本报告介绍了两种基于生物素标记的方法，用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达水平及其内吞速率。
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摘要
摘要
细胞表面蛋白介导多种功能。在许多情况下，这些蛋白的活性受到内吞过程的调控，从而调节其在质膜上的水平。本文介绍了两种有助于研究此类过程的详细实验方案，二者均基于细胞表面蛋白的生物素标记原理。第一种方法可用于半定量测定特定蛋白在细胞表面的相对水平。该方法首先用生物素标记细胞质膜蛋白中的赖氨酸残基。细胞裂解后，利用链霉亲和素偶联的琼脂糖珠，凭借其与生物素之间的高亲和力，特异性沉淀这些蛋白。随后可通过标准的蛋白质印迹（Western blotting）方法对所分离的蛋白进行分析。第二种方法可用于测定特定细胞表面靶蛋白在一定时间内的内吞速率。首先用含有可切割二硫键的生物素衍生物对细胞表面蛋白进行修饰。随后将细胞恢复至正常培养条件，促使部分被生物素标记的蛋白发生内吞。接着使用膜非通透性的还原剂谷胱甘肽还原未被内吞的生物素基团中的二硫键。通过该方法，可高度特异性地分离并定量内吞的蛋白。
引言
细胞表面的蛋白质在维持细胞功能方面发挥着多种核心作用。在许多情况下，这些蛋白质的活性依赖于内吞过程，或受其调控，这些内吞过程可将蛋白质暂时隔离于细胞内位点，或将其导向降解途径1,2,3,4,5。本文重点介绍两种基于生物素标记的方法，旨在使研究者能够特异性地标记并分离在质膜上表达的蛋白质以及新近内化的蛋白质。通过这些方法，可定量检测任何目标蛋白的细胞表面表达水平及其内吞速率，从而更清晰地评估其调控机制。
通过生物素标记法测定细胞表面蛋白的相对表达水平
生物素（Biotin），即维生素B7，曾被称为维生素H6，是一种小分子水溶性化合物，可用于化学修饰生物分子中的反应性氨基、巯基和羧基。目前常用的细胞表面生物素化试剂主要为生物素或其衍生物的磺化N-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）酯类化合物，这类试剂具有膜不通透性，可在碱性条件下与细胞表面表达的蛋白质赖氨酸残基侧链上的去质子化氨基发生反应，从而与生物素部分形成酰胺键7。经过此类修饰后，可通过亲和素（avidin）分离细胞表面蛋白。亲和素是一种分子量为66–69 kDa的四聚体蛋白，对生物素具有极高的亲和力，其解离常数约为10-15，是目前已知最强的非共价相互作用之一8,9。
在以往的研究中，已采用多种替代方法来定量细胞表面的蛋白质表达。例如，使用针对目标蛋白质的荧光标记抗体对未透化的细胞进行标记，随后通过荧光显微镜观察，是一种常用的方法，但该方法高度依赖于能够结合细胞外表位的抗体的可获得性。近年来，也有研究成功采用了携带对酸性环境敏感的荧光蛋白的嵌合蛋白的方法10。然而，这类检测通常需要在原本不表达目标蛋白的细胞系中异源表达这些构建体。尽管如此，这些方法仍能提供有关目标蛋白亚细胞定位及其胞吐运输路径的重要信息，因此，若条件允许，应与本文所述的基于生物素标记的方法结合使用。
