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方法文章

使用凝胶内杂交法进行改良末端限制性片段分析以定量端粒长度

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DOI：

10.3791/56001

⸱

2017年7月10日

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pathology and Infectious Diseases and Microbiology, University of Pittsburgh, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh, 4Departments of Psychiatry, Psychology, Behavioral & Community Health Sciences, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

本文讨论了一种使用改良末端限制性片段分析法来定量端粒长度的详细实验方案，该方法可快速高效地直接测量端粒长度。该技术可应用于多种DNA细胞来源，用于定量端粒长度。

摘要

测量端粒长度有多种不同技术，每种技术各有其优缺点。传统的端粒限制性片段（TRF）分析法采用DNA杂交技术，即用限制性内切酶消化基因组DNA样本，保留端粒DNA重复序列及部分端粒侧翼区DNA。这些片段通过琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至滤膜并用带有化学发光或放射性标记的寡核苷酸探针进行杂交，以可视化端粒限制性片段。该方法虽然所需DNA量较PCR等其他技术更多，但可测定细胞群体中端粒长度的分布情况，并以绝对千碱基（kb）为单位进行定量。本文描述了一种改良的DNA杂交法用于测定端粒长度。首先用不切割端粒序列的限制性内切酶消化基因组DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离。随后将凝胶干燥，对DNA进行变性并杂交 原位 与放射性标记的寡核苷酸探针杂交。这 原位 杂交可避免端粒DNA的丢失并增强信号强度。杂交完成后，利用磷屏成像系统对凝胶进行成像，并通过绘图软件定量分析端粒长度。该实验流程由德克萨斯大学西南医学中心的Woodring Wright博士和Jerry Shay博士实验室开发。1,2在此，我们详细描述了该实验步骤，并做了一些修改。

引言

位于染色体末端的端粒是由重复的核苷酸序列TTAGGG（在人类染色体上）组成的结构，在保护细胞遗传信息方面发挥着关键作用3,4,5。端粒长度可达数千个碱基对，其功能是在DNA复制过程中维持染色体其余部分的完整性。由于染色体复制并不完全，导致染色体末端无法被完整复制。这种复制效率的缺陷被称为"末端复制问题"，其结果是在每一次复制循环中部分端粒重复序列会丢失6,7。细胞分裂后，端粒酶作为一种能够补充丢失的端粒序列的酶，可恢复端粒长度8,9。然而，在大多数人类体细胞中端粒酶并未被激活，因此随着时间推移，端粒会逐渐缩短，最终导致细胞衰老10。由于端粒缩短现象的存在，端粒长度被视为一种与衰老及年龄相关疾病风险相关的生物标志物11,12。此外，端粒长度还可能受到遗传、环境、生活方式因素以及其他刺激（如氧化应激）的影响，表明其在毒理学、流行病学和行为学研究中也可作为重要的生物标志物13,14,15。

本文展示了一种测量端粒长度的技术，该技术采用经Mender和Shay2以及Kimura et al.16改良的末端限制性片段（TRF）分析方法，类似于Herbert、Shay和Wright1以及Haussmann和Mauck17所使用的方法。传统上，TRF分析包含Southern印迹步骤。Southern印迹被认为是研究端粒长度的"金标准"，并广泛应用于流行病学研究中白细胞端粒长度的检测18。该TRF分析通过消化基因组DNA，保留端粒重复序列。随后，DNA片段通过凝胶电泳分离，经变性后转移至硝酸纤维素膜上。端粒序列与端粒寡核苷酸探针进行杂交。除将分离的端粒转移至膜上的方法外，其他TRF技术也采用凝胶内杂交方法，可在DNA变性或非变性条件下进行。在检测某些物种中已报道存在的中间型端粒序列时，是否包含变性步骤尤为关键19。缺乏变性步骤的操作仅能检测端粒末端的单链DNA突出端，而无法与中间型端粒序列结合18。

