻醉小鼠的眼睛，以防角膜干燥。
    6. 将小鼠仰卧置于小手术台上，使用无创性胶带固定小鼠。
    7. 使用电动剃刀剃除腹部毛发（也可使用脱毛膏），并用酒精棉片或碘伏消毒，遵循生产商推荐的接触时间。
    8. 用无菌手术巾覆盖手术区域。
      注意：围手术期是否使用抗生素取决于各机构指南，为可选操作。
    9. 所有外科操作均应使用无菌一次性或已灭菌的器械。
  2. 正中腹切开及结肠暴露
    1. 使用剪刀（也可使用手术刀）在下腹部正中切开皮肤，切口长约 15 mm。
    2. 用镊子提起腹壁肌肉组织，用剪刀小心剪开，从而打开腹腔。
    3. 辨认远端结肠，仅使用无创镊子接触。在距离肛门约 15 mm 处，使用精细夹钳（例如，Micro Serrefine 血管夹）夹闭结肠。
      注意：操作过程中须始终注意结肠的脆弱性。一旦穿孔，将不可避免地导致腹膜炎和败血症，需对动物实施安乐死。
  3. 结肠节段性腺病毒-cre 感染
    1. 经肛门插入一根柔韧的特氟龙导管，并小心推进，直至到达由先前在距肛缘 15 mm 处放置的夹钳所形成的肠腔闭塞位置。切勿施加过大压力，以免导致穿孔。
    2. 将导管连接至 30G 套管，再连接标准 1 mL 注射器，用生理盐水冲洗结肠，以清除残留粪便。此过程可能需要数毫升生理盐水。
    3. 待远端结肠排空后，取出导管，更换为新的特氟龙导管，并如上所述重新将其置于夹钳远端紧邻处。
    4. 在近端夹钳远侧约 3 mm 处（即，在插入的导管上方，距肛缘约 12 mm）使用第二个夹钳闭塞结肠，形成一个长约 3 mm 的隔离节段用于感染。
      注意：对于该节段的远端闭塞，Fogarty 冠状动脉夹最为适用，因其带有橡胶涂层，即使夹臂间存在导管，仍可实现结肠的紧密闭塞。
    5. 使用第二个注射器（标准 1 mL 注射器配 30G 套管），小心向夹闭的结肠节段注入 50 - 80 µL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 10 分钟。保持套管和注射器连接在特氟龙导管上，防止液体回流。
      注意：结肠需适度膨胀以破坏黏膜屏障并使隐窝干细胞暴露，但膨胀过度可能导致夹闭节段穿孔。
    6. 先移除远端夹钳，再取出胰蛋白酶导管。
    7. 用约 500 µL 生理盐水冲洗远端结肠，以清除残留的胰蛋白酶。
    8. 插入一根新的特氟龙导管，重新放置远端夹钳，向结肠节段内注入 50 - 80 µL 腺病毒溶液（磷酸盐缓冲液中含 1011 蚀斑形成单位（PFU）/mL），孵育 30 分钟（图 2A）。
      注意：切勿溢出病毒溶液，因腺病毒-cre 接触条件性突变小鼠的任何组织均可能导致肿瘤形成。
    9. 移除夹钳和导管。
  4. 腹腔关闭与术后恢复
    1. 使用 6-0 快速可吸收缝线（例如，聚对二氧环己酮（PDS））连续缝合腹壁。
    2. 使用外科伤口夹闭合皮肤。
    3. 将小鼠置于设定为 38 °C 的加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。
    4. 术后 12 小时腹腔注射 0.05 mg/kg 丁丙诺啡作为追加剂量，此后根据需要每 12 小时追加一次丁丙诺啡剂量 。
    5. 每天至少监测一次小鼠，观察因肿瘤生长导致的痛苦迹象。

2. 结肠镜检查

注意：根据所使用的条件性突变，腺病毒感染可在2至4周内导致内镜下可见的肿瘤。因此，建议在腺病毒诱导后2周进行首次术后结肠镜检查，并每2周重复一次。推荐使用 commercially available system 进行小鼠结肠镜检查。20

  1. 结肠镜检查前的动物准备
    注意：无需禁食。远端结肠内残留的粪便通常成形良好，在结肠镜检查过程中可将其推至肿瘤远端，从而避免反复禁食带来的应激反应。
    1. 使用3 - 3.5 vol%的七氟烷进行全身麻醉。趾夹反射消失表明麻醉深度足够。
    2. 用眼膏覆盖麻醉小鼠的眼睛，防止角膜干燥。
    3. 将小鼠仰卧位固定于小操作台上。
  2. 结肠镜检查
    1. 将内镜（直径1.9 mm，长度10 cm）经肛门插入肠道，在直视下小心充气以扩张结肠。充气量不应超过检查所需。
      注意：可使用结肠镜系统配备的防雾空气泵进行充气。若无防雾空气泵，也可使用其他极低压力设置的空气泵，或配备精密减压阀的加压空气。二氧化碳（CO2）易导致小型啮齿类动物发生酸中毒，因此必须避免使用。
    2. 小心推进内镜，直至在远端结肠观察到黏膜病变（图1A - 1D）。
    3. 保存内镜图像以供后续评估。已有文献报道用于管腔内肿瘤的内镜评分系统20。
    4. 小心撤出内镜，将小鼠置于设定为38 °C的加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。

