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方法文章

一种用于小鼠下颌髁突的形态计量与细胞分析方法

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⸱

DOI：

10.3791/55998

⸱

2018年1月11日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Orthodontics, University of Connecticut Health Center

本文内容

摘要

本文介绍了分析啮齿类动物下颌髁突形态计量学和细胞变化的方法。

摘要

颞下颌关节（TMJ）具有对外部刺激产生适应的能力，负荷变化可影响髁突的位置以及下颌髁突软骨（MCC）的结构和细胞成分。本文描述了分析这些变化的方法，以及一种在小鼠中改变TMJ负荷的方法即， 压缩性静态颞下颌关节负荷）。此处展示的结构评估是一种简单的形态计量学方法，采用Digimizer软件对小型骨骼的X线影像进行分析。此外，还描述了MCC中导致胶原表达改变、骨重塑、细胞分裂以及蛋白聚糖分布变化的细胞水平变化分析。通过图像软件计数荧光阳性像素，并结合Digimizer测量距离图谱和染色面积，对组织学切片中这些变化进行定量分析的方法也一并展示。本文所展示的方法不仅限于小鼠颞下颌关节，也可应用于其他小型实验动物的额外骨骼，以及软骨内成骨的其他区域。

引言

颞下颌关节（TMJ）是位于颅面区域的一种独特的承重关节，由纤维软骨构成。TMJ的髁突软骨复合体（MCC）对关节功能至关重要，包括在说话和咀嚼时实现无阻碍的下颌运动，但它常受到退行性疾病（如骨关节炎1）的影响。TMJ具有适应外部刺激和负荷变化的能力，从而引起MCC各组分发生结构和细胞层面的改变2,3,4,5。MCC的承重特性可通过其组分之间的相互作用来解释，这些组分包括水、胶原网络以及密集排列的蛋白聚糖。MCC具有四个明显不同的细胞区域，各区域表达不同类型的胶原和非胶原蛋白：1）表层或关节面层；2）增殖层，由未分化的间充质细胞组成，可响应负荷需求；3）前肥大层，由成熟软骨细胞构成，表达II型胶原；4）肥大层，是表达X型胶原的肥大软骨细胞发生死亡并钙化的区域。非矿化区域富含蛋白聚糖，可提供对压缩力的抵抗能力6。

在下颌骨髁突软骨内，肥大区持续发生矿化，此处软骨生成向成骨生成转变，从而保证了下颌骨髁突软骨下骨的坚实矿化结构7。未矿化区与矿化区的细胞变化最终导致下颌骨髁突及下颌骨的形态和结构改变。维持软骨内各细胞区域的稳态以及软骨下骨部分的矿化，对于颞下颌关节的健康、承重能力及结构完整性至关重要。

多重胶原蛋白转基因小鼠模型（如 Utreja et al. 所述）8 是研究胶原蛋白表达变化的有力工具，因为所有转基因均在牙髓细胞团（MCC）中表达。为了进行深入的组织学评估，需使用组织学染色方法来研究细胞外基质沉积、矿化、细胞增殖和凋亡，以及MCC不同细胞层中的蛋白质表达情况。

在本研究中，采用组织学和形态计量学分析方法，评估小鼠下颌髁突软骨（MCC）及软骨下骨的细胞和结构变化。此外，本文还描述了一种细胞定量方法，用于分析荧光组织学图像以及绘制光学显微镜切片图谱。同时，为了验证本研究方法的有效性，还展示了可引起MCC和软骨下骨发生细胞及形态学改变的颞下颌关节静态加压加载方法9。

