所述的水培共培养系统利用金属网筛支撑完整植物，并与细菌进行共培养。随后可分别收集植物组织、细菌及分泌的分子，用于下游分析，同时可对植物宿主及其相互作用的微生物或微生物组的分子响应进行研究。
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摘要
摘要
模拟自然植物-微生物相互作用的实验设计对于阐明复杂的植物-微生物信号传导过程至关重要。Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens 是研究细菌致病性及植物相互作用的优良模式系统。以往对植物-农杆菌相互作用的研究主要依赖于植物细胞悬浮培养、人为损伤植物组织，或通过合成化学物质人工诱导微生物毒力因子或植物防御反应。然而，这些方法与自然状态下的体内信号传导存在差异，在自然条件下，植物与微生物以时空特异性的方式相互识别并产生响应。本研究介绍了一种水培共培养系统，其中完整植株由金属网筛支撑，并与农杆菌进行共培养。在此共培养系统中，无需添加任何合成植物激素或可诱导微生物毒力及植物防御反应的化学物质。该水培共培养系统更接近于自然的植物-微生物相互作用以及体内信号稳态。植物根系可从含有农杆菌的培养基中分离，从而能够同时且系统地研究植物宿主与互作微生物双方的信号传导与响应过程。在任意设定的时间点或时间间隔，可分别采集植物组织或细菌，用于各种"组学"分析，充分体现了该系统的强大功能与高效性。该水培共培养系统可便捷地应用于以下研究：1）多种植物-微生物系统的双向信号交流；2）植物宿主与多种微生物物种之间的信号传递（即 微生物群落或微生物组）；3）营养物质和化学物质在植物-微生物信号传导中的作用；以及4）微生物如何与植物宿主互作，并促进植物对生物或非生物胁迫的耐受性。
引言
与植物相关的微生物在生物地球化学循环、生物修复、减缓气候变化、植物生长与健康以及植物对生物和非生物胁迫的耐受性方面发挥着重要作用。微生物通过与植物细胞壁直接接触，或通过化学分泌和信号传递间接地与植物相互作用1,2,3。作为固着生物，植物已进化出直接和间接机制以抵抗病原体的侵染。直接防御包括结构防御和防御蛋白的表达，而间接防御则包括次生植物代谢物的产生以及吸引对入侵病原体具有拮抗作用的生物体4,5。植物根系分泌物、渗出物、黏液、根冠黏胶和裂解产物会改变根际的理化性质，从而吸引或排斥微生物向其寄主聚集6。根系分泌物的化学成分具有物种特异性，因此可作为选择性过滤器，使某些能够识别这些化合物的微生物在根际中得以富集和增殖6。因此，相容的微生物种类可能被激活并增强其与植物的互作关系，这种关系可能对植物寄主有利，也可能有害1。
了解根际中植物与微生物的相互作用对于提高植物生产力和生态系统功能至关重要，因为大多数微生物和化学物质的接触都发生在根系结....
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方案
1. 实验设计
- 确定实验的具体目标。
- 通读以下完整方案，确定哪些步骤与具体目标相关，并判断是否需要进行任何修改。参见下文示例。
- 考虑实验是否将使用如下所述的A. thaliana植物和A. tumefaciens细菌，或其他植物-微生物组合。
注意：尽管可使用多种植物物种，但植物根系的厚度可能需要不同尺寸的网筛（步骤3.3），且生长参数（步骤3.10–3.11和4.4）、水培箱尺寸及培养基体积（步骤4.2）也可能需要调整（图2）。微生物可轻松以纯培养物、混合物种（群落）或环境样品（微生物组）形式接种，但任何更改均可能影响方案，尤其是步骤4.5。 - 考虑将用于分析样品的实验类型。
注意：荧光显微镜观察（步骤5）需要带有荧光报告基因构建体的标记生物。
- 考虑实验是否将使用如下所述的A. thaliana植物和A. tumefaciens细菌，或其他植物-微生物组合。
- 设计适当的对照。包括未接种细菌的空白幼苗水培箱，以及未接种细菌的对照幼苗水培箱。
- 根据所需种子数量和水培箱数量规划实验。需考虑对照组、生物学重复（至少3个）以及所有分析所需的组织量。
- 根据实验目标确定共培养的适当持续时间（步骤4.8）。
- 根据需要修改以下任何步骤。
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结果
水培共培养系统中的生长
生长曲线 A. tumefaciens C58在共培养的前16小时表现出显著的滞后期，随后在与 A. thaliana Col-0，最大 OD 值600 约0.9，起始于接种后48小时。相比之下，在未接种的对照培养物中几乎未观察到细菌生长 A. thaliana (图4这些结果表明，在无人工额外提供营养的情况下，植物根系分泌的化学物质能够支持 农杆菌 在水培共培养系统中的生长情况。共培养初期16小时显著的滞后期可能是由于宿主感知较为复杂，以及在与病原体共培养时根系分泌物逐渐释放所致。
共培养 A. thaliana 植物在最初3天内未表现出病害症.......
