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纳米孔DNA测序用于宏基因组土壤分析

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DOI：

10.3791/55979

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2017年12月14日

 ,  , 
1Center for Biotechnology Education, Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

纳米孔测序技术在生命科学领域具有广泛应用，包括病原体鉴定、食品安全监测、基因组分析、宏基因组环境监测以及细菌抗生素耐药性表征。本文展示了利用纳米孔测序技术对土壤DNA进行宏基因组测序以实现物种鉴定的操作流程。

摘要

本文介绍了从土壤中构建DNA文库的步骤、纳米孔流动池的制备与使用方法，以及利用计算机软件对所鉴定的DNA序列进行分析的过程。纳米孔DNA测序是一种灵活的技术，可用于快速进行微生物基因组测序，以鉴定细菌和病毒种类、表征细菌菌株，并检测赋予抗生素耐药性的遗传突变。纳米孔测序（NS）在生命科学领域的优势包括操作复杂度低、成本较低，以及能够对纯化的基因组DNA、PCR扩增子、cDNA样本或RNA进行快速的实时测序。NS属于“链测序”技术，其原理是将单链DNA分子引导通过嵌入合成聚合物膜中的纳米孔。膜两侧施加有电流，当各个碱基通过纳米孔时，四种核苷酸碱基会以不同程度干扰电流。通过检测不同碱基通过纳米孔时引起的特征性电流变化，即可识别每个核苷酸。NS系统由一个手持式、USB供电的便携设备和一个包含纳米孔阵列的一次性流动池组成。该便携设备可插入标准笔记本电脑，通过计算机软件读取并记录DNA序列。

引言

本实验的目的是演示环境DNA文库制备测序所需的步骤、纳米孔测序流动池设备的使用方法，并利用系统软件及美国国家生物技术信息中心（NCBI）的生物信息学工具对生成的DNA序列进行分析，以鉴定土壤中的微生物种类。目前，大多数DNA测序平台需要投入大量资源进行专业技术培训并配备复杂的仪器设备，这在资源有限的环境或野外应用中难以实现。纳米孔测序（NS）平台通过经济高效、操作简便的文库构建流程以及便携式测序设备，克服了上述问题，可对多种类型的核酸进行测序与分析1,3。我们已将该NS平台应用于多个面向硕士研究生的实验课程中。

纳米孔技术在生物分子测序方面已展现出广泛的生命科学应用，包括细菌和病毒病原体的鉴定1,2,6环境生物多样性研究、食品安全监测、基因组分析3,5细菌抗生素耐药性的检测与表征4. NS 是一种快速且准确的核酸测序方法，其原理基于 "链特异性测序" 通过单链DNA穿过插入带电合成聚合物膜的纳米孔时，检测单个核苷酸碱基引起的电信号变化。NS测序中DNA制备步骤包括基因组片段化、末端修复及3'端dA加尾、接头与连接子与DNA的退火连接、DNA文库纯化，以及将文库加载至纳米孔流动池装置。基因组片段化为约8 kb大小，可通过将1–2 µg基因组DNA在g-tube片段化管中离心实现。随后利用商业化试剂盒对片段化的基因组末端进行修复并添加poly dA尾。添加的单链接头序列可与纳米孔马达蛋白兼容，连接至DNA末端，用于引导DNA序列通过纳米孔图1）。引物序列用于DNA纯化以及将DNA分子定位至孔膜。通过将发夹接头连接至dA加尾文库的一端生成发夹结构。DNA末端的发夹结构使得DNA在通过纳米孔时能够读取正义链和反义链。图2随后使用链霉亲和素磁珠在磁场作用下对制备的基因组文库进行纯化，然后将样品加载至纳米孔流动池中进行分析。

对测序得到的DNA进行质量评估，符合分析要求的测序读段将被用于多种生物信息学工具以鉴定微生物。序列需从FAST5格式"转换为"FASTQ格式。在FASTQ格式下，序列即可用于BLAST分析。