在典型的生物素化实验中，首先用 4 °C 的 PBS 充分洗涤细胞。这一步可去除培养基中引入的血清蛋白残留，从而确保这些蛋白不会在下一步中消耗过量的生物素。更重要的是，温度降低会显著减缓内吞作用。随后加入生物素化试剂。接着再次洗涤细胞，然后用含有甘氨酸或 NH4Cl 的淬灭缓冲液孵育，以灭活所有未反应的生物素残留。之后裂解细胞，并加入链霉亲和素偶联的琼脂糖珠沉淀生物素标记的蛋白质。通常通过蛋白质印迹（Western blotting）进行分析，从而定量检测各种蛋白质在细胞表面的相对表达水平。
由于该检测方法的原理所限，仅适用于具有暴露于细胞外环境区域的蛋白质。多次跨膜蛋白在其环状区域可能含有多个可反应的赖氨酸，因此最适用于此方法；而单次跨膜蛋白则通常较难被生物素标记。即便如此，在某些情况下，构象变化或分子间相互作用仍有可能遮蔽部分反应位点，导致生物素标记效率低于预期。
通过生物素标记法测定细胞表面蛋白的内化速率
该实验的基本原理与细胞表面生物素标记法 largely 相似，但存在若干例外，其中最重要的是使用可逆生物素标记试剂。这些试剂的生物素基团结构中含有对还原剂敏感的二硫键；这一特性被加以利用，以确保只有在实验期间从细胞表面内化至细胞内位点的蛋白质才会保留生物素标记。实验通常按以下步骤进行：首先用冷的试剂洗涤并进行生物素标记细胞，然后重新加入37 °C的细胞培养基，将细胞放回培养箱中孵育，促使被标记的细胞表面蛋白发生内吞作用。接着加入不能穿透细胞膜的还原剂谷胱甘肽，以断裂仍留在细胞表面蛋白质上的生物素基团中的二硫键。最后，用碘乙酰胺与断裂后产生的二硫键反应，消耗不稳定的巯基，防止二硫键重新形成。随后，与之前相同，裂解细胞，并使用链霉亲和素-琼脂糖沉淀被标记的蛋白质。
由于本方法与前述方法具有相似性，前一节讨论的局限性同样适用于此处。此外，需要注意的是，本实验涉及的温度变化使得无法精确测定每个时间增量内被内吞的蛋白量，特别是对于快速内化或快速再循环的蛋白而言。因此，该实验仅能对内吞速率提供半定量的估计。全内反射荧光显微镜可用于追踪每个加载囊泡的摄取过程，从而更精确地测量内吞动力学，因此可在获得目标蛋白的荧光标记嵌合体构建物的前提下，作为本实验非常有用的补充手段11。
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方案
1. 通过生物素标记法测定星形胶质细胞表面蛋白的相对表达水平
注意：此处我们以细胞外基质分子层粘连蛋白对水通透性通道蛋白水通道蛋白-4（AQP4）在细胞表面定位的影响研究为例，说明该生物素标记技术的应用。本实验所需的特殊材料包括磺基-NHS-LC-生物素和链霉亲和素-琼脂糖树脂（见材料表）。
- 采用 Noel 中所述方法 等12，提前约2周准备皮质星形胶质细胞培养物，并在75 cm²培养瓶中培养2 带透气盖的培养瓶。当星形胶质细胞融合度达到80 - 90%时，使用0.05%胰蛋白酶将其从培养表面消化下来，然后以1:3比例传代。
- 在实验前48小时，当细胞再次达到80–90%汇合度时，按1:3比例传代培养星形胶质细胞（考虑培养器皿规格的改变），接种至60 mm细胞培养皿中，使其 >实验当天细胞汇合度为70%。确保细胞在培养皿之间分布均匀。
- 在检测前16 h，将层粘连蛋白用移液管加入培养基中，使其终浓度为24 nM，并在37 ℃孵育 °C.
