本文介绍了分析啮齿类动物下颌髁突形态计量学和细胞变化的方法。
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本文内容
摘要
摘要
颞下颌关节（TMJ）具有对外部刺激产生适应的能力，负荷变化可影响髁突的位置以及下颌髁突软骨（MCC）的结构和细胞成分。本文描述了分析这些变化的方法，以及一种在小鼠中改变TMJ负荷的方法即， 压缩性静态颞下颌关节负荷）。此处展示的结构评估是一种简单的形态计量学方法，采用Digimizer软件对小型骨骼的X线影像进行分析。此外，还描述了MCC中导致胶原表达改变、骨重塑、细胞分裂以及蛋白聚糖分布变化的细胞水平变化分析。通过图像软件计数荧光阳性像素，并结合Digimizer测量距离图谱和染色面积，对组织学切片中这些变化进行定量分析的方法也一并展示。本文所展示的方法不仅限于小鼠颞下颌关节，也可应用于其他小型实验动物的额外骨骼，以及软骨内成骨的其他区域。
引言
颞下颌关节（TMJ）是位于颅面区域的一种独特的承重关节，由纤维软骨构成。TMJ的髁突软骨复合体（MCC）对关节功能至关重要，包括在说话和咀嚼时实现无阻碍的下颌运动，但它常受到退行性疾病（如骨关节炎1）的影响。TMJ具有适应外部刺激和负荷变化的能力，从而引起MCC各组分发生结构和细胞层面的改变2,3,4,5。MCC的承重特性可通过其组分之间的相互作用来解释，这些组分包括水、胶原网络以及密集排列的蛋白聚糖。MCC具有四个明显不同的细胞区域，各区域表达不同类型的胶原和非胶原蛋白：1）表层或关节面层；2）增殖层，由未分化的间充质细胞组成，可响应负荷需求；3）前肥大层，由成熟软骨细胞构成，表达II型胶原；4）肥大层，是表达X型胶原的肥大软骨细胞发生死亡并钙化的区域。非矿化区域富含蛋白聚糖，可提供对压缩力的抵抗能力6。
在下颌骨髁突软骨内，肥大区持续发生矿化，此处软骨生成向成骨生成转变，从而保证了下颌骨髁突软骨下骨的坚实矿化结构7。未矿化区与矿化区的细胞变化最终导致下颌骨髁突及下颌骨的形态和结....
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方案
康涅狄格大学健康中心的机构动物护理委员会批准了所有动物实验程序。
1. 压缩性静态颞下颌关节加载：强制张口
注意：本研究中使用的实验动物为携带胶原蛋白荧光报告基因（Col2a1XCol10a1）的4周龄转基因小鼠，由康涅狄格大学David Rowe博士惠赠（n = 8；雄性4只，雌性4只）。Col2a1青色（蓝色）转基因在MCC预肥大区的细胞中表达，而Col10a1樱桃色（红色）细胞则位于肥大区8（图1）。小鼠被均分为两组：1）加载组，对小鼠施加静态压缩性颞下颌关节（TMJ）负荷（见步骤2描述）；2）对照组，小鼠不接受任何干预。
图 1.双胶原荧光报告小鼠（Col2a1XCol10a1）髁突的代表性矢状切面。
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结果
采用描述性统计方法分析形态测量指标（下颌骨长度、髁突长度、髁突宽度）和组织学分析结果的分布情况。在受力组（即， 接受β-钛合金弹簧加压载荷的小鼠）和对照组（即， 未接受任何处理的匹配对照小鼠）。均值之间的统计学显著差异通过非配对 t 检验确定，p 值小于 <0.05 被视为具有统计学意义。
如步骤4和图3所述，对加载组和对照组的下颌骨进行了形态测量。与对照组相比，加载组的下颌骨长度显著增加（加载组：16.62 ± 0.23 mm，对照组：16.21 ± 0.2 mm；p < 0.05），髁突头长度也显著增加（加载组：4.6 mm，标准差0.08 mm，对照组：4.4 mm，标准差0.06 mm；p < 0.05）。然而，两组之间的髁突宽度差异无统计学意义（加载组：3.06 ± 0.12 mm，对照组：2.9 ± 0.11 mm；p = 0........
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讨论
本文描述了小鼠下颌髁突和下颌骨的形态测量及细胞学分析方法。放射影像形态测量法也可用于分析其他小型实验动物的骨骼。此外，细胞学分析（细胞定量和软骨距离定位图）不仅限于啮齿类动物的下颌髁突，还可用于多种组织的组织学切片定量分析。
表达荧光报告基因的转基因小鼠模型是直观理解基因表达变化的优良工具。本报告中使用的双胶原荧光报告小鼠模型（Col2a1XCol10a1）特别适用于软骨内成骨中心（MCC）的研究，因为该模型的转基因在MCC的前肥大区和肥大区均有表达，从而可评估胶原的分布情况。如果研究人员无法获得表达荧光报告基因的转基因小鼠模型，也可采用其他组织学蛋白表达分析方法，例如免疫荧光染色。
进行形态测量时，在拍摄台式X光图像前的关键步骤是去除下颌骨或待分析骨骼上的所有软组织。附着在骨骼上的过多肌肉或软组织可能会掩盖结构的真实测量值。需要注意台式X光系统的局限性。与所有X射线成像一样，它是对三维结构的二维呈现，因此应仔细解读结构重叠和伪影。此外，骨骼在X光成像箱中的摆放位置应保持一致。
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
作者谨此感谢 David Rowe 博士慷慨提供转基因小鼠，以及 Li Chen 在组织学方面的协助。
本出版物中报道的研究由美国国立卫生研究院国家牙科与颅面研究所根据资助号K08DE025914以及美国正畸基金会对Sumit Yadav的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MX20 数字X射线成像系统 | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer 图像分析软件 | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix 包埋树脂 | Thermo Scientific | 6769006 | |
| 手动显微镜 Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| 黄色荧光蛋白滤光片 - EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| 青色荧光蛋白滤光片 - ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| 红色荧光蛋白滤光片 - Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| 无水乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| 酒石酸钠二碱二水合物 | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| 亚硝酸钠 | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 底物 | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 高内涵筛选试剂盒 | Life Technologies | C10339 | 包含 EdU (5-乙炔基-2'-脱氧尿苷) |
| DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐) | Thermo Scientific | D1306 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| 甲苯胺蓝 O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| 磷酸盐缓冲液片剂 (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III 无镍弓丝 | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
参考文献
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al.
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