本文所述方法可用于测定啮齿类动物下颌髁突和下颌骨的形态计量学与组织学变化，或用于分析其他软骨内骨化区域以及额外矿化组织的形态。

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方案

康涅狄格大学健康中心的机构动物护理委员会批准了所有动物实验程序。

1. 压缩性静态颞下颌关节加载：强制张口

注意：本研究中使用的实验动物为携带胶原蛋白荧光报告基因（Col2a1XCol10a1）的4周龄转基因小鼠，由康涅狄格大学David Rowe博士惠赠（n = 8；雄性4只，雌性4只）。Col2a1青色（蓝色）转基因在MCC预肥大区的细胞中表达，而Col10a1樱桃色（红色）细胞则位于肥大区8（图1）。小鼠被均分为两组：1）加载组，对小鼠施加静态压缩性颞下颌关节（TMJ）负荷（见步骤2描述）；2）对照组，小鼠不接受任何干预。

下颌髁突荧光显微镜图像；Col10a1、Col2a1 标记物；组织结构分析。
图 1.双胶原荧光报告小鼠（Col2a1XCol10a1）髁突的代表性矢状切面。 比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用β钛合金弓丝（0.017 × 0.025 英寸）制作弹簧（图2A）。
  2. 通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg 体重）和赛拉嗪（13 mg/kg 体重）的混合物，对实验动物进行麻醉。
  3. 轻柔地打开小鼠口腔，插入弹簧，使弹簧环固定于上颌和下颌切牙上（图2B 和 C）。
  4. 通过将弹簧保留在麻醉小鼠的切牙中1小时，诱导产生静态的颞下颌关节压缩载荷。重复此操作连续5天。
  5. 在处死小鼠前2天和1天，通过腹腔注射5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU；30 mg/kg 体重），用于细胞增殖分析。

牙科张口实验中的研究工具；显示X射线成像的大鼠下颌装置示意图。
图2. 颞下颌关节静态加压：强制张口模型。（A） 由0.017 × 0.025 β-钛合金弓丝制成的弹簧。（B） 安装弹簧的小鼠。（C） 加载弹簧组与对照组小鼠的X线片，显示下颌位置的差异。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 下颌骨解剖与固定

  1. 在强制张口操作的终点，采用批准的方法对实验动物实施安乐死。
  2. 通过切断肌肉附着处解剖下颌骨，避免刮伤髁突软骨。
  3. 将清理后的下颌骨置于10%甲醛溶液中固定24小时。
    注意：甲醛具有刺激性；请佩戴适当的个人防护装备。

3. X射线成像与形态测量

  1. 将下颌骨放入平底容器中（例如， 使用台式X射线系统在26 kV条件下照射5秒，对置于55 mm × 16 mm培养皿中的样品进行放射成像。
    注意：保存图像前请放置比例尺。
  2. 使用图像分析软件对下颌骨进行形态测量（参见 材料清单).
    注意：在进行任何测量之前，使用X光片上的标尺确定单位。此步骤对于准确测量解剖结构至关重要。点击“Unit”按钮（图3A).
  3. 使用成像软件中的“marker style 2”选择解剖学点位图3B）。要遵循本文所述方法，请选择以下要点（图3B):
    1. 选择下颌骨髁突最靠后的一个点，即髁顶点（点1）；
    2. 选择切牙突（点2）；
    3. 选择乙状切迹的最深点（点3）；
    4. 选择下颌支凹陷处的最深点（点4）；
    5. 选择髁突关节面最靠前的点（点5）；以及
    6. 选择髁突关节面最靠后方的点（点6）。
  4. 选择解剖点后，使用“长度”工具进行形态测量，但测量髁突头长度时，应从点（3）和点（4）使用“垂直线”工具图3C).
    1. 从髁突点（1）到切齿突（2）测量下颌骨长度。
    2. 测量髁头长度——即从髁顶点（1）到通过乙状切迹最深点（3）与下颌支凹面最深点（4）所连直线的垂直距离。
    3. 测量髁头宽度——即从髁突关节面最前点至最后点的距离（5 - 6）。
    4. 从屏幕右侧的“测量列表”中复制测量数据图3C).