除了TRF分析外，还有其他几种测量端粒长度的技术，每种技术都有其各自的优缺点。Flow-FISH技术可利用流式细胞术测量特定细胞类型单个细胞的平均端粒长度16,20。该方法能够使用高度特异性的探针准确标记端粒，并通过自动化减少人为误差，但Flow-FISH成本较高、效率较低，且需要新鲜样本和熟练的技术人员，限制了其在流行病学研究中的应用16。此外，该方法未考虑细胞群体中染色体数目可能发生的改变。另一种技术qPCR由于通量高、成本低，且所需DNA量少于其他方法，已被广泛接受用于流行病学研究中的端粒长度测量16。然而，qPCR只能测量相对于单拷贝基因的平均端粒DNA含量，因此是对平均端粒长度的间接估算。与其他方法（如Southern印迹）相比，qPCR在比较研究中表现出较高的变异系数，导致其准确性存疑21。

TRF 方法本身存在一些缺陷，限制了其在某些研究中的应用。与其他方法相比，TRF 技术需要较大量的 DNA（每个样品需 2 至 3 µg）。这使得该技术仅适用于能够获得足量基因组 DNA 的临床样本的端粒长度分析，而无法用于已降解的 DNA 样本。此外，TRF 分析成本较高且耗时耗力，通常需要 4 至 5 天才能获得结果。然而，TRF 具有较低的变异系数，因而具有良好的可重复性。尽管本实验方案与传统的 Southern 印迹法有所不同（采用原位凝胶杂交 in situ gel hybridization），但两种技术在本质上是相同的。

本文介绍的技术结合了Southern印迹与凝胶内杂交方法，将Southern印迹中的DNA变性步骤与凝胶内杂交相结合。相比传统的Southern印迹，该方法具有增强探针信号强度的优势，并在本实验室中持续获得可量化的结果。此外，使用放射性探针而非化学发光探针可产生更高的信号强度，并可通过磷屏成像仪进行可视化和定量分析，使端粒重复序列（TRF）的分析更加便捷易行。

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方案

1. 基因组DNA提取

  1. 使用商品化的DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从待分析的细胞（此处为BJ-hTERT细胞系）中提取基因组DNA。
  2. 使用分光光度计测定DNA浓度。若DNA浓度低于100 µg/mL，采用乙醇沉淀法沉淀DNA，并将其重悬于适量TE缓冲液（10 mM Tris-Cl；0.1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）；pH 8.0）中，以确保DNA浓度达到100–600 µg/mL。

2. DNA 完整性评估

注意：本实验方案的这一部分概述了使用电泳系统进行DNA完整性评估的方法，所用凝胶尺寸为11 cm × 14 cm。也可使用其他系统和不同尺寸的凝胶，但电压和DNA迁移时间可能有所不同。

  1. 通过将1 g电泳级琼脂糖加入100 mL 1×TAE缓冲液（40 mM Tris-碱；20 mM乙酸；2 mM EDTA；pH 8.5）中，微波加热至琼脂糖完全溶解且溶液澄清，制备1%琼脂糖凝胶。将溶液在室温下冷却至50 °C（约15–20分钟）。
  2. 在琼脂糖溶液冷却期间，通过在制胶板两端安装制胶挡板来准备制胶模具。为防止琼脂糖泄漏，应在将挡板安装到制胶板前将其冷却至4 °C。
  3. 当琼脂糖溶液冷却至50 °C后，加入10 µL溴化乙锭（10 mg/mL溶于dH2O），并将琼脂糖溶液倒入制胶板中。插入梳子。
  4. 在室温下静置45分钟，使琼脂糖溶液完全凝固。
  5. 通过将25 ng基因组DNA用1×TE缓冲液稀释至终体积9 µL，并加入1 µL 10×上样染料（0.25% (w/v) 溴酚蓝，0.25% (w/v) 二甲苯蓝FF，30% (v/v) 甘油），配制用于电泳的DNA样品。充分混匀。
  6. 用1×TAE缓冲液填充电泳装置，使缓冲液液面高出凝胶数毫米，以准备DNA电泳。将全部DNA样品加入凝胶的加样孔中，并在一个单独的加样孔中加入5 µL DNA Marker。
  7. 以100 V电压电泳约2小时，或直至溴酚蓝染料迁移至凝胶中部。
  8. 使用紫外透射仪或等效设备成像凝胶。
    注意：完整性良好的DNA样品应呈现高分子量条带，无拖尾现象（拖尾由剪切或断裂的DNA引起）。若DNA条带出现拖尾，则表明其完整性差，不适合用于Southern印迹分析，必须使用新鲜细胞重新提取DNA。

