本报告介绍了两种基于生物素标记的方法，用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达水平及其内吞速率。
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本文内容
摘要
摘要
细胞表面蛋白介导多种功能。在许多情况下，这些蛋白的活性受到内吞过程的调控，从而调节其在质膜上的水平。本文介绍了两种有助于研究此类过程的详细实验方案，二者均基于细胞表面蛋白的生物素标记原理。第一种方法可用于半定量测定特定蛋白在细胞表面的相对水平。该方法首先用生物素标记细胞质膜蛋白中的赖氨酸残基。细胞裂解后，利用链霉亲和素偶联的琼脂糖珠，凭借其与生物素之间的高亲和力，特异性沉淀这些蛋白。随后可通过标准的蛋白质印迹（Western blotting）方法对所分离的蛋白进行分析。第二种方法可用于测定特定细胞表面靶蛋白在一定时间内的内吞速率。首先用含有可切割二硫键的生物素衍生物对细胞表面蛋白进行修饰。随后将细胞恢复至正常培养条件，促使部分被生物素标记的蛋白发生内吞。接着使用膜非通透性的还原剂谷胱甘肽还原未被内吞的生物素基团中的二硫键。通过该方法，可高度特异性地分离并定量内吞的蛋白。
引言
细胞表面的蛋白质在维持细胞功能方面发挥着多种核心作用。在许多情况下，这些蛋白质的活性依赖于内吞过程，或受其调控，这些内吞过程可将蛋白质暂时隔离于细胞内位点，或将其导向降解途径1,2,3,4,5。本文重点介绍两种基于生物素标记的方法，旨在使研究者能够特异性地标记并分离在质膜上表达的蛋白质以及新近内化的蛋白质。通过这些方法，可定量检测任何目标蛋白的细胞表面表达水平及其内吞速率，从而更清晰地评估其调控机制。
通过生物素标记法测定细胞表面蛋白的相对表达水平
生物素（Biotin），即维生素B7，曾被称为维生素H6，是一种小分子水溶性化合物，可用于化学修饰生物分子中的反应性氨基、巯基和羧基。目前常用的细胞表面生物素化试剂主要为生物素或其衍生物的磺化N-羟基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）酯类化合物，这类试剂具有膜不通透性，可在碱性条件下与细胞表面表达的蛋白质赖氨酸残基侧链上的去质子化氨基发生反应，从而与生物素部分形成酰胺键
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方案
1. 通过生物素标记法测定星形胶质细胞表面蛋白的相对表达水平
注意：此处我们以细胞外基质分子层粘连蛋白对水通透性通道蛋白水通道蛋白-4（AQP4）在细胞表面定位的影响研究为例，说明该生物素标记技术的应用。本实验所需的特殊材料包括磺基-NHS-LC-生物素和链霉亲和素-琼脂糖树脂（见材料表）。
- 采用 Noel 中所述方法 等12，提前约2周准备皮质星形胶质细胞培养物，并在75 cm²培养瓶中培养2 带透气盖的培养瓶。当星形胶质细胞融合度达到80 - 90%时，使用0.05%胰蛋白酶将其从培养表面消化下来，然后以1:3比例传代。
- 在实验前48小时，当细胞再次达到80–90%汇合度时，按1:3比例传代培养星形胶质细胞（考虑培养器皿规格的改变），接种至60 mm细胞培养皿中，使其 >实验当天细胞汇合度为70%。确保细胞在培养皿之间分布均匀。
- 在检测前16 h，将层粘连蛋白用移液管加入培养基中，使其终浓度为24 nM，并在37 ℃孵育 °C.
- 在检测开始前立即配制以下溶液，然后置于冰上或冷藏：CM-PBS（100 mg/L MgCl₂，100 mg/L CaCl₂，pH 7.4），还原型谷胱甘肽溶液（46.6 mg/mL 还原型谷胱甘肽，96.4 mg/mL NaC....