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讨论
鉴于根部分泌物的释放具有渐进性，其所产生的诱导毒力的化学物质浓度 在植株中 其对动态植物-微生物相互作用的影响在空间和时间梯度上发生。在此水培共培养系统中，不添加任何合成植物激素或诱导微生物致病性或植物防御反应的化学物质。相比之下，传统方法中添加乙酰丁香酮等合成化学物质会导致浓度突然且人为地升高。因此，该水培共培养系统更接近于自然环境，其中微生物与宿主植物以空间和时间依赖的方式进行识别与响应。
在此，可以证明 农杆菌 毒力基因在共培养条件下被激活 拟南芥这表明天然植物来源的化学物质可诱导 农杆菌 毒力。未来需要进一步努力以鉴定这些化学物质，并验证毒力诱导化合物乙酰丁香酮是否在其中。此外，发生显著变化的 拟南芥 共培养后观察到根部基因表达和分泌组特征 农杆菌展示了水培共培养系统在研究植物宿主响应及植物-微生物互作过程中分泌谱方面的潜力。事实上，利用水培共培养技术，可在微生物互作发生前后的任意阶段研究植物宿主的基因表达和分泌组谱，这将有助于阐明这些转录水平或分泌组的变化如何促进或.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Brian Weselowski 和 Alexander W. Eastman 提供的帮助和有益的讨论。我们还要感谢 Eugene W. Nester 博士、Lingrui Zhang 博士、Haitao Shen 博士、Yuhai Cui 博士以及 Greg Thorn 博士在研究过程中提供的帮助、有益的讨论以及对稿件的审阅。本研究由加拿大农业与农业食品部通过“农业发展前进计划—AgriFlex”（项目编号 2555）和“农业发展前进二期计划”项目编号 1670 资助，作者在履行其职责过程中开展了本研究。本研究还部分得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金 RGPIN-2015-06052（授予 Z-C Yuan）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 植物种子（拟南芥 Col-0） | 拟南芥生物资源中心 | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| 细菌（根癌农杆菌 C58） | 华盛顿大学 | N/A | |
| 标记的细菌 | 实验室自制 | 可选，取决于下游分析 | |
| 涡旋振荡器 | （多种） | ||
| 微量离心管 | （多种） | ||
| 微量离心机 | （多种） | ||
| 5% 次氯酸钠 | （多种） | ||
| 双蒸水 | （多种） | ||
| 高压灭菌器 | （多种） | ||
| 微量移液器 | （多种） | ||
| 70% 乙醇 | （多种） | ||
| Murashige 和 Skoog (MS) 基础盐 | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| 蔗糖 | （多种） | ||
| MES | （多种） | ||
| B5 维生素混合物 | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 植物琼脂 | （多种） | ||
| 深型培养皿 | （多种） | ||
| 不锈钢网筛 | 费里尔金属制品有限公司 | N/A | 等级：304；网目数：40 × 40；丝径：0.01 |
| 微孔胶带，1" | 3M | 1530-1 | |
| 昼夜生长培养箱 | （多种） | ||
| 圆柱形玻璃罐，100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | 可使用其他尺寸，此时液体含量可能需要调整 |
| 超净工作台 | （多种） | ||
| 镊子 | （多种） | ||
| 酵母提取物 | （多种） | ||
| 胰蛋白胨 | （多种） | ||
| MgSO4 | （多种） | ||
| 摇床培养箱 | （多种） | ||
| 分光光度计 | （多种） | ||
| NaCl | （多种） | ||
| 摇床 | （多种） | ||
| 剪刀 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 荧光显微镜 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 显微镜载玻片和盖玻片 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 指甲油 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 细菌RNA提取试剂盒 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 植物RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit） | Qiagen | 74903 或 74904 | 可选，取决于下游分析 |
| qRT-PCR 所需材料与设备 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 微阵列分析所需材料与设备 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 液氮 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 研钵和研杵 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 0.2 µm 孔径滤膜 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 50 mL 锥形管 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 冷冻干燥机 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 可密封试管 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 乙酸乙酯 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| 氮气 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| HPLC 所需材料与设备 | （多种） | 可选，取决于下游分析 | |
| ESI-TOF-MS 所需材料与设备 | （多种） | 可选，取决于下游分析 |
参考文献
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799....
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