小鼠下颌骨髁突的形态学及细胞分析方法

Summary

本文介绍了分析啮齿动物下颌骨髁突内形态和细胞变化的方法。

Abstract

颞下颌关节具有适应外部刺激的能力, 负荷变化会影响髁的位置, 以及下颌髁突软骨的结构和细胞成分。本文介绍了分析这些变化的方法和改变小鼠颞下颌关节负荷的方法 (即,压缩静态颞下颌关节负荷)。这里的结构评估是一个简单的形态学方法, 使用 Digimizer 软件, 并在小骨骼的射线照相中进行。此外, 分析了细胞的变化导致胶原蛋白表达改变, 骨重塑, 细胞分裂, 和蛋白多糖分布的 MCC。在组织学切片的这些变化的量化-通过计数的阳性荧光像素使用图像软件和测量的距离测绘和染色面积与 Digimizer-也被证明。这里所示的方法不仅限于小鼠颞下颌关节, 还可用于小型实验动物和其他软骨骨化地区的骨骼。

Introduction

颞下颌关节是一个独特的 load-bearing 关节位于颅面地区, 是由软骨。颞下颌关节的 MCC 对于关节功能是必不可少的, 包括在说话和咀嚼时不受阻碍的颚运动, 但它通常受到退行性疾病的影响, 包括骨关节炎¹。颞下颌关节有能力适应外部刺激和负荷改变, 导致结构和细胞的变化的组成部分的 MCC^2,3,4,5。MCC 的 load-bearing 性能可以通过其成分之间的相互作用来解释, 包括水、胶原网络和密被包装的蛋白。MCC 有四独特的细胞区, 表达不同类型的胶原蛋白和 non-collagen 蛋白: 1) 表面或关节区;2) 增殖区, 由未分化的间充质细胞组成, 并对负荷需求作出反应;3) prehypertrophic 区, 由成熟的软骨细胞表达2型胶原;和 4) 肥厚区, 该地区的肥大软骨细胞表达型胶原10死亡, 并经历钙化。non-mineralized 地区是丰富的蛋白, 提供抗压缩力⁶。

在 MCC 的肥厚区有连续的矿化, 在那里从软骨到成骨的转变发生, 保证下颌髁突的下骨的健壮的矿物结构⁷。unmineralized 和矿化区的细胞变化最终导致下颌骨髁突和下颌骨的形态学和结构改变。维持 MCC 所有细胞区域的稳态和下部分的矿化, 对颞下颌关节的健康、load-bearing 能力和完整性至关重要。

多胶原蛋白转基因小鼠模型 (如 Utreja et al.所述)⁸是一个很好的工具, 可以用来理解胶原蛋白表达的变化, 因为所有的转基因都是在 MCC 中表达的。对于 in-depth 的组织学评价, 组织学染色用于研究基质沉积、矿化、细胞增殖和凋亡, 以及在 MCC 不同细胞层的蛋白质表达。

在这篇手稿中, 组织学和形态学分析被用来评价细胞和结构的变化, 在 MCC 和下骨的下颌髁突的小鼠。此外, 还描述了用于分析荧光组织学图像和绘制光学显微镜幻灯片的细胞定量方法。压缩静态颞下颌关节加载方法, 导致细胞和形态学的变化, 在 MCC 和下骨⁹, 也说明了验证我们的方法。

本文所述方法可用于确定鼠下颌骨髁突和下颌骨的形态和组织学变化, 或分析其他软骨骨化区和其他矿化组织的形态。

Protocol

康涅狄格大学卫生中心的机构动物保育委员会批准了所有的动物程序。

1. 压缩静态颞下颌关节负荷: 口强行打开

注: 四周老的转基因小鼠窝藏荧光记者的胶原蛋白 (Col2a1XCol10a1), 亲切提供由 Dr. 大卫罗 (康涅狄格大学), 被用于本手稿描述的实验 (n = 8; 4 男性和4女性)。Col2a1 青色 (蓝色) 转基因是在 MCC 的 prehypertrophic 区的细胞中表达的, 而 Col10a1 樱桃 (红) 细胞存在于肥厚区⁸ (图 1)。小鼠平均分为两组: 1) 荷载组, 小鼠受压迫静态颞下颌关节负荷 (描述在步骤 2) 和 2) 控制组, 其中小鼠不接受干预。

