使用生物素化测定原代星形细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达和吞噬率

摘要

本报告提供了两种基于生物素化的方法，设计用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达和内吞率。

摘要

细胞表面蛋白介导各种功能。在许多情况下，它们的活性受调节其在质膜上的水平的内吞过程的调节。在这里，我们提供了有助于研究这些过程的两种方法的详细方案，这两种方法均基于细胞表面蛋白的生物素化原理。第一个被设计为允许半定量测定细胞表面上特定蛋白质的相对水平。其中，细胞的质膜蛋白的赖氨酸残基首先用生物素部分标记。一旦细胞被裂解，然后可以通过利用琼脂糖固定的链霉亲和素通过利用后者对于生物素的天然亲和力来特异性沉淀这些蛋白质。然后可以通过标准的Western印迹方法分析以这种方式分离的蛋白质。第二种方法提供了确定特定细胞吞噬率的方法ar细胞表面目标在一段时间内。首先用含有可切割二硫键的生物素衍生物修饰细胞表面蛋白。然后将细胞转移回正常培养条件，这导致一部分生物素化蛋白质的内吞摄取。接下来，使用膜不可渗透的还原剂谷胱甘肽使非内化生物素基团的二硫键减少。通过这种方法，内吞的蛋白质因此可以以高度的特异性被分离和定量。

引言

细胞表面的蛋白质起着维持细胞功能的重要作用。在许多情况下，它们的活性依赖于或者通过内吞过程调节，这些内吞过程暂时将其封闭在胞内位点，或者将它们引导到降解途径^1,2,3,4,5 。在这里，我们强调了2种基于生物素化的方法，旨在允许用户专门标记和分离在质膜上表达的蛋白质，以及新内化的蛋白质。通过这些方法，可以量化任何目的蛋白质的细胞表面表达和内吞速率，从而允许更清楚地评估其调节。

通过生物素化测定相对细胞表面蛋白的表达

生物素或维生素B7（以前称为维生素H ⁶ ）是一种小水溶性分子，可用于化学修饰生物分子的活性胺，巯基和羧基。目前的细胞表面生物素化试剂主要由生物素或其衍生物的膜 - 不渗水磺化N-羟基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）酯组成，其与设在蛋白质赖氨酸残基侧链上的胺反应，当细胞表面在碱性条件下脱质子时，后者与生物素部分⁷形成酰胺键。因此，可以通过使用抗生物素蛋白（一种对生物素具有极大亲和力的66-69kDa四聚体蛋白）来分离细胞表面蛋白，以约^10-15的解离常数结合后者，将其标记为最强非共价相互作用已知^{8 ， 9} 。

在以前的研究中已经使用了许多量化蛋白质在细胞表面的方法。使用针对目的蛋白质特异性的荧光标记抗体进行标记，然后通过荧光显微镜观察是常用的方法，但是严重依赖于可结合细胞外表位的抗体的可用性。最近，已经成功地使用涉及使用与暴露于酸性介质反应的具有pH敏感性荧光团的嵌合蛋白质的方法。然而，这样的测定通常涉及这些构建体在其中未被天然存在的目的蛋白质的细胞系中的外源表达。这些方法仍然能够提供关于亚细胞定位和胞外步行的有价值的信息因此如果这些工具可用，则应与本文所述的基于生物素化的方法结合使用。

在典型的生物素化测定中，首先在4℃PBS中彻底洗涤细胞。这样可以消除由培养基引入的任何痕量的血清蛋白，从而确保在下一步中这些不会消耗过量的生物素。更重要的是，降低温度会导致内吞作用显着减速。然后加入生物素化试剂。接下来，再次洗涤细胞，然后与含有甘氨酸或NH ₄ Cl的淬灭缓冲液一起温育，其目的是灭活所有剩余痕量的未反应的生物素。然后将细胞裂解，随后加入琼脂糖固定的链霉抗生物素蛋白以沉淀生物素化的蛋白质。分析通常通过western印迹进行，允许各种pr的相对细胞表面表达oteins要量化。

