一种表征胚胎发生的方法 拟南芥

摘要

本方案概述了一种观察胚胎发生的方法 拟南芥 通过胚珠透明化处理后在显微镜下观察胚胎模式的形成。

摘要

鉴于其发育过程具有高度可预测性， 拟南芥 胚胎已被用作研究植物形态发生的模型。然而，植物胚胎的早期阶段体积微小且细胞数量较少，难以观察与分析。本文描述了一种利用模式生物在显微镜下对植物胚胎模式形成进行表征的方法。 拟南芥在使用Hoyer's溶液清除新鲜胚珠后，可通过100倍油镜下的微分干涉差显微镜观察胚胎的细胞数目和形态，并确定其发育阶段。此外，利用共聚焦激光扫描显微镜监测绿色荧光蛋白（GFP）标记的特定标记蛋白的表达，以注释胚胎模式形成过程中的细胞命运决定。因此，该方法可用于在细胞和分子水平上观察野生型植物胚胎的模式形成，并通过比较野生型植株与胚胎致死突变体中胚胎的模式形成，来鉴定特定基因在胚胎模式形成中的作用。该方法可用于研究胚胎发生过程中的 拟南芥.

引言

胚胎发生是高等植物发育的最初事件。在严格的遗传调控下，合子通过细胞分裂和分化形成成熟的胚胎^1,2。拟南芥胚胎是研究形态建成调控的有用模型，因为在胚胎发生过程中，细胞分裂的顺序遵循一种可预期的模式^3,4。然而，含有一个或几个细胞的拟南芥胚胎过于微小，难以观察和分析。此外，某些基因的突变可导致胚胎致死⁵，表明这些基因在胚胎发生中具有关键作用。对胚胎致死突变体中模式形成的表征，为理解关键基因如何调控胚胎发育的分子机制奠定了基础。

本文详细描述了通过直接显微观察对模式植物Arabidopsis胚胎模式形成进行表征的实验方法。该方法包括胚珠透明化处理，随后对胚胎进行显微观察。文中还介绍了胚胎致死突变体的表征方法。

通过使用Hoyer's溶液透明处理的胚珠，可以直接利用显微镜观察不同发育阶段胚胎的形态^6,7。此类透明处理后的胚珠具有较高的折射率，因此该胚珠透明方法特别适用于需通过微分干涉差（DIC）显微镜观察的样品。

此外，在胚胎发生过程中于特定细胞或少数细胞中表达的基因可作为标记物，用于识别胚胎中的细胞。因此，可通过共聚焦激光扫描显微镜监测GFP标记的标记蛋白的表达，来注释胚胎发生过程中的细胞身份特化。相反，观察功能未知基因与GFP融合蛋白在胚胎发生过程中的表达模式，可建立胚胎图式形成与该基因表达之间的关联，并有助于鉴定拟南芥（Arabidopsis）胚胎发生所必需的新基因。

本文所述方法还可用于鉴定胚胎致死型突变体的表型，并确定受影响基因在细胞水平上对胚胎发育的影响。此外，结合野生型与突变体植物在胚胎发育过程中标记基因表达模式的比较，该方法可为参与胚胎发育的分子机制和信号通路提供线索^8,9。事实上，该方法已应用于naa10突变体植物，研究发现突变体中胚根顶端细胞的异常分裂可能源于胚胎发育过程中生长素分布的改变⁵。

方案

注意：本方案包含三个部分：1）观察野生型中的模式形成 拟南芥 使用微分干涉相差显微镜观察胚胎；2）表征胚胎的图式形成 通过 使用共聚焦激光扫描显微镜观察标志蛋白的表达；以及 3）确定特定基因在胚胎发生中的作用（使用 naa10 以突变体为例。