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结果

如果操作得当， > 85%的动物会形成肿瘤。本文所述手术操作的死亡率为 < 5%；结肠镜检查的死亡率几乎为零。在大多数小鼠中可检测到单个病灶；约30%的小鼠可检测到2至3个小型腺瘤，这些腺瘤通常在肿瘤诱导后2至3周内融合为单个肿瘤。

所形成肿瘤的表型和生物学行为高度依赖于动物的条件性突变。局部cre介导的Apc基因敲除足以诱导肿瘤发生，最初导致腺瘤，可在腺病毒注射后2-4周检测到，并在12-16周内进展为浸润性腺癌。若引入条件性致癌性Kras突变（Kras G12D），所形成的肿瘤将迅速进展为浸润性腺癌。当进一步加入致癌性Tp53 R172H突变时，肿瘤会快速进展为浸润性和转移性癌。生存期在很大程度上取决于肿瘤的基因型；肿瘤诱导后的中位生存期通常为80-200天。大多数病例的死亡原因是肿瘤生长引起的结肠梗阻。

可通过结肠...

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讨论

尽管基于细胞系注射的经典结直肠癌（CRC）小鼠模型通常易于构建和维持，但其具有人为特性，无法完全模拟人类疾病。因此，人们开发了基因工程小鼠模型（GEMMs）。首个结直肠癌GEMM是ApcMin小鼠，该小鼠在Apc基因中携带一个杂合的无效突变，从而模拟人类遗传性疾病家族性腺瘤性息肉病（FAP）。21 然而，ApcMin小鼠 invariably 会发展出多个肠道腺瘤，且病变不仅局限于结肠；此外，腺瘤形成的时间和确切位置具有随机性，且肿瘤极少进展为恶性病变，因为小鼠往往在腺瘤进一步进展之前即因良性肿瘤负荷而死亡。因此，ApcMin小鼠是FAP的模型，而非散发性结直肠癌的模型。其他模型则携带DNA错配修复基因的突变。22,23 尽管其中一些小鼠是遗传性胃肠道癌症的优良模型，但它们并不能代表散发性结直肠癌。

除了潜在的遗传改变外，遗传损伤的位置是区分散发性和综合...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作献给 Moritz Koch 教授以示纪念。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/耗材
杜氏磷酸盐缓冲液Life Technologies GmbH14190169
胰蛋白酶-EDTA（0.25%，酚红）Life Technologies GmbH25200072
0.9%生理盐水（E154）Serumwerk Bernburg AG10013
注射用水B. Braun Melsungen AG235144
Ad5CMV-Cre（腺病毒，c = 2E+11 PFU/mL）基因转移载体中心
爱荷华大学
15 mL、50 mL 离心管Greiner Bio-One GmbH188271/227270
Eppendorf管 1.5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72,695,400
培养皿 PS 100/15 mm（无菌，Nuclon）Fisher Scientific GmbH10508921/ NUNC150350
1 mL 注射器（无死体积） - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G注射针BECTON DICKINSON304000
名称公司目录编号评论
镇痛 / 麻醉
七氟烷（Sevoflurane AbbVie）AbbVie Germany GmbH & Co. KG-
医用氧气Air Liquide Medical GmbH-
布托啡诺（Temgesic）Indivior Eu Ltd.-
Bepanthen - 眼科软膏Bayer Vital GmbH10047757
带氧气快速冲洗功能和七氟烷蒸发器的台式科研麻醉机帕克兰科学V3000PS/PK
名称公司目录编号评论
手术器械
纤维素拭子Lohmann & Rauscher Deutschland13356
胰岛素注射器 EMG 1 mL（带30G套管）B. Braun Melsungen AG9161627S
细孔管（内径：0.28 mm；外径：0.61 mm）史密斯医疗德国分公司800/100/100
微型阿德森镊Fine Science Tools11018-12
虹膜剪 - ToughCutFine Science Tools14058-11
Olsen-Hegar持针器Fine Science Tools12002-12
AutoClip 试剂盒Fine Science Tools12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1（外科缝线）Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
弯曲微型微血管钳Fine Science Tools18055-05
Fogarty动脉夹EdwardsCDSAFE 6
Hot Plate 062Labotect13854
伊西斯 - 毛发剃除器Aesculap - Braun-
名称公司目录编号评论
结肠镜检查
Cold Light Fountain XENON 175 SCBKarl Storz20132101-1卡尔·史托斯结肠观察系统，美因茨
光纤光源导管Karl Storz69495NL卡尔·史托斯结肠视图系统，美因茨
TRICAM 三芯片摄像机头Karl Storz20221030卡尔·史托斯结肠观察系统，美因茨
TRICAM SLII 相机控制单元Karl Storz20223011-1卡尔·斯托斯结肠观察系统，美因茨
15" 平板显示器 EndoVueKarl Storz9415NN卡尔·史托斯结肠观察系统，美因茨
HOPKINS 直视望远镜
直径 1.9 mm；长度 10 cm
可高压灭菌的
光纤光传输集成		Karl Storz64301AA
保护与检查鞘管Karl Storz61029C

参考文献

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