成像软件中的骨结构分析；显示研究测量和标注的示意图。
图3．下颌骨形态测量的示意图。(A) 使用X线片上的比例尺确定单位（红圈标示，比例尺：10 mm）。(B) 使用“marker style 2”工具选择解剖学标志点（红圈标示）。1）髁突点；2）切牙突起；3）乙状切迹最深点；4）下颌支凹面最深点；5）髁突关节面最前点；6）髁突关节面最后点。比例尺：10 mm。(C) 使用“length”和“perpendicular”工具进行测量（红圈标示）。从点1到点2的测量：下颌骨长度；从点5到点6：髁突宽度；从点1到线段4-3的垂线距离：髁突头长度。通过“measurement list”保存测量结果。比例尺 = 10 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 髁突包埋

注意：拍摄放射影像后，可将下颌骨包埋并切片以进行组织学分析。

  1. 将未脱钙的下颌骨（已在步骤 2.3 中固定）置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 过夜浸泡，然后进行包埋。
  2. 剔除多余的软组织，并小心切取下颌髁突。
  3. 在一次性塑料模具中倒入包埋介质（用量以完全覆盖样本为宜），将髁突的内侧面紧贴模具底部放置，使样本与模具底部保持平行。
  4. 用干冰将样本固定在模具中的正确位置。
  5. 将模具内充满包埋介质，并将已固定的样本连同模具一同浸入低温的 2-甲基丁烷中，2-甲基丁烷可预先在 -20 °C 或 -80 °C 冰箱中预冷，或置于干冰中冷却。
  6. 将样本在 -20 °C 或 -80 °C 下保存，直至切片。