图 1。double-collagen 荧光报告鼠 (Col2a1XCol10a1) 的髁突的代表性矢状.缩放栏 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

1. 制造弹簧 usingbeta 钛合金丝 (0.017 x 0.025 英寸) (图 2A)。
2. 通过腹腔注射氯胺酮 (90 毫克/千克体重) 和嗪 (13 毫克/千克体重) 的混合物麻醉实验动物。
3. 轻轻地打开小鼠的嘴巴, 插入弹簧, 使上颌和下颌切牙的循环啮合 (图 2B 和 C)。
4. 在1小时的麻醉小鼠的门牙中保持弹簧, 从而诱发压缩静态颞下颌关节负荷. 重复这个过程5天。
5. 注射 5-ethnyl-2-脱氧 (教育; 30 毫克/千克体重) 腹腔细胞增殖分析2天和1天前安乐死的小鼠。

图 2。压缩静态颞下颌关节负荷: 口强迫开放模型.(A)弹簧制作 0.017 x 0.025 β钛合金丝。(B)装满弹簧的鼠标。(C)载入和控制小鼠的 x 射线显示下颌骨定位的差异。请单击此处查看此图的较大版本.

2. 下颌骨解剖和固定

1. 在强制开放口程序的端点, 通过一种认可的方法安乐实验动物。
2. 解剖下颌骨, 切断肌肉附着, 而不刮软骨的髁突。
3. 将清洁的下颌骨放在10% 福尔马林中, 用于24小时固定。
   注意: 福尔马林是刺激性的;穿戴适当的个人防护设备。

3. x 射线成像和形态测量

1. 将下颌骨放在一个扁平的容器中 (例如,一个 55 mm x 16 mm 的培养皿), 并在26伏的 5 s 上使用一个机柜 x 射线系统对样品进行射线照相。
   注意: 在保存图像之前放置刻度线。
2. 使用图像分析软件 (请参见材料表) 对下颌骨进行计量测量。
   注意: 在执行任何测量之前, 使用 x 射线的刻度栏来确定单位。这一步是重要的正确测量解剖结构。单击 "单位" 按钮 (图 3A)。
3. 使用成像软件中的 "标记样式 2" (图 3B) 选择解剖点。要遵循本文中描述的方法, 请选择以下点 (图 3B):
   1. 选择 condylion (点 1), 下颌髁突的最后点;
   2. 选择切牙过程 (点 2);
   3. 选择最深的点在乙状结肠切口 (点 3);
   4. 选取下颌升支凹陷的最深点 (点 4);
   5. 选择髁突关节面最前方的点 (点 5);和
   6. 选择髁突关节面的最后点 (点 6)。
4. 在选择解剖点后, 使用 "长度" 工具进行形态学测量, 但对于髁突长度, 使用 "垂直线" 工具从点 (3) 和 (4) (图 3C)。
   1. 测量下颌长度, 从 condylion (1) 到切牙过程 (2)。
   2. 测量髁突长度-从 condylion (1) 的垂直距离, 到从乙状结肠缺口 (3) 的最深点到下颌升支 (4) 凹陷最深点的线。
   3. 测量髁突的头部宽度--从最前面到最后点的髁关节面的距离 (5-6)。
   4. 从屏幕右侧的 "测量列表" 中复制度量值 (图 3C)。

图 3.下颌骨形态测量的表示。(A)使用 x 射线的刻度线确定单位 (以红色圆圈、刻度线:10 mm)。(B)使用 "标记样式 2" (红色圆圈) 选择解剖学点。1) Condylion;2) 切牙工艺;3) 在乙状结肠缺口处最深的点;4) 下颌支的凹陷最深的点;5) 髁突关节面的大部分前点;6) 髁突关节面最后点。缩放栏:10 mm(C)使用 "长度" 和 "垂直" 工具 (用红色圆圈) 执行测量。测量从点1到 2: 下颌长度;从5点到 6: 髁突宽度;垂直从点1到 4-3: 髁突头长度。从 "测量列表" 中保存度量值。缩放条 = 10 mm请单击此处查看此图的较大版本.