3. 基因组DNA消化

  1. 在终体积为 20–40 µL 的条件下进行基因组 DNA 的消化反应。
    注意：体积超过 40 µL 会导致琼脂糖凝胶的加样孔溢出。
    1. 在微量离心管中加入 3 µg 基因组 DNA 和适量的 10x DNA 消化缓冲液（随限制性内切酶提供），使终浓度为 1x。向每管中加入 1 µL RsaI 限制性内切酶（10,000 U/mL）和 1 µL HinfI 限制性内切酶（10,000 U/mL）。用无菌去离子 H2O 调整体积至终体积。充分混匀。短暂离心（16,000 × g 下 10–15 秒），确保所有组分沉至管底。
  2. 将消化反应在 37 °C 下孵育 ≥16 小时。消化完成后，若需保存，可将消化后的 DNA 置于 4 °C 或 -20 °C，但不超过 2 天17。

4. 基因组DNA凝胶电泳

注意：本实验方案的这一部分概述了使用 20 cm × 25 cm 凝胶电泳系统的操作步骤。也可使用其他规格的凝胶电泳系统，但可能需要调整若干变量，包括电压、电泳时间以及加入系统的电泳缓冲液体积，以获得最佳结果。

  1. 通过将 2.25 g 电泳级琼脂糖与 375 mL 电泳缓冲液（1× TAE 或 0.5× TBE（110 mM Tris 碱；90 mM 硼酸；2.5 mM EDTA；pH 8.3））混合，制备 0.6% 琼脂糖溶液。
    注意：对于小于 8,000 kB 的端粒，推荐使用 0.5× TBE；而对于 8,000 kB 至 20,000 kB 之间的端粒，则推荐使用 1× TAE1。
  2. 将溶液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解且溶液澄清。在室温下冷却 15–20 分钟，或冷却至琼脂糖温度降至 50 °C。
  3. 在琼脂糖溶液冷却期间，按照步骤 2.2 所述准备凝胶电泳系统以进行凝胶浇注。将琼脂糖凝胶溶液倒入凝胶制备托盘中，并插入梳子。在室温下敞口静置 45 分钟，使凝胶完全凝固。
  4. 准备用于电泳的消化 DNA 样品。对于 40 µL 的反应体系，向每份消化后的 DNA 样品中加入 0.4 µL 的 10× 上样染料。短暂离心（10–15 秒，16,000 × g），确保所有溶液均位于离心管底部。
  5. 准备用于 DNA 迁移的凝胶电泳系统。从凝胶中移除两端挡板和梳子。向凝胶电泳装置中加入 1× TAE 或 0.5× TBE 缓冲液至标线处，确保凝胶完全浸没于缓冲液中。
  6. 将 DNA 样品上样至凝胶的加样孔中，样品之间保留一个空白孔。避免产生气泡或刺穿凝胶。在凝胶两端的加样孔中各加入 10 µL DNA 分子量标记物。
    注意：所用 DNA 分子量标记物的类型取决于端粒长度，而端粒长度因人而异，也随细胞来源不同而变化。
  7. 以 150 V 电压运行凝胶电泳 30 分钟，使 DNA 快速进入凝胶；随后将电压调整为 57 V，继续运行 18–24 小时。