5. 髁突矢状切片与切片制备

  1. 制备髁突的冷冻矢状切片（5 - 7 µm），并使用胶带转移法将样本转移至载玻片上10,11。
  2. 采用紫外光固化法将转移至胶带上的组织切片固定10。

6. 组织学染色与显微成像

注意：大部分组织学染色操作均按照 Dyment 等人et al10论文中组织学部分所述方法进行。

  1. 进行基线扫描时，第一步是如 Dyment 等10 所述，对 Col2a1 和 Col10a1 转基因进行成像。
    1. 将盖玻片置于载玻片上，使用含 30% 甘油的 PBS 封片。使用荧光显微镜及适当的滤光片对切片进行基线成像。
  2. 进行荧光抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。
    注意：TRAP 由造血细胞表达，包括骨吸收细胞——破骨细胞12。该染色的目的是分析微骨折修复组织（MCC）及软骨下骨的重塑情况。
    1. 将载玻片浸入 PBS 中以去除盖玻片。用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
    2. 通过将无水乙酸钠（9.2 g）和酒石酸钠二水合物（11.4 g）溶于 1 L 蒸馏水中配制 TRAP 缓冲液 1。用乙酸调节 pH 至 4.2，并将 TRAP 缓冲液 1 储存于 4 °C。
    3. 在使用前新鲜配制 TRAP 缓冲液 2：将亚硝酸钠（40 mg）溶于 1 mL 蒸馏水中。
    4. 在染色前立即配制 TRAP 底物缓冲液：将 7.5 mL 缓冲液 1 与 150 µL 缓冲液 2 混合。每张载玻片加入 200 µL 该溶液，室温孵育 10 分钟。
    5. 通过混合 1.840 mL 底物缓冲液和 23 µL 荧光底物（见材料表）配制 TRAP 反应缓冲液。
      注意：荧光底物可产生黄色荧光信号以指示 TRAP 活性。
    6. 用移液器轻轻吸去多余的 TRAP 底物缓冲液。
    7. 将载玻片在紫外光源黑光灯下，加入 200 µL TRAP 反应缓冲液孵育 5 分钟。
    8. 用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
    9. 在含 30% 甘油的 PBS 中将盖玻片封于载玻片上，并进行显微成像10。
  3. 进行细胞增殖染色。
    注意：在该检测中，修饰的胸苷类似物 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）被整合到新合成的 DNA 中：分裂细胞将被荧光染料标记。
    1. 完成 TRAP 成像后，去除盖玻片，并用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。按照 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷细胞增殖试剂盒的步骤对组织切片进行染色。
    2. 通过加入 430 µL 1X 反应缓冲液、20 µL CuSO4、1.2 µL 荧光染料和 50 µL 1X 缓冲液添加剂配制反应混合液（总体积 500 µL 可用于一张载玻片）。
      注意：制造商建议按此处所述顺序添加试剂。
    3. 将载玻片与配制好的反应混合液在室温下避光孵育 30 分钟。
    4. 用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
    5. 在含 30% 甘油的蒸馏水中加入 1:1,000 的 DAPI 封片。
      注意：DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种蓝色荧光核染料，可结合 DNA 中富含 AT 的区域。
  4. 进行甲苯胺蓝（TB）染色。
    注意：TB 染色可显示 MCC 中蛋白聚糖的分布情况。
    1. 用蒸馏水冲洗载玻片以去除盖玻片。
    2. 去除盖玻片后，用蒸馏水洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次，以彻底去除 PBS 中的盐分。
    3. 配制 TB 工作缓冲液：配制溶液 A（将 28.4 g 磷酸氢二钠溶于 1 L 蒸馏水中）和溶液 B（将 27.6 g 磷酸二氢钠溶于 1 L 蒸馏水中）。取 94.7 mL 溶液 A 与 5.3 mL 溶液 B 混合。将该溶液用蒸馏水 1:1 稀释，配制成 200 mL 的 0.1 M 工作缓冲液。加入氢氧化钠调节 pH 至 8.0，直至 pH 稳定。
    4. 配制 1% 储存液 TB：将 1 g TB 溶于 100 mL 蒸馏水中。
    5. 通过将 40 mL 0.1 M 工作缓冲液与 3 mL 1% 储存液 TB 混合，配制 TB 工作液。
    6. 将载玻片在 TB 工作液中孵育 14–17 秒。
      注意：该染色对时间非常敏感；可能需要调整孵育时间以避免过度染色。
    7. 用蒸馏水洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
    8. 在含 30% 甘油的蒸馏水中将盖玻片封于载玻片上。进行光学显微镜成像10。
      注意：切勿使用甘油 + PBS 封片对 TB 染色的载玻片进行封固，PBS 会洗脱此类染料。

7. 荧光组织学定量分析

  1. 使用图像分析软件（参见材料表）对荧光图像进行组织学定量。
    注意：本方法中组织学定量的基本原理是将目标区域中荧光像素的数量除以该区域的总像素数，再将所得数值乘以100，从而得到该区域内阳性像素的百分比。
  2. 对髁突矢状切片中MCC区域的Col10a1表达进行定量。
    1. 使用本方法对所有类型的细胞和染色进行定量时，首先选择待定量的区域。在图像分析软件中打开组织学图像，并使用“套索工具（L）”选择区域（图4A）。对于此处描述的分析，仅选择MCC区域；选定区域后，软件屏幕上的“直方图”框将显示总像素数（图4A）。记录该目标区域的像素数量。
    2. 使用取样工具选择Col10a1红色像素。点击顶部面板中的“选择”，然后选择“颜色范围”。点击“吸管工具”，在图像中选择目标像素的颜色样本，然后点击“确定”。所有显示所选像素颜色的区域将被选中（图4B）。复制荧光像素的数量（显示在屏幕的“直方图”框中），并将其粘贴至电子表格或统计软件中进行分析。
    3. 将荧光像素数量除以目标区域的像素总数，再乘以100：荧光像素数 / 目标区域像素数 × 100。
      注意：其他类型的细胞，例如蓝色Col2a1，也可使用相同方法进行定量，但应选择蓝色像素而非Col10a1红色像素。