由于该测定的基础，它仅适用于具有暴露于细胞外环境的部分的蛋白质。可能在其环区内可能具有许多反应性赖氨酸的多巴跨膜蛋白是该方法中最容易的，而单程蛋白往往不太容易被生物素化。即使在这些情况下，仍然存在构象变化或分子间相互作用可能堵塞某些活性位点的可能性，导致低于预期的生物素化产率。

通过生物素化测定细胞表面蛋白的内在化率

该测定的原理与细胞表面生物素化的原理大致相同，除了一些例外，其中最重要的是使用可逆生物素化试剂。生物素组（其中的）具有disu在其结构内的易受还原剂影响的粘合剂;这被开发以确保仅在测定期间摄入细胞内部位的细胞表面蛋白质将被遗传生物素化。测定通常以以下方式进行。首先用冷试剂洗涤细胞并生物素化，然后重新引入37℃的细胞培养基，将细胞返回培养箱;这导致标记的细胞表面蛋白质经历内吞。然后加入不能穿透膜的还原剂谷胱甘肽，以破坏与残留在细胞表面上的蛋白质连接的生物素部分的二硫键。最后，破坏的二硫键与碘乙酰胺反应，消耗不稳定的硫醇基并防止键重组。如前所述，然后将细胞裂解，并使用链霉抗生物素蛋白 - 琼脂糖沉淀标记的蛋白质。

限制光盘由于在方法之间共享的相似之处，上一节中所使用的内容也适用于此。此外，值得铭记的是，该测定中涉及的温度变化阻止了对于每次增量的时间内含量多少蛋白质的确切测定，特别是在迅速内化或快速回收蛋白质的情况下。因此，该测定仅提供了内吞率的半定量估计。全内反射荧光显微镜可用于跟踪每个加载的囊泡的摄取，并提供更精确的内吞动力学测量。因此，假设目标蛋白的荧光标记嵌合构建体可用，因此可以提供非常有用的补体。

方案

1.通过生物素化测定星形胶质细胞中的相对细胞表面蛋白表达

注意:在这里，我们说明了这种生物素化技术在细胞外基质分子层粘连蛋白对透水通道水通道蛋白-4（AQP4）的细胞表面定位的影响的研究中的应用。该测定所需的专用材料包括磺基-NHS-LC-生物素和链霉亲和素 - 琼脂糖树脂（参见材料表 ）。