方案

注意：使用市售的土壤基因组提取试剂盒（参见材料表），从土壤（美国马里兰州巴尔的摩县）中纯化宏基因组DNA。使用紫外分光光度计（参见材料表）检测，纯化后的基因组DNA的260/280（nm）比值应>1.8，260/230比值应在2.0 - 2.2之间，以确保样品无污染物。进行NS实验所需的基因组DNA用量为200 ng至2 µg。

1. 快速文库构建方法（简明方案）

注意：这是一个简要的实验方案。快速测序试剂盒的相关信息请参见材料表。

  1. 在0.2 mL薄壁管（参见材料表）中加入200 ng高分子量DNA，最终体积为7.5 µL蒸馏水。
  2. 加入2.5 µL快速文库制备试剂盒中的片段化混合液（FM），轻轻颠倒混匀。瞬时离心（1,000 × g，5秒）以收集液体。
  3. 将样品放入热循环仪（参见材料表）中，进行一轮反应：30 °C孵育1分钟，随后75 °C孵育1分钟。取出管子并瞬时离心以收集样品。
  4. 加入1 µL快速接头和0.2 µL平末端/TA连接酶主混合液，然后将接头连接并固定的文库置于冰上保存。
    注意：若采用短流程，请直接进入第8步

2. 连接测序方案（长片段方案）：宏基因组DNA片段化

注意：有关连接测序试剂盒，请参见材料表。

  1. 将1 µg纯化的基因组DNA用去离子水稀释至终体积46 µL。
  2. 将样品转移至DNA片段化管（见材料表），使用微量离心机（见材料表）在室温下以8,000 × g离心1分钟，以产生约8 kb的基因组片段。确保所有液体均已进入收集管中。
  3. 将片段化管倒置，重新放入离心机，再以8,000 × g离心1分钟，使片段化的基因组DNA收集至下层腔室。
  4. 将片段化的基因组DNA转移至无菌低DNA吸附的1.5 mL离心管中，并取部分样品在低浓度琼脂糖凝胶（0.6%）上进行分析，以确认片段化程度达到>30 kb。

3. 基因组DNA片段末端制备

  1. 取 800 ng 剪切后的基因组 DNA 溶于 45 µL 去离子水中，加入 7 µL 末端修复反应缓冲液（见材料表）、3 µL 酶混合物（见材料表）和 5 µL 无核酸酶水。
  2. 通过倒置混匀，并短暂离心（1,000 × g，5 秒）。
  3. 将样品转移至 0.2 mL 薄壁管中，在 20 °C 孵育 5 分钟，随后在 65 °C 孵育 5 分钟。
  4. 短暂离心，使管内液体沉降至管底。
  5. 将样品转移至 1.5 mL 低 DNA 结合力微量离心管中。
  6. 准备磁珠（见材料表）。向第 3.5 步的末端修复反应体系中加入 60 µL 重悬的磁珠，并用移液器吹打混匀。
  7. 在旋转混合仪上以 100 rpm（见材料表）于室温孵育 5 分钟。
  8. 短暂离心使磁珠沉淀，然后将样品置于磁力架旁。
  9. 待磁珠吸附至管壁后，用移液器吸除上清液并弃去。
  10. 将管从磁力架上取下，加入 200 µL 新配制的 70% 乙醇，轻轻吹打样品上下混合以洗涤磁珠。
  11. 短暂离心使磁珠沉淀，再放回磁力架上。
  12. 吸除上清液并弃去。重复洗涤步骤一次，使用 200 µL 70% 乙醇。
  13. 短暂离心管子，放回磁力架，并彻底去除所有 70% 乙醇洗涤液。
  14. 保持微量离心管管盖打开，于室温下让磁珠空气干燥 5 分钟。
  15. 将管从磁力架上取下，将沉淀物重悬于 31 µL 无菌、无核酸酶的水中。于室温孵育 2 分钟。
  16. 将管放回磁力架，直至所有磁珠完全沉淀且洗脱液澄清。
  17. 将洗脱液转移至 1.5 mL 微量离心管中。取 1 µL 样品，使用紫外分光光度计在 260 nm 处定量末端修复后的 DNA（见材料表）。
    注意：从 1 µg 基因组 DNA 起始，回收率应约为 70%（700 ng）。

