使用生物素化测定原代星形细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达和吞噬率

摘要

本报告提供了两种基于生物素化的方法，设计用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达和内吞率。

摘要

细胞表面蛋白介导各种功能。在许多情况下，它们的活性受调节其在质膜上的水平的内吞过程的调节。在这里，我们提供了有助于研究这些过程的两种方法的详细方案，这两种方法均基于细胞表面蛋白的生物素化原理。第一个被设计为允许半定量测定细胞表面上特定蛋白质的相对水平。其中，细胞的质膜蛋白的赖氨酸残基首先用生物素部分标记。一旦细胞被裂解，然后可以通过利用琼脂糖固定的链霉亲和素通过利用后者对于生物素的天然亲和力来特异性沉淀这些蛋白质。然后可以通过标准的Western印迹方法分析以这种方式分离的蛋白质。第二种方法提供了确定特定细胞吞噬率的方法ar细胞表面目标在一段时间内。首先用含有可切割二硫键的生物素衍生物修饰细胞表面蛋白。然后将细胞转移回正常培养条件，这导致一部分生物素化蛋白质的内吞摄取。接下来，使用膜不可渗透的还原剂谷胱甘肽使非内化生物素基团的二硫键减少。通过这种方法，内吞的蛋白质因此可以以高度的特异性被分离和定量。

引言

细胞表面的蛋白质起着维持细胞功能的重要作用。在许多情况下，它们的活性依赖于或者通过内吞过程调节，这些内吞过程暂时将其封闭在胞内位点，或者将它们引导到降解途径^1,2,3,4,5 。在这里，我们强调了2种基于生物素化的方法，旨在允许用户专门标记和分离在质膜上表达的蛋白质，以及新内化的蛋白质。通过这些方法，可以量化任何目的蛋白质的细胞表面表达和内吞速率，从而允许更清楚地评估其调节。

通过生物素化测定相对细胞表面蛋白的表达

生物素或维生素B7（以前称为维生素H ⁶ ）是一种小水溶性分子，可用于化学修饰生物分子的活性胺，巯基和羧基。目前的细胞表面生物素化试剂主要由生物素或其衍生物的膜 - 不渗水磺化N-羟基琥珀酰亚胺（磺基-NHS）酯组成，其与设在蛋白质赖氨酸残基侧链上的胺反应，当细胞表面在碱性条件下脱质子时，后者与生物素部分⁷形成酰胺键。因此，可以通过使用抗生物素蛋白（一种对生物素具有极大亲和力的66-69kDa四聚体蛋白）来分离细胞表面蛋白，以约^10-15的解离常数结合后者，将其标记为最强非共价相互作用已知^{8 ，}

方案

1.通过生物素化测定星形胶质细胞中的相对细胞表面蛋白表达

注意:在这里，我们说明了这种生物素化技术在细胞外基质分子层粘连蛋白对透水通道水通道蛋白-4（AQP4）的细胞表面定位的影响的研究中的应用。该测定所需的专用材料包括磺基-NHS-LC-生物素和链霉亲和素 - 琼脂糖树脂（参见材料表 ）。

1. 使用Noel 等人概述的方法¹² ，在测定前约2周准备皮层星形胶质细胞培养物，并在75cm ^2的通气培养瓶中培养。当星形胶质细胞为80-90％融合时，使用0.05％胰蛋白酶将其从培养物表面分离出来，然后通过1:3。
2. 在测定前48小时，当细胞再次融合80-90％时，通过星形胶质细胞1:3（占c以培养形式变化）到60mm细胞培养皿上，使得在实验发生的当天> 70％汇合。确保细胞均匀分布在盘间。
3. 在测定前16小时，将层管蛋白移液到培养基中至最终浓度为24nM，并在37℃下孵育。
4. 在测定前，准备好以下物质，然后置于冰或冷藏中:将CM-PBS（100mg / L MgCl _2· 6H ₂ O和100mg / L CaCl ₂在1X PBS中，pH7.4），生物素缓冲液（0.5 （CM-PBS中的mg / mL磺基-NHS-LC-生物素），猝....

结果

使用细胞表面生物素化来评估星形胶质细胞中AQP4的质膜表达
使用所述方法将层粘连蛋白处理的星形胶质细胞培养物和未处理的对照细胞进行细胞表面生物素化。用琼脂糖缀合的链霉亲和素沉淀生物素化的蛋白质，然后通过SDS-PAGE分离。探测细胞表面级分作为细胞表面加载对照的AQP4和β-dystroglycan（β-DG），同时将输入和细胞内级分吸入AQP4和β-肌动蛋白（ 图 1A ）作为加载对照。通过光密度测定法对细胞表面级分的带强度进行定量，并且首先针对β-DG值对每组细胞的AQP4水平进行归一化，然后将这些比值与对照细胞的那些标准化。直方图（ 图1 B ）代表三次独立实验的平均值±SEM。平均来说，层粘连蛋白治疗导致在细胞表面表达的AQP4增加近2倍。

讨论

修改:
由于这些方法设计用于贴壁细胞，我们已经规定了使用含有100mg / L MgCl _2· 6H ₂ O的PBS和

100mg / L的CaCl ₂ （CM-PBS）洗涤步骤，并作为某些缓冲液的碱基，以确保细胞保持附着于培养物表面，并且细胞 - 细胞结不被破坏。然而，如果细胞在程序的每个步骤之间沉淀，则该协议也可以应用于非贴壁细胞类型。在这些情况下，可以用PBS代替CM-PBS。

此外，重要的是要注意，这里提到的每个条件都是本协议的特定内容，如果方法用于其他应用程序，则只应将其视为粗略的指导原则。特别地，应该独立地验证洗涤剂提取程序是否适用于此r细胞类型，并且离心机设置适用于细胞类型，并且适用于使用的链霉亲和素 - 琼脂糖珠粒。

最后，如果有关于非特异性结合和/或过度背景的担忧，可以用市场上目前可获得的各种其他抗生物素蛋白形式代替链霉亲和素。例如，去糖基化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵 （NH<亚>4Cl）	Fisher Scientific	A661-500
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A9647-50
溴酚蓝	Bio-Rad	#1610404
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
乙二胺四乙酸二钠二水合物 （EDTA）	Bio-Rad	#1610729
二硫苏糖醇 （DTT）	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素	Thermo Fisher Scientific	#21331
胎牛血清 （FBS）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898
来自 Engelbreth-Holm-Swarm 鼠肉瘤基底膜	Sigma-Aldrich	L2020
L-谷氨酰胺	Gibco/赛默飞世尔科技	25030-081
小鼠单克隆抗 β;-肌动蛋白抗体 （AC-15）	Sigma-Aldrich	A5441
小鼠单克隆抗 β;-肌营养不良蛋白聚糖抗体 （43DAG1/8D5）	Leica Biosystems	B-DG-CE
青霉素/链霉素	Gibco/赛默飞世尔科技	15140-122
过氧化物酶 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
过氧化物酶 AffiniPure 山羊抗兔 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
还原型谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G6529
氯化钠 （NaCl）	Fisher Scientific	S271-500
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Sigma-Aldrich	862010
氢氧化钠 （NaOH）	Fisher Scientific	S318-100
链霉亲和素琼脂糖树脂	Thermo Fisher Scientific	#20347
兔多克隆抗 AQP4 抗体	Alomone	AQP-004
Tris 碱（Trizma 碱）	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	费舍尔科学	BP151-500