1. 使用Noel 等人概述的方法¹² ，在测定前约2周准备皮层星形胶质细胞培养物，并在75cm ^2的通气培养瓶中培养。当星形胶质细胞为80-90％融合时，使用0.05％胰蛋白酶将其从培养物表面分离出来，然后通过1:3。
2. 在测定前48小时，当细胞再次融合80-90％时，通过星形胶质细胞1:3（占c以培养形式变化）到60mm细胞培养皿上，使得在实验发生的当天> 70％汇合。确保细胞均匀分布在盘间。
3. 在测定前16小时，将层管蛋白移液到培养基中至最终浓度为24nM，并在37℃下孵育。
4. 在测定前，准备好以下物质，然后置于冰或冷藏中:将CM-PBS（100mg / L MgCl _2· 6H ₂ O和100mg / L CaCl ₂在1X PBS中，pH7.4），生物素缓冲液（0.5 （CM-PBS中的mg / mL磺基-NHS-LC-生物素），猝灭缓冲液（CM-PBS中的50mM NH ₄ Cl），裂解缓冲液（25mM Tris，pH 7.4,25mM甘氨酸，150mM NaCl和5mM EDTA，1％triton X-100,1X蛋白酶抑制剂混合物），3X加载缓冲液（150mM Tris，pH 6.8,6％SDS，30％甘油，300mM DTT和0.01％溴酚蓝）和洗涤缓冲液Tris（pH 7.4），1.5mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100,1X蛋白酶抑制剂混合物）。
5. 雷姆从培养箱中拿着星形胶质细胞培养皿，然后弃去培养基。
6. 用4 mL冷冻的CM-PBS将细胞洗涤3次，并将其放在碎冰上。
7. 将2 mL生物素缓冲液吸入每个孔中，并轻轻地将菜肴往前倾几次，以确保完全覆盖。在冰上休息30分钟。
8. 用吸气器取出生物素缓冲液，并用4 mL淬灭缓冲液代替。在冰上离开10分钟。
9. 吸入淬火缓冲液，并用相同体积的相同体积代替。再次，在冰上离开10分钟。
10. 弃去淬灭缓冲液，用4 mL冷冻的CM-PBS洗涤细胞三次。
11. 使用细胞提升器将细胞切成1mL冷冻的CM-PBS，并将悬浮液转移到微量离心管中。
12. 通过在100×g离心3分钟来制备粒细胞。弃去上清液，并将细胞重新悬浮于500μL裂解缓冲液中。
13. 将样品放在冰上30分钟，每5分钟振荡一次在4°C的端端旋转器上。
14. 在4℃下以14,000xg离心裂解物10分钟，以沉淀任何不溶于洗涤剂的物质。将上清液转移到新的微量离心管中。
    1. 保存50μL此裂解液，加入缓冲液。然后在95℃下在干浴中加热变性;这是"输入"分数，含有生物素化的细胞表面蛋白质，以及非生物素化的胞质蛋白质。
15. 使用一把锋利的剪刀从其末端切掉大约0.5厘米的材料，从而扩大移液器吸头的开口。使用该吸管头，将75μL链霉抗生物素蛋白 - 琼脂糖珠（通常在4°C下储存）转移到裂解物中，并在4℃下在振荡器/摇杆上孵育3小时。
    1. 作为链霉抗生物素蛋白 - 琼脂糖经常作为含有50体积％的珠粒的浆料出售，悬浮在抗微生物溶液中，研磨该浆料以确保珠粒均匀悬浮，然后将150μL悬浮液移液到每个样品中。
16. 颗粒链霉亲和素 - 琼脂糖珠子，在4℃下以1500xg离心30秒。
    1. 保存50μL上清液（加入缓冲液，并在95℃在水浴或加热块中变性）;这代表"细胞内"级分，并且主要由非生物素化的胞质蛋白组成。
17. 将沉淀的珠子重悬于1mL洗涤缓冲液中，并在4℃下摇匀3分钟。颗粒珠（如步骤1.16），并弃去上清液。重复此过程4x以最小化非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
18. 通过离心（1500xg，4℃，30s）离心沉淀珠粒，并丢弃上覆的洗涤缓冲液。加入50μL的1X加载缓冲液（用裂解缓冲液稀释）。通过在95℃下将其变性从珠中释放生物素和链霉亲和素;这个分数只能含有生物素化的细胞表面蛋白质（"细胞表面"部分）。
    1. 通过SDS-PAGE ¹³分离输入，细胞表面和细胞内级分，并通过蛋白质印迹分析¹⁴ 。
       注意:虽然我们在我们的实验中使用了4 - 20％的预制梯度凝胶，但是在本研究中，12-14％的分离凝胶与4％堆叠层（每个含有0.1％SDS）都足以满足感兴趣的蛋白质。还应使用适当尺寸范围的分子量标准。注意，有时可以观察到生物素化蛋白质的表观分子量升高。

2.通过生物素化测定星形胶质细胞中细胞表面蛋白的内在化率

注意:在下文中，我们描述了在这种情况下用于跟踪星形胶质细胞中AQP4的内吞作用的典型脉冲追踪生物素化实验。这个方法基于马德里等人使用的方法¹⁵ 。所需的专门材料包括磺基-NHS-SS生物素，链霉抗生物素蛋白 - 琼脂糖树脂，还原型谷胱甘肽和碘乙酰胺（参见材料表 ）。