4. 向末端预处理的基因组DNA片段添加接头和连接物

  1. 将所有平末端/TA连接酶预混液管颠倒混匀，然后瞬时离心，使管内液体全部收集至管底。
  2. 取30 µL末端处理后的DNA，加入20 µL接头混合液和50 µL平末端/TA连接预混液。
  3. 轻轻颠倒混匀，瞬时离心后，在室温下孵育10分钟。

5. 磁性 B样品制备

  1. 涡旋混匀磁珠，然后取50 µL悬浮磁珠转移至1.5 mL微量离心管中。
  2. 将管子置于磁力架上，使磁珠沉降直至上清液变澄清。
  3. 移除上清液并弃去。
  4. 向磁珠中加入100 µL磁珠结合缓冲液（参见材料表中的磁珠试剂盒），涡旋振荡以重悬磁珠，将磁珠置于磁力架上沉降，移除上清液并弃去。再用100 µL结合缓冲液重复洗涤一次。
  5. 向洗涤后的磁珠中加入100 µL磁珠结合缓冲液，涡旋振荡以充分重悬磁珠。

6. 文库纯化

  1. 使用P200移液器，将上一步中的40 µL磁珠加入已适配/固定的基因组DNA中。通过移液小心混匀样品。
  2. 将样品置于旋转混合仪上，于室温下以100 rpm孵育5分钟。
  3. 将样品放置于磁力架上，使磁珠沉降。用移液器吸除上清液并弃去。
  4. 用140 µL磁珠结合缓冲液重悬磁珠，通过移液混匀。将样品置于磁力架上，弃去上清液，并用另外140 µL磁珠结合缓冲液再次洗涤。
  5. 短暂离心管体，然后将管置于磁力架上静置2分钟。移除沉淀中残留的磁珠结合缓冲液。

7. 从磁珠中洗脱文库

  1. 用移液器将磁珠重悬于15 µL洗脱缓冲液中。室温孵育样品10分钟。
  2. 将离心管置于磁力架上使磁珠沉降。待溶液澄清后，吸取15 µL洗脱液转移至1.5 mL微量离心管中，并将样品置于冰上。
  3. 使用紫外分光光度计对文库进行定量。
    注意：从1 µg基因组DNA起始，回收率应约为25%（250 ng）。

8. 开始运行/质量控制

  1. 从包装中取出流动池，并将流动池连接到便携式实时测序仪（参见材料表）。
  2. 通过 USB 线缆将测序仪连接至计算机，并启动测序软件（参见材料表）。
  3. 在测序软件中点击"Connect"设备，选择"NC_Platform_QC.py"，然后点击"Start"。
  4. 质量控制（QC）过程大约需要 6 – 7 分钟完成；在 QC 读数中观察“一片绿色”（大面积信号输出），以确认有足够的活性孔（>800）用于 DNA 测序。

9. 启动测序运行

  1. 打开测序程序，将出现一个对话框。在“样本编号”框中为样本命名。
  2. 点击"芯片编号"框，并输入位于芯片顶部标签上的代码。
  3. 打开芯片盖，然后将样品入口盖向右滑动（顺时针方向），使样品入口暴露可见。入口打开后，检查是否存在小气泡。移除包含气泡的几微升缓冲液。
  4. 检查传感器阵列表面是否覆盖有缓冲液。通过将480 µL运行缓冲液与燃料混合液（RBF-1，参见材料表）（务必先充分混匀）与520 µL无核酸酶水混合，配制引物缓冲液。
  5. 向引物入口加入800 µL引物缓冲液。小心抬起"SpotOn"盖，使其可接触。
  6. 5分钟后，向引物入口再加入200 µL引物缓冲液。