1. 胚珠透明化

1. 植物材料准备
   注意：此处描述的方案是培养健康植物的一个示例；其他能够培养健康植物的方法同样适用。
   1. 将100粒种子加入1.5 mL离心管中，再加入1 mL 1.5%次氯酸钠溶液（将15 mL 10%氯溶液与85 mL水混合），浸泡5分钟以对种子进行表面灭菌。反复倒置离心管数次，确保种子与溶液充分混合，从而彻底灭菌。
   2. 在1,200 × g条件下离心30秒，使种子沉降至管底，弃去上清液，并在实验台上用无菌水清洗种子四次，以去除残留的次氯酸钠。
   3. 将4.4 g Murashige和Skoog（MS）基础盐混合物和10 g蔗糖加入1 L超纯水中，搅拌至盐和蔗糖完全溶解。用1 M KOH调节溶液pH至5.8，加入3 g凝胶剂（如Phytagel），将MS-蔗糖溶液在121 °C下灭菌15分钟，制得MS培养基。
   4. 将30 mL MS培养基倒入12 cm培养皿中，制成MS平板。
   5. 将灭菌后的种子接种于MS平板上，将平板转移至培养室，在种子分层处理（4 °C黑暗条件下处理3天）后，置于长日照条件下培养（光照16小时，22 °C；黑暗8小时，18 °C）。
   6. 培养8天后，将幼苗移栽至育苗盘中的土壤内（营养土与蛭石按1:1比例混合），用白色透明盖子覆盖育苗盘5天以减少水分蒸发，同时留出缝隙以防止植株玻璃化。
   7. 移除盖子，将植株置于步入式培养室中，在长日照条件下继续培养（见步骤1.1.5）。每日6:00开灯，22:00关灯。在培养室中生长约20天后，植株将开花并形成角果。
   8. 在晚上20:00，用细线标记花序中花梗位置的花芽（避免使用第一至第三朵花芽；由这些花芽发育而来的角果通常含有较多败育种子，可能影响正常与异常胚珠的比例）。将胚珠受精的起始时间定义为次日早晨8:00标记的花芽开放开花的时刻。
2. 霍耶氏溶液（Hoyer's solution）的配制
   1. 将24 g水合氯醛加入50 mL离心管中，并用铝箔完全包裹管体（水合氯醛溶液在光照下不稳定）。
   2. 向上述管中加入9 mL超纯水和3 mL甘油，振荡使水合氯醛充分溶解。配制完成后，将管置于室温下静置过夜，以消除溶液中的气泡。
3. 胚珠分离与透明处理
   1. 将一段双面胶带贴于显微镜载玻片上。取授粉后特定天数（DAP）的角果，将其置于载玻片上，使假隔膜方向垂直于玻片表面；此方向便于用针分离子房（图1A 和 1B）。
   2. 用注射器针头沿假隔膜两侧切开子房，将两个分离的子房贴附于载玻片上，使角果内的胚珠可在体视显微镜下清晰可见（图1C 和 1D）。
   3. 在载玻片上滴加70 µL霍耶氏溶液，将精细镊子的尖端浸入霍耶氏溶液中润湿。在体视显微镜下，用镊子将胚珠移入玻片上的霍耶氏溶液中以清洗胚胎。轻轻加盖盖玻片，避免产生气泡。
   4. 将制备好的玻片置于暗处盒中，室温下静置2–12小时（胚珠越成熟，所需时间越长）。2/4细胞期胚胎（授粉后1–2天，1–2 DAP）可在2小时后观察；八分体至早期球形胚阶段（3 DAP）的胚胎需静置4小时后观察；更成熟的胚胎（4–8 DAP）则需静置12小时后观察。
   5. 使用显微镜的微分干涉差（DIC）功能观察透明处理后的胚珠。先在低倍镜（10X）下定位胚胎，再转换至高倍镜（100X油镜）观察发育中胚胎的细胞结构。
   6. 观察不同发育阶段的胚胎。

2. 通过标记蛋白表达的观察表征胚胎模式形成与细胞身份

1. 植物材料的准备
   1. 克隆标记基因或激素响应元件的启动子和编码序列，然后将其与荧光蛋白（如 GFP）融合；接着将构建好的片段插入双元载体（如 pCambia1300）中。此处以生长素响应元件 DR5 为例¹⁰。
   2. 通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化方法，将构建好的 DR5-GFP 质粒导入野生型植物中¹¹。使用含有潮霉素的MS培养基平板（母液50 mg/mL，按1:1,000稀释）筛选T1代植株。在1.1.5所述条件下培养8天后，转基因植株将表现出较长的根，并长出两片莲座叶。
   3. 将转基因植株转移至土壤中，按照1.1.6和1.1.7所述条件进行培养。
   4. 从独立的T1代株系中收集T2代种子。将种子播种于含潮霉素的MS平板上，筛选含有单拷贝DR5-GFP插入的植株（抗性植株与敏感植株的比例约为3:1），然后将其移栽至土壤中。
   5. 按照1.1.6和1.1.7所述条件培养T2代植株。
   6. 从T2代植株中收集T3代种子。将种子播种于含潮霉素的MS平板上，筛选纯合的转基因植株（单个株系的所有植株均表现出潮霉素抗性），然后将其移栽至土壤中。
   7. 按照1.1.8所述方法对纯合T3代植株的花蕾进行标记。
2. GFP信号观察
   1. 将3 mL甘油与47 mL超纯水混合，配制6%甘油溶液。
   2. 在玻璃载玻片上贴一段双面胶带，并按照1.3.1所述方法固定一个角果。
   3. 在体视显微镜下，用注射器针头沿假隔膜两侧切开子房，并将解剖得到的两个子房壁按照1.3.2所述方法贴附在载玻片上。
   4. 在载玻片上滴加30 µL 6%甘油溶液，用精细镊子将解剖所得子房中的所有胚珠放入溶液中，然后轻轻盖上盖玻片。
   5. 由于每个胚珠的种皮和胚乳可能阻碍胚胎中GFP信号的观察，需将胚胎从胚珠中分离出来。快速而轻柔地敲击载玻片，使胚胎从胚珠中挤出（胚珠越成熟，施加于载玻片的力度应越小）。
   6. 使用共聚焦激光扫描显微镜观察载玻片上的GFP荧光。先在低倍镜（10X）下找到分离的胚胎并记录其位置，然后切换至高倍镜（100X油镜），将激发光源设为488 nm，以检测GFP信号，观察胚胎中DR5-GFP的表达情况。
   7. 检测胚胎中的GFP表达，以选择适合进一步分析的T3代株系。

