用于构建血管化组织和类器官的微流控生物打印技术

摘要

我们提供一种基于微流控生物打印策略的通用方案，用于构建微纤维血管床，其中可进一步将第二种细胞类型接种于该微纤维结构的间隙空间，以生成带血管化的组织和类器官。

摘要

构建具有血管化的组织结构和类器官历来具有挑战性。本文介绍了一种基于微流控生物打印的新型方法，用于生成由多层交错水凝胶微纤维组成的支架。为实现平稳的生物打印，设计了一种包含同轴结构的微流控打印头，该打印头的芯层流动中挤出复合生物墨水，鞘层流动则携带交联溶液，并将其安装于生物打印机上。通过将甲基丙烯酰化明胶（GelMA）与海藻酸盐（一种在特定二价离子存在下可发生瞬时离子交联的多糖）混合，先实现海藻酸盐的快速离子交联，再对GelMA组分进行二次光交联以达到永久性稳定，利用该生物打印策略可获得微纤维支架。重要的是，包埋在生物打印微纤维内的内皮细胞在16天的培养过程中能够形成类似血管的管腔样结构。该内皮化微纤维支架可进一步作为血管床，通过在微纤维的间隙空间中接种第二类细胞，构建出具有血管化的组织。微流控生物打印为高保真、便捷地工程化构建血管化组织提供了一种通用策略。

引言

组织工程旨在构建功能性组织替代物，可用于替换、修复或增强人体内受损或病变的组织^1,2,3,4，通常通过目标细胞类型与生物活性分子的组合实现^5,6和生物材料^7,8,9,10近年来，组织工程技术也越来越多地被用于生成 体外 模拟其重要功能的组织和器官模型 体内 对应物，可用于药物开发等应用，以替代传统的过度简化的平面细胞培养^{11,12,13,14,15}

方案

本方案中使用的新生大鼠心肌细胞取自2日龄的Sprague-Dawley大鼠，分离方法遵循Brigham and Women's医院机构动物护理和使用委员会批准的成熟操作流程⁵⁶。

1. 生物打印机的仪器安装

1. 插入较小的钝针（例如，27G，1英寸）作为核心插入较大钝针的中心例如，18G，½英寸）作为鞘管，构建双层同轴微流体打印头；确保内层针头比外层鞘管略长（约1 mm）图1A）。通常通过手动调整对齐，但如有必要，可在内针和外针的尖端及管身两端暂时夹入适当尺寸的垫片，以辅助同心对齐。使用环氧树脂胶密封管身连接处，并在适用时从尖端一侧移除对齐用垫片。
2. 将另一根针头（23G）反向插入中心针的针管中。  然后在套管针外针的侧壁上打一个孔，将一个尺寸匹配的金属连接器插入孔中，再用环氧树脂胶密封。
3. 将打印头的两个入口分别通过两根PVC管连接至双通道注射泵，用于单独注入生物墨水和交联溶液。使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成的塑料支架将挤出装置固定在生物打印机的打印头上。
   注意：生物打印机的选择取决于设备的可获得性。在本研究中，我们已在多种市售生物打印机上成功测试了该装置。然而，原则上，任何配备x-y-z电动载物台的生物打印机均可....

结果

微流控生物打印策略可实现利用低粘度生物墨水直接挤出打印微纤维支架^54,55如图所示 图2A，一种尺寸为6的支架 × 6 × 6 mm³ 含有 >30层微纤维可在10分钟内完成生物打印。海藻酸盐组分与CaCl₂的即时离子交联₂ 在生物打印过程中保持了优异的结构完整性，而随后对GelMA组分进行的物理光交联则确保了生物打印微纤维支架的长期稳定性，如所示的俯视图和侧视图所示 图2B和图2C在此方案指定的生物打印条件下制备的微纤维直径约为100 - 150 µm 直径会随着时间因肿胀而略有增加。

生物打印过程，包括生物墨水的微流控挤出、离.......

讨论

同轴打印头的构建是实现成功微流体生物打印的关键步骤，可同时从核心输送生物墨水，从鞘层输送交联剂。本方案中，示例打印头采用27G针头作为核心，18G针头作为外壳；但该方法可轻松扩展至使用不同规格针头的多种组合。然而，针头尺寸的改变会导致各相流体输送量发生变化，因此需要进一步优化生物墨水和交联剂的流速（可通过两个独立的注射泵分别调节，而非使用双通道泵），以及可能还需调整生物打印机的沉积速度。

本实验方案中参数（针头尺寸、流速和沉积速度）的组合，使得生物打印的微纤维在沉积后立即形成直径约为120 µm的结构，在培养基中平衡后会膨胀至约150 µm⁵⁵。由于微纤维层之间无间隙，该尺寸也大致等于生物打印结构的层厚。生物打印微纤维的直径是这三个参数共同作用的结果^54,63；打印头核心针头的尺寸和生物墨水流速与微纤维直径呈正相关，而包层针头的尺寸、交联剂的流速以及沉积速度则与微纤维直径呈负相关。通过控制打印头和/或电动平台的运动，可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
来自褐藻的海藻酸钠	Sigma-Aldrich	A0682	生物试剂，经植物细胞培养测试，低粘度，粉末状
猪皮来源A型明胶	Sigma-Aldrich	G2500	凝胶强度300
光引发剂Irgacure 2959（2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）	Sigma-Aldrich	410896	98%
HEPES缓冲液	Sigma-Aldrich	H0887	1 M，pH 7.0 - 7.6，经无菌过滤，生物试剂，适用于细胞培养
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10438026	经认证，热灭活，符合美国农业部批准地区标准
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C5080	BioXtra，≥99.0%
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4
人脐静脉内皮细胞	Angio-Proteomie	cAP-0001	人脐静脉内皮细胞（HUVECs）
表达GFP的人脐静脉内皮细胞	Angio-Proteomie	cAP-0001GFP	表达GFP的人脐静脉内皮细胞（GFPHUVECs）
内皮细胞生长培养基	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s改良Eagle培养基	Thermo Fisher Scientific	12430054	高糖，含HEPES
Sylgard 184硅酮弹性体试剂盒	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	透明0.5 kg装试剂盒
紫外固化灯系统	Excelitas Technologies	OmniCure S2000	带智能紫外传感器的点光源紫外固化系统