4. 髁突嵌入

注意: 在拍摄影像后, 下颌骨可以嵌入和分段进行组织学分析。

1. 放置脱下颌骨 (已固定在步骤 2.3) 在30% 蔗糖在 PBS 过夜前嵌入。
2. 解剖任何多余的软组织, 并仔细切割下颌髁突。
3. 在一次性塑料模具中倒入一些嵌入树脂 (足够覆盖样品), 并将髁突内侧面与模具底座对中, 将样品与模具的底部平行放置。
4. 用一块干冰把标本固定在正确的地方。
5. 用嵌入树脂填充模具, 在冷 2-甲基丁烷中放置固定样品的模具, 可在-20 ° c 或-80 ° c 的冷冻机或干冰中 pre-chilled。
6. 将标本存放在-20 ° c 或-80 ° c, 直到切片。

5. 髁突矢状切面和滑动准备

1. 创建髁 (5-7 µm) 的冰冻矢状切面, 并使用磁带传输方法^10,11将样本传输到幻灯片。
2. 使用紫外光固化方法¹⁰将组织学切片粘附到磁带上。

6. 组织学染色和显微成像

注意: 大多数组织学染色是通过 Dyment et al¹⁰在本文的组织学部分进行描述的。

1. 对于基线扫描, 第一步是对 Col2a1 和 Col10a1 转基因进行映像, 如 Dyment et al¹⁰所述。
   1. 将片放在30% 甘油和 PBS 的幻灯片上。执行基线成像 ofthesectionswitha 荧光显微镜和适当的过滤器。
2. 执行荧光抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色。
   注: 陷阱由造血细胞表达, 包括骨吸收细胞, 破骨¹²。该染色的目的是分析 MCC 和下骨重塑。
   1. 通过在 PBS 中浸泡来去除幻灯片的片。在 PBS 三次洗涤幻灯片5分钟每。
   2. 在蒸馏水的 1 l 中, 用无水 (9.2 克) 和 l-酒石酸钠 (11.4 克) 溶解醋酸钠, 制备疏水阀缓冲1。用乙酸调节 pH 值至 4.2, 并在4° c 处储存陷阱缓冲器1。
   3. 在1毫升蒸馏水中, 用新溶解的亚硝酸盐 (40 毫克) 制备陷阱缓冲器2。
   4. 通过混合 7.5 mL 缓冲器1和150µL 的缓冲 2, 准备陷印基板缓冲 (就在染色前)。将此解决方案 (200 µL) 应用于每张幻灯片, 在室温下为10分钟。
   5. 通过混合1.840 毫升的基底缓冲液和23µL 的荧光基板来制备陷阱反应缓冲器 (参见材料表)。
      注: 用于陷阱活动的荧光 substrategeneratesayellowfluorescentsignal。
   6. 通过轻轻移解决方案, 去除多余的陷印基底缓冲器。
   7. 在紫外线源灯泡黑光下, 用200µL 的陷阱反应缓冲液孵育5分钟的幻灯片。
   8. 在 PBS 三次洗涤幻灯片5分钟每。
   9. 将片放在 PBS 的30% 甘油的幻灯片上, 并进行显微成像¹⁰。
3. 进行细胞增殖染色。
   注: 在本试验中, 经改良的胸苷模拟 5-乙炔-2-脱氧 (教育) 被纳入新合成的 DNA: 分裂细胞被标记为荧光染料。
   1. 在对陷阱进行成像后, 取出片并在 PBS 中清洗三次, 每次5分钟。按照 5-乙炔-2 脱氧细胞增殖试剂盒中的步骤来染色组织学切片。