3. 通过胚珠透明化和标记蛋白观察对胚胎致死突变体中胚胎模式形成的表征：Naa10 为例

1. naa10 突变体植株中的胚胎模式形成
   1. 按照 1.1.1–1.1.7 中所述准备植物材料。
   2. 使用基因特异性引物通过 PCR 鉴定 naa10^+/− 植株⁵，然后按照 1.1.8 中所述标记 naa10^+/− 植株的花蕾。
   3. 按照 1.2 和 1.3 中所述对 naa10^+/− 胚胎进行胚珠透明化处理及显微观察。
2. 利用 naa10 胚胎进行标记蛋白分析
   1. 按照 2.1–2.2 中所述步骤获得合适的 DR5-GFP 转基因株系。
   2. 将纯合的 DR5-GFP 转基因株系与 naa10^+/− 植株杂交，获得在 F2 代中对 GFP 荧光标记呈纯合状态的 naa10^+/− 植株（通过基因特异性 PCR 鉴定），以表征 naa10^+/−5 并利用纯合的 DR5-GFP 株系在显微镜下观察 GFP 信号。
   3. 按照 2.1.7 中所述标记对 DR5-GFP 呈纯合状态的 naa10^+/− 植株的花蕾。
   4. 按照 2.2 中所述在对 DR5-GFP 呈纯合状态的 naa10 胚胎中检测 GFP 信号。

结果

本文所述方法可用于在显微镜下直接观察胚胎发育过程，利用特异性标记物注释胚胎发育过程中的细胞命运决定，并表征特定基因在胚胎发育中的作用。

野生型胚胎模式形成分析的代表性结果（从拉长的合子期到成熟的棒状幼虫期） 拟南芥 如图所示 图2卵子清除后，可通过微分干涉差显微镜（DIC显微镜）区分不同发育阶段的胚胎（图2）。其表达模式 DR5-GFP 在胚胎发育过程中，通过共聚焦激光扫描显微镜记录图3) 以确定生长素在胚胎中的分布，并研究生长素在胚胎发育过程中可能发挥的作用 拟南芥.

该实验方案还可用于鉴定特定基因在...

讨论

胚珠清除法是一种在胚胎发育过程中检测细胞分裂和评估形态的有用方法 拟南芥；利用该技术，可直接在微分干涉差显微镜下观察胚胎^5,12胚珠透明化的关键步骤是步骤1.3.4。该步骤中胚珠透明所需时间具有可变性。在Hoyer's溶液中处理2小时后，可清晰观察到处于2细胞/4细胞阶段的胚胎，而处理12小时后则变得不清晰。因此，胚珠越成熟，所需透明时间越长。

在步骤 2.2.5 中，为了从胚珠中分离胚胎，施加在载玻片上的力度至关重要。如果施加的力过大，胚胎可能会被压碎；然而，如果施加的力过小，则无法将胚胎从胚珠中挤出。根据我们的经验，胚珠越成熟，所需施加的力越小。鱼雷形胚和成熟胚胎可直接用注射器针头切开胚珠后剥离获得。由于在分离过程中部分悬垂细胞可能被破坏，分离得到的胚胎中悬垂细胞的荧光信号可能会丢失或不完整。该方法的另一个局限性在于，四细胞阶段之前的胚胎因体积过小且被胚珠碎片遮蔽，难以从挤出的材料中找到。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水合氯醛	Sigma	15307
MS基础培养基（Murashige和Skoog）	Sigma	M5519
植物凝胶（Phytagel）	Sigma	P8169
潮霉素	Roche	10843555001
生长培养箱	Percival	CU36L5
荧光显微镜	Zeiss Oberkochen	Zeiss Image M2	相机：AxioCam 506 color
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss Oberkochen	Zeiss LSM 5	滤光片：BP 495 - 555 nm
体视显微镜	Zeiss Oberkochen	Axio Zoom V16	相机：AxioCam MRc5
营养丰富的土壤	KLASMANN，德国
50 mL 离心管	Corning Inc.
1.5 mL 离心管	Corning Inc.
10% 次氯酸钠溶液			国产分析纯试剂
蔗糖			国产分析纯试剂
氢氧化钾（KOH）			国产分析纯试剂
甘油			国产分析纯试剂
培养皿			国产耗材
蛭石			国产耗材
载玻片			国产耗材
注射器针头			国产耗材
尖头镊子			国产耗材
超净工作台			国产设备