10. 文库的上样

  1. 在制备文库前，将以下试剂置于冰上：RBF-1（来自测序试剂盒）、已接头修饰并固定的文库，以及文库加载磁珠（LLB；来自测序试剂盒）。
  2. 向一个0.2 mL离心管中加入25.5 µL的RBF和12 µL室温放置的无核酸酶水。
  3. 用移液器反复吹打混匀LLB。取26.5 µL LLB加入0.2 µL离心管中。用移液器反复吹打混匀试剂。
    注意：LLB 倾向于从混合物中沉淀析出。
  4. 将11 µL经修饰并带有接头的文库加入0.2 µL离心管中。轻轻颠倒混匀，短暂离心甩至管底。
  5. 将步骤 9.4 中的 75 µL 样品加入到 "SpotOn" 逐滴加入端口，确保每滴液体完全流入后再加入下一滴。
  6. 小心地盖上样品口盖子，确保塞子插入端口，然后盖上设备盖子。

11. 启动测序软件实验方案脚本

  1. 在“选择程序”下拉菜单中，选择 "48小时测序"。
  2. 点击 "执行" 按钮以启动脚本。
  3. 检查通知流中报告的 Mux扫描 结果，查看 MUX扫描 中的活性孔数量。
    ​注意：该数值可能与质控运行中的孔数量不同，若差异较大，可能表明存在问题。
    1. 如果活性孔数量相较于质控运行显著减少，请重启软件；若仍存在显著差异，则需重启计算机。
  4. 检查测序软件脚本报告的散热片温度是否为 34 °C。
    注意：若温度未达到 34 °C，则运行时将没有足够的活性孔。
  5. 检查读长分布直方图，以确定序列长度是否符合实验设计的预期和要求。
  6. 使用“关闭 x”关闭桌面代理。通过关闭网页图形界面退出测序软件。将设备从计算机上断开连接。

12. 运行与结果分析

注意：在测序运行过程中，可使用以下方法对数据进行实时监测 "查看报告" 使用桌面代理程序。在运行期间或运行结束后，数据文件将以FAST5格式存储在 data → reads → pass 文件夹中（默认路径）。若在测序过程中打开此文件夹，计算机可能会冻结。

  1. 要查看和操作序列，请下载一个 "HDFViewer"。
  2. 要查看测序文件，直接打开 HDF 查看器 → 打开 Data 文件夹 → 选择所有文件类型 → 选择 C 盘（默认）→ 选择 data → 选择 reads → 选择 pass。
  3. 在左侧下拉菜单中查找并选择 FASTQ 文件；文件将被打开，并可保存为 FASTQ 格式。
    注意：为了学生实验的目的，选择长度为 350 个核苷酸或更长的序列进行进一步分析。碱基识别的输出结果允许用户根据序列长度对读段进行排序。FASTQ 文件可通过 BLAST（NCBI）或其他生物信息学程序进行分析。

结果

实验设计与纳米孔技术为学生提供了一种快速且低成本的土壤DNA测序方法。代表性测序运行通过了质控参数，有超过800个纳米孔可用于测序。该运行产生了超过125,000条可用于分析的测序读长，中位序列长度为5.38 kb。每条序列均被赋予质量评分，仅质量评分合格的序列被进一步分析。由于测序反应的输出格式为FAST5，而BLAST（NCBI）等程序无法直接读取该格式，因此需使用HDF浏览器将序列转换为FASTQ格式，以便进行BLAST分析。在软件的后续版本中，数据将直接以FASTQ格式提供，从而无需再使用HDF浏览器。参见补充图1、2和3。

选取了50条长度超过350个核苷酸的序列，使用BLASTN（核苷酸对核苷酸数据库）或BLASTX（将核苷酸翻译为氨基酸序列）（NCBI）进行分析，以鉴定土壤样本中的生物种类。由于课程时间有限，且本课程的重点在于实验方法而非生物信息学，因此我们要求学生在上述参数范围内进行序列分析。我们的生物信息学课程可利用这些数据开发分析流程工具。基于实验的课程不涵盖这一层次的生物信息学分析。表1列出了e值小于4e-04的已鉴定生物体。通常，e值小于4e-04表明输入序列（查询序列）与匹配序列之间具有高度相似性。通过BLASTN（针对非冗余（nr）数据库）鉴定出的生物体来自多种不同物种，可用于进一步的基因组和蛋白质分析。该土壤样本采自马里兰州巴尔的摩县的一个花园，此前从未经过检测，因此没有可用于判断土壤中可能含有哪些生物体的先前数据。BLASTN分析（针对nr数据库）还显示，部分序列在nr数据库中无任何相似序列。要确定这些是否为真正的新序列，还需进一步研究。通过BLASTX对多个序列的分析揭示出若干在BLASTN分析中未出现的生物体的蛋白质。表2列出了几种可能的蛋白质，包括内肽酶和ATP酶样蛋白质。利用该序列文库，学生可在教师指导下使用更复杂的生物信息学工具进行深入分析。