显微镜图像分析、直方图调整、颜色通道、科学数据处理
图 4．转基因 Col10a1 定量的表示。（A） 使用“套索工具”（L）选择感兴趣区域。对于 Col10a1 阳性细胞，选择整个下颌软骨区域。从“直方图”框中记录像素数量。（B） 选择感兴趣的像素，在本例中为红色荧光的 Col10a1 像素。注意仅会选中感兴趣区域内的红色像素。从“直方图”框中记录红色像素的数量。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 对MCC和软骨下骨中的TRAP活性进行定量分析。
    1. 按照步骤8.2中所述的程序操作，但选择区域时不仅限于MCC区域，还需包括软骨和软骨下骨区域（图5A）。
    2. 进行TRAP活性分析时，选择ELF97底物产生的黄色像素（如步骤8.2.2中所述）（图5B）；复制阳性像素的数量；并将该数值粘贴至电子表格或统计软件中用于分析。
    3. 通过将黄色像素数量除以软骨下骨区域的总像素数，再乘以100，计算出TRAP阳性像素的百分比。

荧光显微镜分析；带直方图的图像；细胞结构强度比较。
图5．荧光TRAP定量结果示意图。（A）选择感兴趣区域（下颌软骨及软骨下骨），并记录该区域的像素数量。（B）选择代表TRAP活性的黄色荧光像素。注意仅会选中TRAP阳性像素。记录所选像素的数量。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 进行 EdU 阳性细胞的定量分析。
    1. EdU 染色切片已用 DAPI 复染，因此在计算目标区域中 EdU 阳性像素百分比时，应选择 DAPI 阳性像素，而非计算该区域的总像素数。按步骤 8.2 所述方法选择感兴趣区域，但无需保存总像素数。按步骤 8.2.2 所述，选择 DAPI 蓝色像素作为采样颜色；复制 DAPI 阳性像素的数量（图 6A）；并将其粘贴至电子表格或统计软件中用于分析。
    2. 接着，选择 EdU 阳性像素（黄色荧光像素），并将像素数量保存至“直方图”框中（图 6B）。
    3. 通过将 EdU 阳性像素数除以 DAPI 阳性像素数，再将所得数值乘以 100，计算 EdU 阳性像素的百分比。

荧光显微镜图像；蓝色为细胞核染色，黄色为蛋白表达；分析软件。
图6．EdU定量示意图。（A）选择MCC中的增殖区域（软骨的外层）。选择DAPI阳性像素，并记录像素数量。（B）选择EdU阳性像素（黄色荧光），并记录像素数量。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 软骨厚度与蛋白聚糖分布的定量分析

  1. 使用 Digimizer 图像软件分析软骨厚度（距离映射）及甲苯胺蓝染色区域。
    注意：使用组织学图像中的比例尺确定单位（图 7A）。
  2. 进行距离映射测量。
    注意：距离映射测量将提供下颌髁突软骨的厚度。在本方法中，选择 MCC 的五个区域，以获得 MCC 总体厚度的平均值。研究者也可选择测量三个不同区域，甚至仅测量 MCC 中央的一个区域。
    1. 使用“长度”工具，在五个区域或任意选定的位置，测量从软骨外表面至甲苯胺蓝染色区域末端的长度（图 7B）。
    2. 从“测量列表”中复制长度测量值。
      注意：软件还将提供测量值的平均值（图 7B）。
  3. 测量甲苯胺蓝染色区域。
    注意：通过测量甲苯胺蓝染色区域，可获得 MCC 中的蛋白聚糖区域。
    1. 选择“面积”工具，勾勒甲苯胺蓝染色区域（图 7C）。
    2. 从“测量列表”中复制面积测量值。

组织切片的组织学分析；显微镜图像；用于研究的细胞结构分析。
图7：蛋白聚糖分布定量的示意图。（A）使用组织学图像的比例尺，通过点击“unit”按钮（红圈标示，已选单位：500 µm）确定单位。（B）使用“length”工具（红圈标示）测量不同位置的软骨厚度。从右上方面板的“measurement list”中保存测量结果。软件还可在右下面板提供“statistics”统计功能，从而直接获得测量值的平均值和标准差。（C）使用“area”工具（红圈标示）测量甲苯胺蓝染色区域。圈出感兴趣区域，并从“measurement list”中保存测量结果。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