   2. 准备反应鸡尾酒加入430µL 1X 反应缓冲, 20 µL 丘索₄, 1.2 µL 荧光染料, 和50µL 的1X 缓冲添加剂 (总体积500µL 是足够的一张幻灯片)。
      注: 制造商建议按照此处所述的顺序添加配料。
   3. 用准备好的鸡尾酒在室温下孵育30分钟的幻灯片, 保护其免受光照。
   4. 在 PBS 三次洗涤幻灯片5分钟每。
   5. 将片放在 PBS 的30% 甘油的顶部, 1:1, 000 DAPI。
      注: DAPI (4 ", 6-diamidino-2-吲) 是一种蓝色的荧光核染色, 结合在丰富的区域在 DNA。
4. 执行甲苯胺蓝 (TB) 染色。
   注意: 结核染色显示了 MCC 的蛋白多糖分布。
   1. 冲洗幻灯片 indistilledwater 以删除片。
   2. 去除片后, 在蒸馏水中清洗三次, 每次5分钟, 完全除去 PBS 中的盐。
   3. 通过使溶液 A (在蒸馏水的1升中溶解28.4 克磷酸二钠化合物) 和溶液 B (溶解27.6 克磷酸二在1升蒸馏水中) 制备结核工作缓冲器。混合94.7 毫升溶液 A 与5.3 毫升溶液 b 稀释此溶液1:1 在蒸馏水, 使200毫升0.1 米的工作缓冲。通过在 ph 值固定前加入氢氧化钠, 将 ph 值校正到8.0。
   4. 准备1% 股结核: 在100毫升蒸馏水中混合1克结核。
   5. 在3毫升1% 的储存结核中, 将40毫升的0.1 米工作缓冲液混合, 准备结核工作溶液。
   6. 在14-17 秒内孵育结核工作解决方案中的幻灯片。
      注意: 这个污点是非常时间敏感;潜伏期可能需要调整, 以防止 overstaining。
   7. 用蒸馏水冲洗三次, 每次5分钟。
   8. 将片放在30% 甘油的蒸馏水中。执行光学显微镜成像¹⁰。
      注意: 不要片在甘油 + PBS 中染有结核的幻灯片。PBS 清洗这种类型的污渍。

7. 荧光组织学定量

1. 使用图像分析软件对荧光图像进行组织学量化 (请参见材料表)。
   注: 该方法的组织学定量的基本原理是将感兴趣的荧光像素的数目除以感兴趣区域的总像素数, 并将所获得的数乘以 100, 从而产生一个正像素的百分比在该区域内。
2. 对髁矢状段的 Col10a1 表达进行量化。
   1. 使用此方法对所有类型的单元格和污点进行量化时, 请选择要量化的区域。打开图像分析软件中的组织学图像, 然后使用 "套索工具 (L)" (图 4A) 选择区域。对于此处所述的分析, 仅选择 MCC 区域;选择区域后, 将在软件屏幕上的 "直方图" 框 (图 4A) 上显示总的像素数。保存感兴趣区域中的像素数。
   2. 使用采样工具选择 Col10a1 红色像素。单击顶部面板上的 "选择", 然后 "颜色范围"。单击 "吸管工具", 选择图像中感兴趣像素的样本颜色, 然后单击 "确定"。选择的像素颜色的所有区域都将被选中 (图 4B)。复制荧光像素的数量 (显示在屏幕的 "直方图" 框中), 并将它们粘贴到电子表格或统计软件中进行分析。
   3. 将荧光像素的数目除以感兴趣区域的像素数, 并将此数乘以 100: 在感兴趣区域中的荧光像素/像素 * 100。
      注意: 其他类型的单元格 (如蓝色 Col2a1) 可以用同样的方法进行量化, 但应选择蓝色像素而不是 Col10a1 红色像素。