1. 使用上一节中概述的方法，在60 mm的培养皿中制备小鼠皮层星形胶质细胞的培养物。确保细胞在测定当天约70％汇合，并且每个培养皿含有相当数量的细胞。
2. 在测定之前，准备好以下物质，并置于冰或冷藏中:将CM-PBS（100mg / L MgCl _2· 6H ₂ O和100mg / L CaCl ₂在1X PBS，pH7.4中），生物素缓冲液（0.5在CM-PBS中的mg / mL磺基-NHS-SS生物素），还原缓冲液（50mM还原型谷胱甘肽，75mM NaCl和75mM NaOH），淬灭缓冲液（50mM碘乙酰胺，1％BSA，在CM-PBS中）裂解缓冲液（25mM Tris，pH 7.4,25mM甘氨酸，150mM NaCl和5mM EDTA，1％triton X-100,1X蛋白酶抑制剂混合物），3X加载缓冲液（150mM Tris，pH 6.8,6％SDS，30％甘油，300mM DTT和0.01％溴酚蓝）和洗涤缓冲液（10mM Tris，pH 7.4,1.5mM EDTA， 150mM NaCl，1％triton X-100,1X蛋白酶抑制剂混合物）。
3. 准备新鲜细胞培养基（补充有10％胎牛血清（FBS），1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺的DMEM），并将其置于37℃水浴中。
4. 从培养箱中取出星形胶质细胞培养物，并用吸液器抽吸培养基。
5. 用4 mL冷冻的CM-PBS将细胞洗涤3次，并将其放在碎冰上。
6. 将3 mL生物素缓冲液吸入每个培养皿中，往前后摆动几次，以确保缓冲液分布均匀，并将其放在冰上30分钟。
7. 吸出生物素缓冲液，并用5 mL温培养基代替。在37℃培养培养皿15分钟，并在同一温度下培养30分钟。在4点再留个菜6; C为0分钟样品。
8. 在孵育期结束时，弃去培养基，用4mL冷冻的CM-PBS洗涤细胞三次。在细胞上吸取6 mL还原缓冲液，并在冰上放置15分钟。
9. 取出还原缓冲液，然后用6 mL新鲜还原缓冲液取代。在冰上再放置15分钟。
10. 除去还原溶液，并用6 mL淬灭缓冲液代替。在冰上离开15分钟。
11. 再次重复淬火步骤。
12. 丢弃淬灭缓冲液，用4 mL冷冻PBS洗涤细胞三次。
13. 使用细胞提升器将细胞切成1mL冷冻的PBS，并将悬浮液转移到微量离心管中。
14. 通过在100×g离心3分钟来制备粒细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于500μL裂解缓冲液中。
15. 将其放在冰上30分钟，每5分钟旋涡一次。或者，将样品放置在4°C的终端旋转器上。
16. 离心机在4℃下以14,000xg的速度放置10分钟以沉淀洗涤剂不溶物质，然后将上清液转移到新的微量离心管中。保存50μL此裂解液，加入缓冲液，并在95℃在干燥浴中变性;这是"输入"分数，含有生物素化的内吞蛋白质，以及非生物素化的蛋白质。
17. 使用切割的吸头，将150μL的链亲和素 - 琼脂糖浆液加入到裂解物中，并在4℃下在振荡器/摇臂上孵育3小时。有关此步骤的更多详细信息，请参阅1.15。
18. 颗粒链亲和素 - 琼脂糖珠子，在4℃下以1500×g离心30秒。
19. 将珠重悬于1mL洗涤缓冲液中，并在4℃下摇动3分钟。颗粒珠（按照步骤2.18），弃去上清液。重复此过程4x以最小化非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。
20. 通过在4℃下以1,500×g离心30秒，并弃去颗粒珠洗涤缓冲液。加入50μL1X加载缓冲液（用裂解缓冲液稀释）。通过在95℃变性从珠粒释放生物素和链霉亲和素;这个部分应该仅含有内在的细胞表面蛋白质（"胞吞"部分）。
21. 通过SDS-PAGE ¹³分离输入，细胞表面和未结合部分，并通过蛋白质印迹分析¹⁴ 。
    注意:虽然我们在我们的实验中使用了4 - 20％的预制梯度凝胶，但是在本研究中，12-14％的分离凝胶与4％堆叠层（每个含有0.1％SDS）都足以满足感兴趣的蛋白质。还应使用适当尺寸范围的分子量标准。注意，有时可以观察到生物素化蛋白质的表观分子量升高。