采用描述性统计方法分析形态测量指标（下颌骨长度、髁突长度、髁突宽度）和组织学分析结果的分布情况。在受力组（即， 接受β-钛合金弹簧加压载荷的小鼠）和对照组（即， 未接受任何处理的匹配对照小鼠）。均值之间的统计学显著差异通过非配对 t 检验确定，p 值小于 <0.05 被视为具有统计学意义。

如步骤4和图3所述，对加载组和对照组的下颌骨进行了形态测量。与对照组相比，加载组的下颌骨长度显著增加（加载组：16.62 ± 0.23 mm，对照组：16.21 ± 0.2 mm；p < 0.05），髁突头长度也显著增加（加载组：4.6 mm，标准差0.08 mm，对照组：4.4 mm，标准差0.06 mm；p < 0.05）。然而，两组之间的髁突宽度差异无统计学意义（加载组：3.06 ± 0.12 mm，对照组：2.9 ± 0.11 mm；p = 0....

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讨论

本文描述了小鼠下颌髁突和下颌骨的形态测量及细胞学分析方法。放射影像形态测量法也可用于分析其他小型实验动物的骨骼。此外，细胞学分析（细胞定量和软骨距离定位图）不仅限于啮齿类动物的下颌髁突，还可用于多种组织的组织学切片定量分析。

表达荧光报告基因的转基因小鼠模型是直观理解基因表达变化的优良工具。本报告中使用的双胶原荧光报告小鼠模型（Col2a1XCol10a1）特别适用于软骨内成骨中心（MCC）的研究，因为该模型的转基因在MCC的前肥大区和肥大区均有表达，从而可评估胶原的分布情况。如果研究人员无法获得表达荧光报告基因的转基因小鼠模型，也可采用其他组织学蛋白表达分析方法，例如免疫荧光染色。

进行形态测量时，在拍摄台式X光图像前的关键步骤是去除下颌骨或待分析骨骼上的所有软组织。附着在骨骼上的过多肌肉或软组织可能会掩盖结构的真实测量值。需要注意台式X光系统的局限性。与所有X射线成像一样，它是对三维结构的二维呈现，因此应仔细解读结构重叠和伪影。此外，骨骼在X光成像箱中的摆放位置应保持一致。

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

作者谨此感谢 David Rowe 博士慷慨提供转基因小鼠，以及 Li Chen 在组织学方面的协助。

本出版物中报道的研究由美国国立卫生研究院国家牙科与颅面研究所根据资助号K08DE025914以及美国正畸基金会对Sumit Yadav的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MX20 数字X射线成像系统Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer 图像分析软件 MedCalc Software
Shandon Cryomatrix 包埋树脂Thermo Scientific6769006
手动显微镜 Axio Imager Z1Carl Zeiss208562
黄色荧光蛋白滤光片  - EYFPChroma Technology Corp49003
青色荧光蛋白滤光片 - ECFPChroma Technology Corp49001
红色荧光蛋白滤光片 - Cy5Chroma Technology Corp49009
无水乙酸钠Sigma-AldrichS2889
酒石酸钠二碱二水合物 Sigma-Aldrich228729
亚硝酸钠 Sigma-Aldrich237213
ELF97 底物Thermo Fisher ScientificE6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 高内涵筛选试剂盒Life TechnologiesC10339 包含 EdU (5-乙炔基-2'-脱氧尿苷) 
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐)Thermo ScientificD1306
磷酸氢二钠 Sigma-AldrichS3264
磷酸二氢钠 Sigma-Aldrich71505
甲苯胺蓝 O Sigma-AldrichT3260
Adobe Photoshop Adobe Systems Incorporated
磷酸盐缓冲液片剂 (PBS)Research Products InternationalP32080-100T
CNA Beta III 无镍弓丝Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.

参考文献

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