5. 凝胶荧光成像与杂交

  1. 孵育 18–24 小时后，关闭凝胶电泳电源。将带有凝胶的凝胶制备托盘从电泳缓冲液中取出。切去凝胶的右上角作为标记，以指示凝胶的方向。
  2. 裁剪一张略大于凝胶的滤纸。将滤纸覆盖在凝胶托盘中的凝胶上，使其吸收凝胶表面多余的溶液。使用移液器作为滚轮，从边缘轻轻挤压，去除滤纸与凝胶之间的气泡。
  3. 将凝胶连同滤纸一起翻转，使滤纸位于凝胶下方，从而将凝胶从制备托盘中取出。将凝胶与滤纸转移至凝胶干燥仪中，并用塑料膜覆盖凝胶。再次使用移液器作为滚轮，去除塑料膜与凝胶之间的所有气泡。
  4. 在 50 °C 下干燥凝胶 2 小时。
  5. 干燥完成后，揭去塑料膜，将凝胶连同滤纸转移至盛有 250 mL 去离子水（足以浸没凝胶）的玻璃皿中。小心移除滤纸，并在室温下孵育凝胶 15 分钟。此时凝胶将变得薄而坚韧，易于操作且不易撕裂。
  6. 用去离子水配制 5x SSC 溶液（750 mM NaCl；75 mM 柠檬酸钠）。
  7. 将凝胶平铺于一张尼龙网膜（12 英寸 × 12 英寸）上。将尼龙网膜与凝胶一起卷起，确保凝胶各部分不相互接触。将卷好的网膜与凝胶放入杂交管中（例如，直径 1.5 英寸、长 12 英寸的管子）。
    注意：正确卷好后，凝胶两侧均应与尼龙网膜接触。
  8. 将 100 mL 5x SSC 溶液与 12 µL 绿色荧光核酸染料混合，加入杂交管中。避光处理，在杂交炉中于 42 °C 旋转孵育 30 分钟。
  9. 从杂交管中取出尼龙网膜/凝胶，展开后平放于盛有 250 mL 去离子水的玻璃皿中，轻轻剥离尼龙网膜。使用磷屏成像仪对凝胶成像。荧光检测参数设置如下：520 BP、40 Blue 和 488 nm。光电倍增管（PMT）设为 375，焦平面设为 +3 mm，灵敏度设为正常。将图像保存为文件。

6. 杂交

  1. 制备放射性端粒探针。
    1. 在微量离心管中加入 2 µL（2 ng）端粒探针（5'- (CCC TAA)4 3'）、2.5 µL 10x 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、3 µL γ32P-dATP（6,000 Ci/mmol）、4 µL T4 多聚核苷酸激酶，以及无DNase的无菌去离子水，总体积补至 20 µL。
      注意：使用放射性物质时，须遵守相关设施的放射性安全规定。
  2. 短暂离心（16,000 × g，10–30 秒），然后在 37 °C 水浴中孵育 1 小时。再次离心（16,000 × g，10–30 秒），并在 65 °C 孵育 20 分钟以终止反应。
  3. 使用 G-25 层析微自旋柱，通过涡旋混合柱内内容物，然后在室温下以 700 × g 离心 1 分钟。弃去滤液。
  4. 将放射性探针溶液加入 G-25 层析柱中，在 700 × g 下离心 2 分钟。保留滤液。
    注意：请保留滤液，其中含有放射性端粒探针。如需保存，可将放射性探针置于 4 °C 保存。
  5. 用无菌去离子水配制 250 mL 变性溶液，含 1.5 M NaCl 和 0.5 M NaOH。
  6. 将凝胶放入盛有 250 mL 变性溶液的玻璃皿中，在室温下孵育 15 分钟。移除变性溶液，更换为 250 mL 无菌去离子水，在室温下于旋转摇床（40–50 rpm）上孵育 10 分钟。
  7. 用无菌去离子水配制 250 mL 中和溶液，含 1.5 M NaCl 和 0.5 M Tris-盐酸（pH 8.0）。
  8. 移除去离子水，加入 250 mL 中和溶液，在室温下孵育 15 分钟。
  9. 在中和溶液孵育期间，用无菌去离子水配制 50 mL 杂交溶液，含 5x SSC、5x Denhardt 溶液（0.1% 非离子型合成聚合物；0.1% 聚乙烯吡咯烷酮；0.1% 牛血清白蛋白）、10 mM 磷酸氢二钠（Na2HPO4）和 1 mM 十水合焦磷酸四钠（Na4P2O7 . 10 H2O）。
  10. 将凝胶卷入尼龙网中，放入杂交管（步骤 5.7）。加入 20 mL 杂交溶液，在 42 °C 杂交炉中旋转孵育 10 分钟。
  11. 移除杂交溶液，更换为 20 mL 新鲜杂交溶液。加入全部端粒探针，在 42 °C 杂交炉中旋转孵育过夜。