- 在检测开始前立即配制以下溶液，然后置于冰上或冷藏：CM-PBS（100 mg/L MgCl₂，100 mg/L CaCl₂，pH 7.4），还原型谷胱甘肽溶液（46.6 mg/mL 还原型谷胱甘肽，96.4 mg/mL NaCl，10 mM HEPES，pH 8.0，用 CM-PBS 配制），链霉亲和素琼脂糖珠（用 CM-PBS 按 1:1 体积比稀释的 50% 悬浮液）2∙6H2O 和 100 mg/L CaCl2 在1× PBS（pH 7.4）中，生物素缓冲液（0.5 mg/mL sulfo-NHS-LC-biotin 溶于 CM-PBS），淬灭缓冲液（50 mM NH₄Cl）4CM-PBS 中的 Cl、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，25 mM 甘氨酸，150 mM NaCl 和 5 mM EDTA，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）、3×上样缓冲液（150 mM Tris，pH 6.8，6% SDS，30%甘油，300 mM DTT 和 0.01%溴酚蓝）、洗涤缓冲液（10 mM Tris（pH 7.4），1.5 mM EDTA，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）。
- 从培养箱中取出装有星形胶质细胞培养物的培养皿，并弃去培养基。
- 用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次，将培养皿置于碎冰上。
- 将2 mL生物素缓冲液加入每个孔中，轻轻前后倾斜培养皿数次以确保完全覆盖。置于冰上30分钟。
- 使用移液器吸去生物素缓冲液，加入4 mL淬灭缓冲液，冰上孵育10分钟。
- 吸弃淬灭缓冲液，并加入等体积的相同缓冲液。再次置于冰上静置10分钟。
- 弃去淬灭缓冲液，用 4 mL 冰冷的 CM-PBS 将细胞洗涤三次。
- 使用细胞刮将细胞刮入1 mL预冷的CM-PBS中，并将悬液转移至微量离心管。
- 以 100 × g 离心 3 分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 500 µL 裂解缓冲液
- 将样品置于冰上孵育30分钟，每5分钟涡旋振荡一次，或在4℃下置于翻转摇床中孵育 °C.
- 在 4 ℃ 条件下，以 14,000 × g 离心 10 分钟 °C，以沉淀任何不溶于去垢剂的物质。将上清液转移至新的微量离心管中。
- 节省 50 µL 该裂解液并加入上样缓冲液，随后在 95 °C 加热使其变性 °在干燥浴中；这是 "输入" 组分，包含生物素标记的细胞表面蛋白以及非生物素标记的胞质蛋白。
- 用锋利的剪刀剪去移液器吸头末端约0.5 cm的材料，以扩大其开口。使用该移液器吸头，转移75 µL 链霉亲和素琼脂糖珠（通常保存于 4 °C) 向裂解液中加入，并于 4 °在摇床/振荡器上于4°C孵育3小时
- 由于链霉亲和素-琼脂糖常以体积分数为50%的珠状物悬浮于抗菌溶液中的浆液形式出售，使用前应将浆液充分吹打混匀，以确保珠状物均匀悬浮，然后用移液器吸取150 µ将悬浮液各1 L加入每个样品中。
- 以1500 × g离心30秒，沉淀链霉亲和素-琼脂糖珠，温度保持在4 ℃ °C.
- 节省 50 µ上清液的L（加入上样缓冲液并在95℃变性） °在水浴或加热块中）；这代表 "细胞内" 组分，主要由非生物素化的胞质蛋白组成。
- 将沉淀的珠子重悬于1 mL洗涤缓冲液中，4℃下轻轻摇动3分钟 °C. 离心收集珠粒（同步骤1.16），弃去上清液。重复此过程4次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
- 通过离心沉淀珠子（1500 × g，4 ℃下离心30 s） °C），弃去上层洗涤缓冲液。加入 50 µL 1×上样缓冲液（用裂解缓冲液稀释）。通过在95℃变性使生物素和链霉亲和素从珠粒上释放 °C；此组分应仅包含生物素标记的细胞表面蛋白质（"细胞表面" 组分
- 通过 SDS-PAGE 分离输入样本、细胞表面和细胞内组分 13，并通过蛋白质印迹法进行分析 14.
注意：尽管我们在实验中使用了4 - 20%的预制梯度凝胶，但对于本研究中的目标蛋白，含0.1% SDS的12 - 14%分离胶配以4%浓缩胶即可满足要求。应同时使用适当分子量范围的蛋白质分子量标准。需注意，生物素化蛋白的表观分子质量有时会出现可观测到的上移。
- 通过 SDS-PAGE 分离输入样本、细胞表面和细胞内组分 13，并通过蛋白质印迹法进行分析 14.