图 4.转基因 Col10a1 量化的表示。(A)使用 "套索工具" (L) 选择感兴趣的区域。对于 Col10a1-positive 细胞, 选择整个下颌骨软骨。保存 "直方图" 框中的像素数。(B)选择感兴趣的像素, 在本例中为红色荧光 Col10a1 像素。请注意, 将只选择感兴趣区域中的红色像素。从 "直方图" 框中保存红色像素的数目。缩放栏 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

3. 对 MCC 和下骨中的陷阱活动进行量化。
   1. 按照步骤8.2 中描述的步骤操作, 但不要仅选择 MCC 区域, 选择软骨和下骨区域 (图 5A)。
   2. 对于陷阱活动分析, 请选择由 ELF97 基板生成的黄色像素, 如步骤 8.2.2 (图 5B) 中所述;复制正像素的个数;并将它们粘贴到电子表格或统计软件中进行分析。
   3. 通过将黄色像素的数目除以下骨区的总像素数并乘以 100, 获取陷阱正像素的百分比。

图 5.荧光陷阱量化的表示。(A)选择感兴趣的区域 (下颌软骨和下骨), 并保存该区域的像素数。(B)选择黄色荧光像素, 表示陷阱活动。请注意, 只有陷阱-正像素将被选中。保存所选像素的数目。缩放栏 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

4. 对教育阳性细胞进行量化。
   1. 教育染色的幻灯片是1-4 与 DAPI, 因此, 而不是计算总的像素数在感兴趣的区域, 选择 DAPI 阳性像素来计算教育阳性像素的百分比。如步骤8.2 所述, 选择感兴趣的区域, 但不保存总的像素数。选择 DAPI 蓝色像素作为取样颜色, 如步骤8.2.2 所述;复制 DAPI 阳性像素的数目 (图 6A);并将它们粘贴到电子表格或统计软件中进行分析。
   2. 接下来, 选择教育阳性像素 (黄色荧光像素) 并保存 "直方图" 框中的像素数 (图 6B)。
   3. 通过将教育阳性像素的数目除以 DAPI 阳性像素的个数, 并将获得的数字乘以 100, 计算出教育像素的百分比。

图 6.表示的教育量化。(A)选择 MCC 的增殖区 (软骨的外层)。选择 DAPI-正像素并保存像素数。(B)选择 "教育阳性像素" (黄色荧光) 并保存像素数。缩放栏 = 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

8. 软骨厚度和蛋白多糖分布的定量

1. 使用 Digimizer 图像软件分析软骨厚度 (距离映射) 和甲苯胺蓝染色区。
   注意: 使用组织学图像中的刻度线来确定单元 (图 7A)。
2. 执行距离映射测量。
   注: 距离测绘测量将提供下颌髁突软骨的厚度。在这里描述的方法中, 选择了 mcc 的五区域, 给出了 mcc 总厚度的平均值。研究人员可以选择测量三不同的区域, 甚至在 MCC 中间的一个单一区域。
   1. 使用 "长度" 工具, 测量软骨从外表面到甲苯胺蓝染色区 (图 7B) 的长度, 在五地区, 或在尽可能多的位置的首选。
   2. 从 "测量列表" 中复制长度度量值。
      注意: 该软件还提供了测量的平均值 (图 7B)。
3. 测量甲苯胺蓝染色区。
   注: 在甲苯胺蓝染色区的测量中, 将得到 MCC 的蛋白多糖区。
   1. 选择 "区域" 工具和轮廓的甲苯胺蓝染色区域 (图 7C)。
   2. 从 "测量列表" 中复制区域测量。

图 7: 蛋白多糖分布量化的表示。(A)使用组织学图像的刻度线通过单击 "单位" 按钮 (红色圆圈, 选定单位: 500 µm) 来确定单位。(B)使用 "长度" 工具 (用红色圆圈) 测量不同位置软骨的厚度。在右上面板的 "测量列表" 中保存度量值。该软件还提供了右下面板的 "统计", 因此可以直接得到测量的平均值和 SD。(C)使用 "区域" 工具 (用红色圆圈) 测量甲苯胺蓝染色区域。圈出感兴趣的区域, 并从 "测量列表" 中保存度量值。请单击此处查看此图的较大版本.