结果

使用细胞表面生物素化来评估星形胶质细胞中AQP4的质膜表达
使用所述方法将层粘连蛋白处理的星形胶质细胞培养物和未处理的对照细胞进行细胞表面生物素化。用琼脂糖缀合的链霉亲和素沉淀生物素化的蛋白质，然后通过SDS-PAGE分离。探测细胞表面级分作为细胞表面加载对照的AQP4和β-dystroglycan（β-DG），同时将输入和细胞内级分吸入AQP4和β-肌动蛋白（ 图 1A ）作为加载对照。通过光密度测定法对细胞表面级分的带强度进行定量，并且首先针对β-DG值对每组细胞的AQP4水平进行归一化，然后将这些比值与对照细胞的那些标准化。直方图（ 图1 B ）代表三次独立实验的平均值±SEM。平均来说，层粘连蛋白治疗导致在细胞表面表达的AQP4增加近2倍。

讨论

修改:
由于这些方法设计用于贴壁细胞，我们已经规定了使用含有100mg / L MgCl _2· 6H ₂ O的PBS和

100mg / L的CaCl ₂ （CM-PBS）洗涤步骤，并作为某些缓冲液的碱基，以确保细胞保持附着于培养物表面，并且细胞 - 细胞结不被破坏。然而，如果细胞在程序的每个步骤之间沉淀，则该协议也可以应用于非贴壁细胞类型。在这些情况下，可以用PBS代替CM-PBS。

此外，重要的是要注意，这里提到的每个条件都是本协议的特定内容，如果方法用于其他应用程序，则只应将其视为粗略的指导原则。特别地，应该独立地验证洗涤剂提取程序是否适用于此r细胞类型，并且离心机设置适用于细胞类型，并且适用于使用的链霉亲和素 - 琼脂糖珠粒。

最后，如果有关于非特异性结合和/或过度背景的担忧，可以用市场上目前可获得的各种其他抗生物素蛋白形式代替链霉亲和素。例如，去糖基化...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵 （NH<亚>4Cl）	Fisher Scientific	A661-500
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A9647-50
溴酚蓝	Bio-Rad	#1610404
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
乙二胺四乙酸二钠二水合物 （EDTA）	Bio-Rad	#1610729
二硫苏糖醇 （DTT）	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素	Thermo Fisher Scientific	#21331
胎牛血清 （FBS）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898
来自 Engelbreth-Holm-Swarm 鼠肉瘤基底膜	Sigma-Aldrich	L2020
L-谷氨酰胺	Gibco/赛默飞世尔科技	25030-081
小鼠单克隆抗 β;-肌动蛋白抗体 （AC-15）	Sigma-Aldrich	A5441
小鼠单克隆抗 β;-肌营养不良蛋白聚糖抗体 （43DAG1/8D5）	Leica Biosystems	B-DG-CE
青霉素/链霉素	Gibco/赛默飞世尔科技	15140-122
过氧化物酶 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗兔 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
还原型谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G6529
氯化钠 （NaCl）	Fisher Scientific	S271-500
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Sigma-Aldrich	862010
氢氧化钠 （NaOH）	Fisher Scientific	S318-100
链霉亲和素琼脂糖树脂	Thermo Fisher Scientific	#20347
兔多克隆抗 AQP4 抗体	Alomone	AQP-004
Tris 碱（Trizma 碱）	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	费舍尔科学	BP151-500