2. 通过生物素标记法测定星形胶质细胞表面蛋白的内化速率
注意：下文描述了一 种典型的脉冲-追踪生物素标记实验 ，本实例中用于追踪星形胶质细胞中 AQP4 的内吞作用。该方法基于 Madrid et al.15 所使用的方法。所需特殊材料包括磺基-NHS-SS-生物素、链霉亲和素-琼脂糖树脂、还原型谷胱甘肽和碘乙酰胺（见材料表）。
- 使用前一节所述方法，在60 mm培养皿中培养小鼠皮层星形胶质细胞。确保在实验当天细胞汇合度约为70%，且每个培养皿中的细胞数量相等。
- 在实验开始前立即配制以下溶液，并置于冰上或冷藏：CM-PBS（含100 mg/L MgCl2∙6H2O和100 mg/L CaCl2的1×PBS，pH 7.4）、生物素化缓冲液（CM-PBS中含0.5 mg/mL sulfo-NHS-SS-生物素）、还原缓冲液（50 mM还原型谷胱甘肽、75 mM NaCl和75 mM NaOH）、淬灭缓冲液（CM-PBS中含50 mM碘乙酰胺和1% BSA）、裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4，25 mM甘氨酸，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）、3×上样缓冲液（150 mM Tris，pH 6.8，6% SDS，30%甘油，300 mM DTT和0.01%溴酚蓝）、洗涤缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4，1.5 mM EDTA，150 mM NaCl，1% Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂混合物）。
- 配制新鲜的细胞培养基（DMEM补充10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺），并将其置于37 °C水浴中预热。
- 从培养箱中取出星形胶质细胞培养皿，用移液器吸除培养基。
- 用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。
- 向每个培养皿中加入3 mL生物素化缓冲液，轻轻前后倾斜培养皿数次以确保缓冲液均匀分布，然后在冰上孵育30分钟。
- 吸除生物素化缓冲液，替换为5 mL预热的培养基。将一个培养皿在37 °C孵育15分钟，另一个在相同温度下孵育30分钟。另留一个培养皿置于4 °C作为0分钟对照样本。
- 孵育结束后，弃去培养基，用4 mL预冷的CM-PBS洗涤细胞三次。向细胞中加入6 mL还原缓冲液，并在冰上孵育15分钟。
- 移除还原缓冲液，更换为6 mL新鲜还原缓冲液。 继续在冰上孵育15分钟。
- 移除还原液，替换为6 mL淬灭缓冲液，在冰上孵育15分钟。
- 重复一次淬灭步骤。
- 弃去淬灭缓冲液，用4 mL预冷的PBS洗涤细胞三次。
- 使用细胞刮将细胞刮入1 mL预冷的PBS中，并将悬液转移至微量离心管中。
- 在100 × g条件下离心3分钟以收集细胞沉淀，弃去上清液，用500 µL裂解缓冲液重悬细胞。
- 将样品置于冰上30分钟，每5分钟涡旋一次。或者，可将样品在4 °C下置于翻转混匀仪上处理相同时间。
- 在4 °C下以14,000 × g离心10分钟，沉淀去垢剂不溶性物质，然后将上清液转移至新的微量离心管中。保留50 µL该裂解液，加入上样缓冲液并在干浴仪中95 °C变性；此为“输入”组分，包含生物素标记的内吞蛋白以及非生物素化的蛋白。
- 使用剪口移液枪头，向裂解液中加入150 µL链霉亲和素-琼脂糖悬液，在4 °C摇床/振荡器上孵育3小时。有关此步骤的更多细节，请参见1.15。
- 在4 °C下以1,500 × g离心30秒，沉淀链霉亲和素-琼脂糖珠。
- 用1 mL洗涤缓冲液重悬珠子，在4 °C下振荡3分钟。离心沉淀珠子（参照步骤2.18），弃去上清液。重复此过程4次，以最大程度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
- 在4 °C下以1,500 × g离心30秒沉淀珠子，弃去上层洗涤缓冲液。加入50 µL 1×上样缓冲液（使用裂解缓冲液稀释 ）。在95 °C变性以释放生物素和链霉亲和素；该组分应仅包含内化的细胞表面蛋白（“内吞”组分）。
- 通过SDS-PAGE13分离输入、细胞表面及未结合组分，并进行Western印迹分析14。
注：虽然本实验中使用了4–20%预制梯度胶，但对于本研究中的目标蛋白，使用含0.1% SDS的12–14%分离胶和4%浓缩胶即可。应同时使用适当分子量范围的蛋白标准品。需注意，生物素化蛋白的表观分子质量有时会出现可观察到的上移。
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结果
利用细胞表面生物素化检测星形胶质细胞中 AQP4 的质膜表达
将经层粘连蛋白处理的星形胶质细胞培养物与未处理的对照细胞进行细胞表面生物素化，方法如前所述。生物素化蛋白通过链霉亲和素偶联琼脂糖沉淀，随后进行 SDS-PAGE 分离。细胞表面组分使用 AQP4 和 β-肌营养不良聚糖（β-DG）进行检测，其中 β-DG 作为细胞表面蛋白上样对照；而上样输入及胞内组分则使用 AQP4 和 β-肌动蛋白（β-actin）进行印迹检测，作为上样对照（图 1A）。通过密度测定法对细胞表面组分的条带强度进行定量，每组细胞的 AQP4 水平首先以 β-DG 值进行归一化，然后将所得比值再相对于对照细胞进行归一化。柱状图（图 1B）显示了三次独立实验的平均值 ± 标准误（SEM）。结果显示，层粘连蛋白处理平均可使细胞表面表达的 AQP4 增加近 2 倍。