figure-results-1
图1：基因组文库构建。 使用纳米孔技术进行基因组DNA文库制备以用于测序的步骤。该图已根据必要许可进行了修改。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2。使用纳米孔进行DNA测序的示意图。 DNA穿过纳米孔膜，产生电信号并实现碱基识别。本图已根据需要进行了修改，并获得了必要的许可。请点击此处查看此图的放大版本。

生物体e 值
Streptomyces sp.3.00E-06
Nocardoides sp.5.00E-04
Gordonia sp.5.00E-04
Hyphomicrobium nitrativorens1.00E-139
Starkeya novella1.00E-31
Hyphomicrobium denitrificans1.00E-30
Fibomicrobium sp.5.00E-17
Pseudomonas sp.2.00E-15
Rhodothemus marinus1.00E-17
Turneiella parva2.00E-24
E. coli0.00E+00
Bradyrhizobium sp.3.00E-30
Gemmatirosa kalamazoonesis1.00E-20
Burkholderia sp.8.00E-10
Sphingomonas sp.8.00E-10
Cellumonas sp.6.00E-11

表1：BLASTN分析的部分结果。 对土壤宏基因组DNA序列在NCBI非冗余核苷酸数据库中进行BLASTN相似性搜索。报告的数据e值均小于或等于4 × e-4。

蛋白质 生物体
假定蛋白质 Acidobacter bacterium
SAM依赖性甲基转移酶  H. denitrificans
ATP酶  Jannaschia sp.
内肽酶 Shigella sonnei
裂解蛋白 E. coli

表2：BLASTX分析的部分结果。 土壤宏基因组DNA序列在NCBI非冗余蛋白数据库中进行BLASTX相似性搜索的结果。

figure-results-3
补充图1：平台质控结果。 此处展示了平台质控的结果。右上角显示了活性孔的质控结果，流动池的每个象限均接受了活性孔检测。主界面是动态的，随着每个象限的检测而变化。在本次运行中，共检测到1,414个单孔。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
补充图2：将FAST5文件转换为FASTQ文件。 右侧显示的是测序运行结果的数据输出，每一行代表一条独立的序列。图的左侧展示了右侧高亮显示的序列在HDF查看器中的情况，该查看器可将序列转换为可用于进一步分析的FASTQ文件。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-5
补充图3：HDF查看器中FASTQ序列示例。 该序列（读段803）位于一个FASTQ文件中，该文件将FAST5数据转换为核苷酸序列。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

许多新一代测序方法已被开发出来，这些方法均依赖于边合成边测序的原理，但在识别核苷酸的检测平台上有所不同。纳米孔测序（NS）是市场上最新的技术，其采用了一种完全不同的方法，无需进行测序反应或使用标记的核苷酸。该方法利用已整合的核苷酸在通过带电纳米孔时产生的电荷差异进行检测。当不同的碱基通过纳米孔时，会调制电流，从而实现对每种核苷酸的识别。这种多重化系统允许用户同时对多个片段进行测序。通过对DNA双链进行测序，序列的准确性显著提高，测序软件可安装在笔记本电脑上，用于处理信号并提供可供分析的序列信息。