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结果
利用细胞表面生物素化检测星形胶质细胞中 AQP4 的质膜表达
将经层粘连蛋白处理的星形胶质细胞培养物与未处理的对照细胞进行细胞表面生物素化，方法如前所述。生物素化蛋白通过链霉亲和素偶联琼脂糖沉淀，随后进行 SDS-PAGE 分离。细胞表面组分使用 AQP4 和 β-肌营养不良聚糖（β-DG）进行检测，其中 β-DG 作为细胞表面蛋白上样对照；而上样输入及胞内组分则使用 AQP4 和 β-肌动蛋白（图 1A）作为上样对照。通过密度测定法对细胞表面组分的条带强度进行定量，每组细胞的 AQP4 水平首先根据 β-DG 值进行归一化，然后将所得比值再相对于对照细胞进行归一化。图 1B 中的柱状图表示三次独立实验的平均值 ± 标准误（SEM）。层粘连蛋白处理平均可使细胞表面表达的 AQP4 增加近 2 倍。
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讨论
修改说明：
由于这些方法是为贴壁细胞设计的，我们已明确指定使用含有 100 mg/L MgCl2∙6H2O 的 PBS
在洗涤步骤中以及作为某些缓冲液的基础成分时，使用含100 mg/L CaCl2的CM-PBS，以确保细胞保持附着于培养表面，并防止细胞间连接被破坏。然而，若在操作的每一步之间将细胞离心成沉淀，则这些方案也可适用于非贴壁细胞类型。在此类情况下，CM-PBS可用PBS替代。
此外，需要注意的是，此处提到的每个条件均针对本实验方案而定，若将这些方法用于其他应用时，仅可作为粗略的参考指南。特别是，应独立验证去污剂提取程序是否适用于所用的细胞类型，以及离心机设置是否适合该细胞类型及所使用的链霉亲和素-琼脂糖珠。
最后，如果存在非特异性结合和/或背景过高的问题，可以使用市场上现有的其他多种亲和素形式替代链霉亲和素。例如，去糖基化的亲和素对凝集素以及DNA等.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本项目由加拿大卫生研究院（PG#20R47867）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化铵（NH4Cl） | 费舍尔科技公司 | A661-500 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 西格玛-奥德里奇 | A9647-50 | |
| 溴酚蓝 | 伯乐 | #1610404 | |
| cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物 | 西格玛-奥德里奇 | 11697498001 | |
| 乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA） | 伯乐 | #1610729 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | 伯乐 | #1610611 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | 赛默飞世尔科技 | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素 | 赛默飞世尔科技 | #21331 | |
| 胎牛血清（FBS） | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 16000-044 | |
| 甘油 | 费舍尔科技公司 | BP229-1 | |
| 甘氨酸 | 西格玛-奥德里奇 | G8898 | |
| 碘乙酰胺 | 伯乐 | #163-2109 | |
| 来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白 | 西格玛-奥德里奇 | L2020 | 冰上解冻。 |
| L-谷氨酰胺 | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 25030-081 | |
| 小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白抗体（AC-15） | 西格玛-奥德里奇 | A5441 | |
| 小鼠单克隆抗-β-肌营养不良糖蛋白抗体（43DAG1/8D5） | 徕卡生物系统 | B-DG-CE | |
| 青霉素/链霉素 | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 15140-122 | |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 715-035-150 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 111-035-045 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 吉布科/赛默飞世尔科技 | 10010-023 | |
| 还原型谷胱甘肽 | 西格玛-奥德里奇 | G6529 | |
| 氯化钠（NaCl） | 费舍尔科技公司 | S271-500 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | 西格玛-奥德里奇 | 862010 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | 费舍尔科技公司 | S318-100 | |
| 链霉亲和素琼脂糖树脂 | 赛默飞世尔科技 | #20347 | |
| 兔多克隆抗AQP4抗体 | Alomone | AQP-004 | |
| Tris碱（Trizma碱） | 费舍尔科技公司 | BP152-1 | |
| Tris-HCl | 费舍尔科技公司 | BP153-1 | |
| 吐温X-100 | 费舍尔科技公司 | BP151-500 |
参考文献
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M.
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