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讨论
修改说明：
由于这些方法是为贴壁细胞设计的，我们已明确指定使用含有 100 mg/L MgCl2∙6H2O 的 PBS
在洗涤步骤中以及作为某些缓冲液的基础成分时，使用含100 mg/L CaCl2的CM-PBS，以确保细胞保持附着于培养表面，并防止细胞间连接被破坏。然而，若在操作的每一步之间将细胞离心成沉淀，则这些方案也可适用于非贴壁细胞类型。在此类情况下，CM-PBS可用PBS替代。
此外，需要注意的是，此处提到的每个条件均针对本实验方案而定，若将这些方法用于其他应用时，仅可作为粗略的参考指南。特别是，应独立验证去污剂提取程序是否适用于所用的细胞类型，以及离心机设置是否适合该细胞类型及所使用的链霉亲和素-琼脂糖珠。
最后，如果存在非特异性结合和/或背景过高的问题，可以使用市场上现有的其他多种亲和素形式替代链霉亲和素。例如，去糖基化的亲和素对凝集素以及DNA等...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本项目由加拿大卫生研究院（PG#20R47867）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化铵（NH4Cl） | 费舍尔科技公司 | A661-500 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 西格玛-奥德里奇 | A9647-50 | |
| 溴酚蓝 | 伯乐 | #1610404 | |
| cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物 | 西格玛-奥德里奇 | 11697498001 | |
| 乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA） | 伯乐 | #1610729 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | 伯乐 | #1610611 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | 赛默飞世尔科技 | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素 | 赛默飞世尔科技 | #21331 | |
| 胎牛血清（FBS） | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 16000-044 | |
| 甘油 | 费舍尔科技公司 | BP229-1 | |
| 甘氨酸 | 西格玛-奥德里奇 | G8898 | |
| 碘乙酰胺 | 伯乐 | #163-2109 | |
| 来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白 | 西格玛-奥德里奇 | L2020 | 冰上解冻。 |
| L-谷氨酰胺 | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 25030-081 | |
| 小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白抗体（AC-15） | 西格玛-奥德里奇 | A5441 | |
| 小鼠单克隆抗-β-肌营养不良糖蛋白抗体（43DAG1/8D5） | 徕卡生物系统 | B-DG-CE | |
| 青霉素/链霉素 | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 15140-122 | |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 715-035-150 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 111-035-045 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 10010-023 | |
| 还原型谷胱甘肽 | 西格玛-奥德里奇 | G6529 | |
| 氯化钠（NaCl） | 费舍尔科技公司 | S271-500 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | 西格玛-奥德里奇 | 862010 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | 费舍尔科技公司 | S318-100 | |
| 链霉亲和素琼脂糖树脂 | 赛默飞世尔科技 | #20347 | |
| 兔多克隆抗AQP4抗体 | Alomone | AQP-004 | |
| Tris碱（Trizma碱） | 费舍尔科技公司 | BP152-1 | |
| Tris-HCl | 费舍尔科技公司 | BP153-1 | |
| 吐温X-100 | 费舍尔科技公司 | BP151-500 |
参考文献
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