7. 凝胶洗涤、磷屏曝光与放射自显影

  1. 在无菌去离子水中配制 500 mL 的 2× SSC 溶液（300 mM NaCl；30 mM 柠檬酸钠）。
  2. 在去离子水中配制 250 mL 的 0.1× SSC（15 mM NaCl；1.5 mM 柠檬酸钠）和 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
  3. 从杂交管中取出凝胶和尼龙网，放入盛有 250 mL 2× SSC 的玻璃皿中。展开并从皿中移除尼龙网。将玻璃皿置于摇床上，室温孵育 15 分钟。
  4. 弃去 2× SSC 溶液，加入 250 mL 0.1× SSC 和 0.1% SDS 溶液，置于摇床上室温孵育 15 分钟。
  5. 孵育期间，将磷屏暴露于图像擦除仪中 15 分钟。
  6. 弃去 0.1× SSC 和 0.1% SDS 溶液，加入 250 mL 2× SSC 溶液，置于摇床上孵育 15 分钟。
  7. 从 2× SSC 溶液中取出凝胶，用保鲜膜包裹或放入可热封的塑料袋中。确保凝胶与保鲜膜或塑料袋之间无气泡和空气间隙。将凝胶放入曝光盒中并与磷屏接触，室温避光过夜曝光。
  8. 使用磷光成像仪对曝光后的磷屏进行成像。

