用于植物/微生物分子相互作用和信号的同时系统分析的水培共培养系统

摘要

所描述的水培共培养系统支持具有金属筛网的完整植物，并将其与细菌共培养。然后可以单独收集植物组织，细菌和分泌的分子用于下游分析，同时允许研究植物宿主和相互作用的微生物或微生物群的分子响应。

摘要

模拟天然植物 - 微生物相互作用的实验设计对于描绘复杂的植物 - 微生物信号传导过程非常重要。 拟南芥 - 根癌土壤杆菌 提供了一个优秀的模型系统来研究细菌发病和植物相互作用。以前对植物 - 土壤杆菌相互作用的研究在很大程度上依赖于植物细胞悬浮培养物，植物的人造伤害，或通过合成化学品人工诱导微生物毒力因子或植物防御。然而，这些方法与植物中的自然信号不同，其中植物和微生物以空间和时间的方式识别和响应。这项工作提出了一个水培共培养系统，其中完整的植物由金属筛网支持并与农杆菌共培养。在这种共培养系统中，没有合成的植物激素或诱导微生物的化学物质补充抗性毒性或植物防御。水培共培养系统非常类似于天然植物-微生物相互作用和在植物信号动态平衡。植物根部可以从含有农杆菌的培养基中分离出来，同时有效地研究植物宿主和相互作用的微生物的信号传导和反应。在任何给定的时间点/间隔，可以分别收集植物组织或细菌用于各种"omics"分析，证明该系统的功效和功效。水培共培养系统可以容易地适应于研究:1）不同植物 - 微生物系统的相互信号转导，2）植物宿主与多种微生物物种（ 即微生物菌群或微生物群落）之间的信号传导，3）营养物质和化学物质如何牵连在植物微生物信号传导中，以及4）微生物如何与植物宿主相互作用，并有助于植物对生物的耐受性非生物压力。

引言

植物相关微生物在生物地球化学循环，生物修复，减缓气候变化，植物生长和健康以及植物对生物和非生物胁迫的耐受方面起重要作用。微生物与两个直接通过植物细胞壁接触，并通过化学分泌间接和信令^1，2，3株植物相互作用。作为无生物，植物已经开发出直接和间接的机制来抵抗病原体的感染。直接防御包括结构防御和防御蛋白的表达，而间接防御包括次级代谢产物的植物的生产和生物拮抗对侵入病原体^4,5的吸引力。植物来源的根系分泌物，分泌物，粘液，粘液和裂解物改变根际的物理化学性质，以吸引或排斥微生物往其主人⁶ 。根分泌的化学成分是物种特异性的，从而作为选择性过滤器，其允许某些能够识别这些化合物的微生物在根际^6中繁殖。因此，相容的微生物物种可以被刺激以激活和增强它们的相互关系，这是为了植物宿主¹的益处或损害。

在根际理解植物-微生物相互作用的关键是增强植物生产力和生态系统功能，因为大多数微生物和化学暴露的发生在根部结构和土壤-空气界面

方案

实验规划

1. 确定实验的具体目标。
2. 请阅读下面的整个协议。确定哪些部分与具体目标相关，以及是否需要进行任何修改。见下面的例子。
   1. 考虑实验是否将使用拟南芥植物和根癌土壤杆菌细菌，如下所述，或另一种植物 - 微生物组合。
      注意:虽然可以使用各种植物种类，植物根部的厚度可能需要不同尺寸的网格（步骤3.3），生长参数（步骤3.10-3.11和4.4）以及水培池尺寸和中等体积（步骤4.2）也可能需要调整（ 图2 ）。微生物可以容易地作为纯培养物，混合物种（财团）或环境样品（微生物）接种，但任何变化都可能影响方案，特别是第4.5步。
   2. 考虑一下将用于分析样品的实验类型。
      注意:荧光显微镜（步骤5）需要用荧光报告基因构建体标记的生物体。
3. 设计适当的控制。包括没有接种有对照细菌的幼苗的水栽池和没有接种细菌的对照幼苗。
4. 用适当数量的种子和水培池计划实验。考虑对照，生物重复（至少3个）和所有分析所需的组织量。
5. 确定实验目标的合适的共培养长度（步骤4.8）。
6. 根据需要修改以下任何步骤。