在焦磷酸测序中，这种合成测序（SBS）方法通过荧光素酶检测和化学发光信号的产生来检测掺入模板的特定碱基8。在离子半导体测序中，释放的氢离子会降低pH值，该变化由离子传感器检测9。单分子实时测序依赖于零模波导（ZMW）10，该波导可照亮与掺入核苷酸相连的荧光分子以实现检测。SBS采用一种独特的方法扩增目标DNA，从而生成具有独特序列的簇13。当标记核苷酸的荧光信号被记录时，即可实现对添加核苷酸的检测。相比之下，纳米孔测序（NS）相较于其他方法具有独特优势：所需技术资源有限、设备便携、可产生长读长序列、无需预先进行DNA扩增，且运行成本低于其他方法。我们的学生发现，新的快速文库制备方案操作简便，适用于三小时的实验课程。我们遇到的一些问题包括流动池中难以去除的气泡、对计算机性能要求较高（需一太字节存储空间）、当前数据输出为FAST5文件格式，以及测序流动池在降解前保质期有限。此外，NS连接测序方案（长流程）的其他缺点包括：需要多个文库制备步骤、要求具备分子生物学技术的专业知识，并且与某些测序方法相比，测序保真度较低3。然而，近期推出的新型快速文库制备试剂盒仅需10分钟即可完成文库构建，且已显示出更低的测序错误率。这种新的文库制备方法非常适用于实验教学。

该实验方案中有多个关键步骤，特别是在芯片的质量控制方面。这包括在收到芯片后的五天内进行初始质量控制，并在八周内使用芯片。尽管我们曾使用过超过八周的芯片，但其开放/活性孔的数量显著减少。因此，实验应合理规划时间安排，以最大限度地利用芯片。我们已成功采用清洗方案并重复使用了芯片。

研究土壤宏基因组学代表了一个尚未开发的微生物多样性基因资源库。例如，据估计，一克土壤中含有 107 - 109 个原核生物细胞14。此外，土壤生物是新型天然产物、酶和抗生素的主要来源。因此，土壤宏基因组DNA序列分析是各级教育阶段学生有价值的教學工具。NS技术操作简便且成本低廉，使其成为一种非常有效的教学工具。学生可以对环境样本进行测序，并在完成测序后利用现有的生物信息学工具识别和表征测试样本中的微生物及宏基因组序列。通过使用NS技术，学生能够获得真正的动手实践经验，而由于其他测序平台需要较高的技术专业知识以及昂贵的试剂、设备和维护成本，此类实践此前在实验课程中难以实现。最近，我们的一名学生（J. Harrison，个人交流）报告了该技术在农田土壤环境监测项目中的应用。我们预计该技术将在教育领域有更多应用。

致谢

本项目部分得到了约翰斯·霍普金斯大学教务长办公室的资助 Gateway科学计划

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
热循环仪LifeECOBTC42096
Covaris g-TUBECovaris520079
NEBNext 末端修复模块新英格兰生物实验室（New England BioLab）E7546
Eppendorf LoBind 离心管Sigma-AldrichZ666505
NEB 平末端/TA 连接酶预混液新英格兰生物实验室（New England BioLab）M0367
MyOne C1 链霉亲和素磁珠赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）65001
Eppendorf 微型离心机Eppendorf型号 5420
Nanodrop 紫外分光光度计赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）ND-2000型号 2000
Belly Dancer 轨道摇床Sigma-AldrichZ768499
Power Soil DNA 提取试剂盒MO BIO12888-50
2D 连接测序试剂盒Oxford Nanopore SQK-LSK208
基因组 DNA 快速测序试剂盒Oxford Nanopore SQK-RAD002
末端修复反应缓冲液及酶混合液（NEB 平末端/TA 连接酶预混液）新英格兰生物实验室（New England BioLab）M0367
AmPure XP 磁珠贝克曼库尔特（Beckman Coulter）A63880
基础启动套装 Oxford Nanopore 包含 MinION  测序仪和流动池
MinKNOW 软件Oxford Nanopore 
基因组 DNA 快速测序试剂盒Oxford Nanopore SQK-RAD002包含含燃料的运行缓冲液（RBF）、片段化混合液（FRM）、快速接头（RAD）和文库加载磁珠（LLB）

参考文献

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