8. 端粒长度定量分析

  1. 打开包含绿色荧光核酸染色凝胶荧光图像的磷屏成像文件（图1）。
  2. 选择“工具”（Tools），然后选择“像素距离”（Pixel Distance）。使用鼠标从凝胶加样孔底部画线至第一个标记条带的中点，并记录该距离。对每个标记条带重复此操作（图2）。这些距离将用于下文所述的作图程序中。
  3. 打开放射性标记凝胶的磷屏图像（图3）。选择“对象管理器”（Object Manager），然后选择“网格”（Grid）。将网格设置为1列150行。调整网格，使其从凝胶顶部延伸到底部。通过点击网格边缘并拖动，将网格宽度调整为与泳道宽度相等。
  4. 复制此网格（以保持每个格子的宽度和高度一致），并将第二个网格移至一个空白泳道（用于背景测定）。继续复制并移动额外的网格以覆盖其他样品泳道。
    注意：完成后，每个样品泳道均应有一个对应的网格，另需一个位于空白泳道的网格用于背景校正（图4）。
  5. 选择“分析”（Analysis"），然后选择“体积报告”（Volume Report）。在报告中选中所有网格。当体积报告显示后，双击报告以启动电子表格程序。保存该电子表格文件。此文件中的数据将位于“体积”（Volume）列下。
  6. 打开合适的作图程序，创建新的数据表。选择“Y：为每个数据点输入并绘制单个Y值”，然后选择“创建”（Create）。
  7. 将第一列（X列）标记为“测量距离”（Measured Distance），将第二列（Y列）标记为“分子量”（Molecular Weight）。在Y列中输入各标记条带对应的分子量。在X列中输入步骤8.2中获得的各分子量标记条带的迁移距离。
  8. 进入“分析”（Analysis），选择“分析”（Analyze），然后选择“非线性回归”（非线性拟合，curve fit），点击“确定”（OK）。在下一个界面中，选择“指数函数”（Exponential），然后选择“单相衰减”（One phase decay）。选择“范围”（Range）选项卡，在“定义曲线的数据点数量”中输入“150”，并勾选“创建XY坐标表以便导出或将曲线复制到其他程序”选项。
    注意：“数据1的非线性拟合”结果中包含每个迁移距离对应的分子量（Y值）。
  9. 在分析样品泳道时，选择一个分析区域，该区域应位于实际端粒条带的上方和下方。不要使用整个泳道的长度（图5）。确定每个泳道分析区域所对应的网格位置。
  10. 选择“文件”（File）、“新建”（New）、“创建新表格和图表”（Create new Table and Graph）。选择“Y：为每个数据点输入并绘制单个Y值”，然后选择“创建”（Create）。将电子表格文件中背景泳道的体积值（即强度值）复制粘贴至第一列（X列），将样品泳道的体积值（强度值）复制粘贴至第一列Y中。如果有多个样品泳道，将每组体积值从电子表格中复制到作图程序文件中对应的额外Y列中。
  11. 删除背景列（X）和各样品泳道列（Y）中位于步骤8.8所确定分析区域之外的数据值。
    注意：数据表中仅应保留对应于分析区域的网格位置的数据值。
  12. 选择“分析”（Analysis），然后选择“分析”（Analyze）和“转换”（Transform），点击“确定”（OK）。选择“使用 Y=Y-X 转换Y值”。此操作将对数据2进行转换（转换后的强度值（Y）= 样品强度（Y）－背景强度（X））。
    1. 选择“分析”（Analysis），然后选择“分析”（Analyze）、“列分析”（Column Analysis）和“列统计”（Column statistics），点击“确定”（OK）。结果标签页“数据2转换的列统计”（Col. Stats of Transform of Data 2）中，“总和”（Sum）行下方显示 ∑(Inti)。
  13. 选择“文件”（File）、“新建”（New）、“创建新表格和图表”（Create New Table and Graph）。选择“Y：为每个数据点输入并绘制单个Y值”，然后选择“创建”（Create）。将“数据1非线性拟合曲线”结果页中的Y列数据复制粘贴至新的X列中。将“数据2转换”结果页中的Y列数据复制粘贴至新的Y列中。选择“分析”（Analysis），然后选择“分析”（Analyze）和“转换”（Transform），点击“确定”（OK）。选择“使用 Y=Y/X 转换Y值”。
    1. 选择“分析”（Analysis），然后选择“分析”（Analyze）、“列分析”（Column Analysis）和“列统计”（Column statistics），点击“确定”（OK）。结果标签页“数据3转换的列统计”（Col. Stats of Transform of Data 3）中，“总和”（Sum）行下方显示 ∑(Inti/MWi)。MW表示分子量。
  14. 为计算每个样品的平均端粒长度（TL），使用公式 TL = ∑(Inti) / ∑(Inti/MWi)。

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结果

三种浓度的DNA（1、2和 3 µg) 来自BJ-hTERT细胞系（端粒酶永生化的人包皮成纤维细胞）22 并分析了人外周血单个核细胞（PBMCs）的端粒长度。 表1 显示每个DNA样本的加样孔分配。 图1 显示了凝胶的核酸荧光染色结果。分子量标准条带清晰可见。测定了每个分子量标准条带距凝胶顶部的距离（图2). 图3 显示了与端粒探针杂交后凝胶的磷屏成像结果。每条泳道中的端粒条带呈弥散状。每条泳道计算了150个方格的网格，另加一个背景泳道（图 4）。每个样本组凝胶中对应端粒条带的分析区域如图所示。 图5为每组样本选择独立的背景条带，以确保每组样本的背景强度相近（标记为 B 的条带）