Results

进行描述性统计, 检查形态学测量的分布 (下颌长度, 髁突长度, 髁突宽度) 和组织学分析。结果被比较了被装载的小组 (即,小鼠受压缩装载与 beta 钛春天) 和控制小组 (即,匹配控制小鼠没有接受任何过程)。统计学意义上的差异之间的方法是由不配对 t 检验, 和 p 值的 < 0.05 被认为是有统计学意义的。

如步骤4和图 3所述, 在加载和控制组的下颌骨中进行了形态学测量。被装载的小组提出以明显地增加的下颌长度 (装载: 16.62 ±0.23 毫米与控制: 16.21 ±0.2 毫米; p < 0.05) 和髁突头长度 (装载: 4.6 毫米, SD 0.08 毫米与控制: 4.4 毫米;SD 0.06;p < 0.05) 与对照组比较。然而, 在髁突宽度上没有显著差异 (载: 3.06 ±0.12 毫米与控制: 2.9 ± 0....

Discussion

本手稿描述了小鼠下颌髁和下颌骨的形态测量和细胞分析方法。射线照相测量也可以用来分析其他的骨骼从小实验动物。此外, 细胞分析 (细胞定量和软骨距离映射) 不限于啮齿动物的下颌骨髁突, 但可用于量化组织切片的众多组织上。

表达荧光的转基因小鼠模型是视觉理解基因表达变化的绝佳工具。本报告中使用的 double-collagen 荧光报道鼠模型 (Col2a1XCol10a1) 特别适合于 mcc 的研究, 因为转基因在 mcc 的 prehypertrophic 和肥厚区表达, 使胶原蛋白分布可以进行评估。如果研究者没有接触到表达荧光的转基因小鼠模型, 其他的组织学蛋白表达分析方法, 如免疫荧光法, 都可以使用。

对于形态学测量, 采取的关键步骤前的内阁射线图像是删除所有软组织的下颌骨或骨骼进行分析。过多的肌肉或软组织附着在骨骼可以掩盖的实际测量的结构。重要的是要知道的限制, 内阁射线照相系统。像每一个 x 射线, 它是一个3维结构的2维表示, 和结构和工件的重叠应仔细解释。此外, 在影像机柜中的骨骼定位应该是一致的。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MX20 射线照相系统	Faxitron X-Ray LLC
Digimizer Image 软件	MedCalc 软件
Shandon Cryomatrix 包埋树脂	Thermo Scientific	6769006
手动显微镜 Axio Imager Z1	Carl Zeiss	208562
黄色荧光蛋白滤光片  - EYFP	Chroma Technology Corp	49003
青色荧光蛋白滤光片 - ECFP	Chroma Technology Corp	49001
红色荧光蛋白过滤器 - Cy5	Chroma Technology Corp	49009
无水醋酸钠	Sigma-Aldrich	S2889
L-酒石酸氢二钠二水合物	Sigma-Aldrich	228729
亚硝酸钠	Sigma-Aldrich	237213
ELF97基材	Thermo Fisher Scientific	E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS套件	Life Technologies	C10339	包括 EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶）
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Thermo Scientific	D1306
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S3264
磷酸钠二氢	Sigma-Aldrich	71505
甲苯胺蓝 O	Sigma-Aldrich	T3260
Adobe Photoshop	Adobe Systems Incorporated
磷酸盐缓冲盐水片 （PBS）	Research Products International	P32080-100T
CNA Beta III 无镍 Archwire	Ortho Organizers， Inc.
GraphPad 棱镜	GraphPad 软件公司