本方案概述了一种观察胚胎发生的方法 拟南芥 通过胚珠透明化处理后在显微镜下观察胚胎模式的形成。
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本文内容
摘要
摘要
鉴于其发育过程具有高度可预测性， 拟南芥 胚胎已被用作研究植物形态发生的模型。然而，植物胚胎的早期阶段体积微小且细胞数量较少，难以观察与分析。本文描述了一种利用模式生物在显微镜下对植物胚胎模式形成进行表征的方法。 拟南芥在使用Hoyer's溶液清除新鲜胚珠后，可通过100倍油镜下的微分干涉差显微镜观察胚胎的细胞数目和形态，并确定其发育阶段。此外，利用共聚焦激光扫描显微镜监测绿色荧光蛋白（GFP）标记的特定标记蛋白的表达，以注释胚胎模式形成过程中的细胞命运决定。因此，该方法可用于在细胞和分子水平上观察野生型植物胚胎的模式形成，并通过比较野生型植株与胚胎致死突变体中胚胎的模式形成，来鉴定特定基因在胚胎模式形成中的作用。该方法可用于研究胚胎发生过程中的 拟南芥.
引言
胚胎发生是高等植物发育的最初事件。在严格的遗传调控下，合子通过细胞分裂和分化形成成熟的胚胎1,2。拟南芥胚胎是研究形态建成调控的有用模型，因为在胚胎发生过程中，细胞分裂的顺序遵循一种可预期的模式3,4。然而，含有一个或几个细胞的拟南芥胚胎过于微小，难以观察和分析。此外，某些基因的突变可导致胚胎致死5，表明这些基因在胚胎发生中具有关键作用。对胚胎致死突变体中模式形成的表征，为理解关键基因如何调控胚胎发育的分子机制奠定了基础。
本文详细描述了通过直接显微观察对模式植物Arabidopsis胚胎模式形成进行表征的实验方法。该方法包括胚珠透明化处理，随后对胚胎进行显微观察。文中还介绍了胚胎致死突变体的表征方法。
通过使用Hoyer's溶液透明处理的胚珠，可以直接利用显微镜观察不同发育阶段胚胎的形态6,7。此类透明处理后的胚珠具有较高的折射率，因此该胚珠透明方法特别适用于需通过微分干....
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方案
注意：本方案包含三个部分：1）观察野生型中的模式形成 拟南芥 使用微分干涉相差显微镜观察胚胎；2）表征胚胎的图式形成 通过 使用共聚焦激光扫描显微镜观察标志蛋白的表达；以及 3）确定特定基因在胚胎发生中的作用（使用 naa10 以突变体为例。
1. 胚珠透明化
- 植物材料准备
注意：此处描述的方案是培养健康植物的一个示例；其他能够培养健康植物的方法同样适用。- 将100粒种子加入1.5 mL离心管中，再加入1 mL 1.5%次氯酸钠溶液（将15 mL 10%氯溶液与85 mL水混合），浸泡5分钟以对种子进行表面灭菌。反复倒置离心管数次，确保种子与溶液充分混合，从而彻底灭菌。
- 在1,200 × g条件下离心30秒，使种子沉降至管底，弃去上清液，并在实验台上用无菌水清洗种子四次，以去除残留的次氯酸钠。
- 将4.4 g Murashige和Skoog（MS）基础盐混合物和10 g蔗糖加入1 L超纯水中，搅拌至盐和蔗糖完全溶解。用1 M KOH调节溶液pH至5.8，加入3 g凝胶剂（如Phytagel），将MS-蔗糖溶液在121 °C下灭菌15分钟，制得MS培养基。
- 将30 mL MS培养基倒入12 cm培养皿中，制成MS平板。
- 将灭菌后的种子接种于MS平....
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结果
本文所述方法可用于在显微镜下直接观察胚胎发育过程，利用特异性标记物注释胚胎发育过程中的细胞命运决定，并表征特定基因在胚胎发育中的作用。
野生型胚胎模式形成分析的代表性结果（从拉长的合子阶段到成熟的棒状幼虫阶段） 拟南芥 如图所示 图2卵珠清除后，可通过微分干涉差显微镜（DIC显微镜）区分不同发育阶段的胚胎（图2）。其表达模式 DR5-GFP 在胚胎发育过程中，通过共聚焦激光扫描显微镜记录图3) 以确定生长素在胚胎中的分布，并研究生长素在胚胎发育过程中可能发挥的作用 拟南芥.
该方案还可用于表征特定基因在.......
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讨论
胚珠清除法是一种在胚胎发育过程中检测细胞分裂和评估形态的有用方法 拟南芥；利用该技术，可直接在微分干涉差显微镜下观察胚胎5,12胚珠透明化的关键步骤是步骤1.3.4。该步骤中胚珠透明所需时间具有可变性。在Hoyer's溶液中处理2小时后，可清晰观察到处于2细胞/4细胞阶段的胚胎，而处理12小时后则变得不清晰。因此，胚珠越成熟，所需透明时间越长。
在步骤 2.2.5 中，为了从胚珠中分离胚胎，施加在载玻片上的力度至关重要。如果施加的力过大，胚胎可能会被压碎；然而，如果施加的力过小，则无法将胚胎从胚珠中挤出。根据我们的经验，胚珠越成熟，所需施加的力越小。鱼雷形胚和成熟胚胎可直接用注射器针头切开胚珠后剥离获得。由于在分离过程中部分悬垂细胞可能被破坏，分离得到的胚胎中悬垂细胞的荧光信号可能会丢失或不完整。该方法的另一个局限性在于，四细胞阶段之前的胚胎因体积过小且被胚珠碎片遮蔽，难以从挤出的材料中找到。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Jessica Habashi博士对本文稿的审阅。感谢中国首都师范大学生命科学学院影像中心的Xianyong Sheng博士协助完成DR5-GFP定位实验。本研究得到了北京市政府科学基金会（CIT&TCD20150102）和国家自然科学基金（31600248）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 水合氯醛 | Sigma | 15307 | |
| MS基础培养基（Murashige和Skoog） | Sigma | M5519 | |
| 植物凝胶（Phytagel） | Sigma | P8169 | |
| 潮霉素 | Roche | 10843555001 | |
| 生长培养箱 | Percival | CU36L5 | |
| 荧光显微镜 | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | 相机：AxioCam 506 color |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | 滤光片：BP 495 - 555 nm |
| 体视显微镜 | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | 相机：AxioCam MRc5 |
| 营养丰富的土壤 | KLASMANN，德国 | ||
| 50 mL 离心管 | Corning Inc. | ||
| 1.5 mL 离心管 | Corning Inc. | ||
| 10% 次氯酸钠溶液 | 国产分析纯试剂 | ||
| 蔗糖 | 国产分析纯试剂 | ||
| 氢氧化钾（KOH） | 国产分析纯试剂 | ||
| 甘油 | 国产分析纯试剂 | ||
| 培养皿 | 国产耗材 | ||
| 蛭石 | 国产耗材 | ||
| 载玻片 | 国产耗材 | ||
| 注射器针头 | 国产耗材 | ||
| 尖头镊子 | 国产耗材 | ||
| 超净工作台 | 国产设备 |
参考文献
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev P....
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