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讨论

电泳结束后，基因组DNA弥散条带应高于800 bp。如果限制性内切酶失效，或需要额外的酶（如上所述），则可能出现此现象。另一个可能的原因是蛋白质仍与DNA结合。通过分光光度计测定DNA浓度时，260/280比值应约为1.8。如果该比值<1.5，则表明存在蛋白质污染，可能干扰限制性内切酶的消化反应。此时需重新分离DNA样品，或使用蛋白酶K消化结合苯酚:氯仿抽提，再经乙醇沉淀去除蛋白质。使用商业化DNA提取试剂盒通常可获得260/280比值为1.8–1.85的DNA。

在将凝胶暴露于磷屏后，未检测到端粒片段。这可能是由于端粒探针放射性标记不佳、杂交条件不当或起始基因组DNA量不足所致。在制备端粒探针时，G-25柱离心结束后，流出液中应能明显检测到放射性信号（代表放射性标记的端粒探针）。若未检测到放射性，则说明探针制备存在问题。此外，必须确保杂交温度不超过42 °C（以防止探针与模板复合物解链），并且杂交缓冲液应完全浸没杂交容器中的凝胶。能够检测到端粒的基因组DNA最低用量为2.0–3.0 µg。起始材料量过少可能导致杂交后信号极弱甚至无信号。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢匹兹堡大学癌症研究所生物行为肿瘤学共享设施的支持，该设施部分由资助项目 P30CA047904 提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>生物制剂
Rsa1，限制性内切酶新英格兰生物实验室股份有限公司R0167S10,000 U/mL，DNA 消化。  附带 Cutsmart 缓冲液（消化缓冲液）
Hinf1，限制性内切酶New England Biolabs, IncR0155S10,000 U/mL，DNA 消化。  附带 Cutsmart 缓冲液（消化缓冲液）
Seakem GTG 琼脂糖Lonza50071电泳级琼脂糖
Optikinase Affymetrix78334X 500 UNT4 多核苷酸激酶
SYBR Green 核酸染料 I赛默飞世尔科技S7567Syber Green
exactGene DNA Ladder 24-kBFisher ScientificBP2580100
C链探针（3'-(G3AT2)4-5'）Integrated DNA Technologies定制合成DNA寡核苷酸
Gamma-ATP-P32Perkin ElmerBLU502Z放射性同位素
Qiagen 血液与细胞培养 DNA 小量提取试剂盒Qiagen13323DNA提取试剂盒
GE Illustra Microspin G-25 柱GE Healthcare Life Sciences27-5325-01用于纯化放射性寡核苷酸探针
Ficoll 400非离子型合成聚合物
<强>仪器/软件
Owl A5 凝胶电泳系统（20 cm × 25 cm）赛默飞世尔科技A5凝胶电泳
Horizon 11.4 电泳系统（11 cm × 14 cm）科睿尔生命科学11068020凝胶电泳
尼龙网，50，12" ×12"Ted Pellam, Inc41-12105
GE 储磷屏GE Healthcare Life Sciences28-9564-75
磷光屏曝光暗盒GE Healthcare Life Sciences63-0035-44
Isotemp 杂交孵育箱Fisher Scientific13-247-20Q
圆柱形杂交管Fisher Scientific13-247-300
The Belly Dancer 轨道摇床Sigma-AldrichZ768499-1EA轨道摇床
Typhoon 9400ABI用于凝胶和磷屏成像
GraphPad Prism 6GraphPad版本 6.05绘图程序
Microsoft Excel微软Office 365电子表格程序
Nanodrop赛默飞世尔科技Nanodrp 2000分光光度计

参考文献

  1. Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).
  2. Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
  3. Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
  4. Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
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