结果

水培栽培系统的生长

根癌土壤杆菌 C58的生长曲线在共培养的初始16小时中显示出显着的滞后期，随后在与拟南芥 Col-0共培养时达到非常稳定的生长，直到约0.9的最大OD ₆₀₀开始于接种后48小时相比之下，在没有拟南芥的对照培养物中基本上没有观察到细菌生长（ 图4 ）。这些结果表明，没有人工提供的其他营养物质，植物根系分泌的化合物能够在水培共培养系统中支持农杆菌的生长。在共培养的初始16小时期间的显着滞后期可能归因于与病原体共培养相当复杂的宿主感知和逐渐的根分泌。/ P>

相对于在不存在根癌土壤杆菌的情况下生长的对照植物，在开始3天期间， 拟南芥

讨论

鉴于根分泌的逐渐性质， 在植物中产生的毒力诱导化学物质的浓度及其对动植物 - 微生物相互作用的影响发生在空间和时间梯度上。在这种水培共培养系统中，不补充诱导微生物毒力或植物防御的合成植物激素或化学物质。相比之下，使用常规方法，添加合成化学品，如乙酰丁香酮，会产生突然的，人为的浓度峰值。因此，这种水培共培养系统更加模仿自然环境，微生物和宿主植物在空间和时间上识别和响应。

在这里，可以证明农杆菌毒力基因在与拟南芥共同培养时被激活。这表明天然植物来源的化学物质会诱导土壤杆菌毒力。未来e需要确定这些化学物质，并验证其中是否引起毒力诱导化合物乙酰丁香酮。此外，在与农杆菌共培养的同时观察到拟南芥根系基因表达和分泌物谱的显着变化，证明了水培共培养系统在植物 - 微生物相互作用期间研究植物宿主反应和分泌谱的潜力。事实上，使用水培共培养技术，可以在导致微生物相互作用之前和之后的任何阶段研究植物宿主的基因表达和分泌物谱，这将有助于阐明这些转录或分泌物变化如何促进或阻止随后的植物 - 微生物相互作.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
植物种子（拟南芥 Col-0）	拟南芥生物资源中心	CS7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
细菌（根癌农杆菌 C58）	华盛顿大学	N/A
标记细菌	内部		可选，取决于下游分析
涡旋	（各种）
微量离心管	（各种）
微量离心机	（各种）
5% 次氯酸钠	（各种）
双蒸水	（各种）
高压灭菌	（各种）
微量移液器	（各种）
70% 乙醇	（各种）
Murashige 和 Skoog （MS） 基础盐	Sigma-Aldrich	M5524
蔗糖	（各种）
MES	（各种）
B5 维生素混合物	Sigma-Aldrich	G1019
植物琼脂	（各种）
深培养皿	（各种）
不锈钢网	Ferrier Wire Goods Company Ltd	N/A	等级：304;目数：40 &次; 40;金属丝直径：0.01
微孔带，1"	3M	1530-1
昼夜生长室	（各种）
圆柱形玻璃罐，100 &次; 80 毫米	Pyrex	3250	其他尺寸，在这种情况下可能需要调整液体含量
	（各种）
镊子	（各种）
酵母提取物	（各种）
胰蛋白胨	（各种）
MgSO4	>（各种）
振荡培养箱	（各种）
分光光度计	（各种）
NaCl	（各种）
摇床	（各种）
剪刀	（各种）		可选，取决于下游分析荧光
显微镜	（各种）		可选，取决于下游分析
显微镜载玻片和盖玻片	（各种）		可选，取决于下游分析
指甲油	（各种）		可选，取决于下游分析
细菌 RNA 提取试剂盒	（各种）		可选，取决于下游分析
植物 RNA 提取试剂盒（RNeasy 植物迷你试剂盒）	Qiagen	74903 或 74904	可选，取决于下游分析
，用于 qRT-PCR 的材料和设备	（各种）		可选，取决于下游分析
，用于微阵列分析的材料和设备	（各种）		可选，取决于下游分析
液氮	（各种）		可选，取决于下游分析
研钵和研杵	（各种）		可选，取决于下游分析
0.2 和微量;M 孔过滤器	（各种）		可选，取决于下游分析
50 mL 锥形管	（各种）		可选，取决于下游分析
冷冻干燥机	（各种）		可选，取决于下游分析
可密封试管	（各种）		可选，取决于下游分析
乙酸乙酯	（各种）		可选，取决于下游分析
氮气	（各种）		可选，取决于下游分析
HPLC材料和设备	（各种）		可选，取决于下游分析
ESI-TOF-MS	材料和设备（各种）		可选，取决于下游分析