Method Article

无异条件下多原代羊水和膜细胞重新编程

DOI:

10.3791/56003

⸱

November 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

In This Article

Summary

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该协议描述了在完全化学定义的条件下, 使用 non-integrating episomal 方法将原代羊水和膜间充质干细胞重新编程为诱导多能干细胞。详细介绍了通过严格的方法提取、培养、重新编程和表征所产生的诱导多能干细胞的过程。

Abstract

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随着诱导多能干细胞的引入, 自体细胞疗法在现实中得到了更进一步的研究。胚胎干细胞, 如羊水和膜间充质干细胞, 代表了一种独特的组织工程中的未分化细胞, 并为未来的儿科干预和干细胞银行重组为 iPSC。这里介绍的协议描述了一个优化的过程, 以提取和培养初级羊水和膜间充质干细胞和产生 episomal 诱导多能干细胞从这些细胞在完全化学定义的文化利用人类重组受精和 E8 培养基的条件。本文还描述了采用严格的方法-流式细胞仪、共聚焦成像、畸胎瘤形成和转录分析-的新品系的特性。新生成的 Oct3/4A、Nanog、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4 等胚胎干细胞的标记, 同时对 SSEA-1 标记呈阴性。干细胞系形成畸胎瘤在免疫缺陷-米色小鼠6-8 周和畸胎瘤包含组织代表的所有三种细菌层。通过将全球表达微阵列数据提交到生物多评估算法中的线转录分析认为所有的线多能性, 因此, 这种方法是一个诱人的替代动物试验。新的 iPSC 线可以很容易地用于下游实验, 涉及优化分化和组织工程。

Introduction

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诱导多能干细胞技术 (iPSC) 带来了潜在的细胞置换疗法, 疾病和发育模型, 药物和毒理学筛选1,2,3。在概念上可以通过细胞注射、体外分化组织 (如心脏贴片) 或通过组织工程进行引导再生来实现替代疗法。羊水 (AFSC) 和膜干细胞 (AMSC) 是一种极好的细胞源, 这些干预措施要么直接4,5,6,7 ,要么作为重新编程的起始单元格填充进入多8,9,10,11,12。

早期的方法使用未定义的区域性系统或重新编程的方法, 需要构建9、

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Protocol

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该议定书遵循人类研究道德委员会的机构准则。病人的书面同意获得了使用羊水进行研究。

该议定书遵循南阿拉巴马大学机构动物保育和使用委员会的政策。

1. 原代羊膜间充质干细胞的分离培养

  1. 羊膜液细胞的电镀
    1. 在医生的羊膜穿刺过程中获得至少2.5 毫升的羊水。
      注: 所有活细胞和组织的处理必须在无菌组织培养柜中进行, 必须使用适当的个人防护设备。熟悉基本的细胞培养和无菌技术是必需的。
    2. 制备羊水和膜细胞 (AFMC) 培养基: EBM-2 基培养基, 15% 胎牛血清 (FBS), 20 ng/毫升的 bFGF, 25 ng/ml 的 EGF, 10 ng/毫升的 igf-i。对于原代羊水和羊膜干细胞的培养, 培养基应辅以抗生素-抗液。
    3. 在0天, 混合2.5 毫升的羊水与3.5 毫升的 AFMC 培养基和板块成一个 T25 烧瓶。孵育在37° c 和 5% CO2为至少 48 h 不受干扰在检查之前殖民地的存在。
    4. 在5天, 黏附细胞的殖民地应该存在。轻轻摇动烧瓶, 将未完全附着在底部和碎片上的细胞取出, 用巴斯德吸管抽吸所用的中/羊水混合液。替换为5毫升的新鲜 AFMC 培养基。
    5. 文化再过5天。每隔一天更换介质, 如步骤1.1.4 中所述。

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Results

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在为遗传学测试目的采集羊水之前, 患者获得了知情的书面同意, 并为研究提供了一小分。由于胎盘代表医疗废物, 在研究中使用羊膜是不需要同意的。羊水和膜干细胞表现出典型的间质性, 其细胞形态呈纺锤形, 相亮。在重新编程时, 细胞经历 mesenchymal-to-epithelial (MET) 过渡, 并获得鹅卵石样的形态学和空间组织的殖民地, 表明上皮的性质。这一过程是启动早在 48-72 h 后引进重新编程 episomal 质粒。这些殖民地的缺席5天的重新编程将表明失败的实验。被遇见的殖民地的细胞增殖和结果, 殖民地变得紧凑, 在天5和14之间。紧凑的 MET 菌落由不易单独识别的细胞组成 (图 1A)。在14天左右, 完全重新编程的殖民地出现与细胞排列在单层, 携带突出, 容易辨认的原子核和核仁。当菌落达到合适的尺寸并变得紧凑 (图 1B) 时, 它们可以被机械地隔离和扩展。

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Discussion

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胚胎干细胞 iPSC 生成的初始阶段需要从胎儿组织中提取源细胞, 它们的培养、扩展和 episomal 重编程质粒的引入。在第一个完全重新编程的殖民地可以扩展之前, 这一阶段的文化周期大约14-18 天。最后阶段是 iPSC 无性系的成熟。羊膜干细胞的初步提取是通过羊膜的联合机械和酶消化的方法来实现的。我们发现, 潜伏期为30分钟, 产生的细胞数量最多, 提取的存活率最高。消化过程可以产生小块的组织和细胞团簇。如果这些相对于单个细胞的比例很高, 我们建议把所有的团簇和单细胞都镀到一个容器中, 因为所有这些都可以促进生长的黏附细胞。电镀羊水干细胞是直接的, 因为细胞只与培养基混合, 并孵育直到附着细胞的菌落达到足够的大小。定期组织培养治疗 plasticware 是完全合适的, 我们不建议专业的表面, 即使他们的目的是改善原细胞培养, 因为与这些我们观察到较低的上和困难与传代过程.

羊水和膜干细胞应扩大和储存, 但在方便的时候, 细胞可以作为源细胞重新编程。为了将 episomal 质粒引入细胞, 在这里使用的转染系统的转染参数设置为950伏、40 ms 和1脉, 表现非常好, 所有.......

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Disclosures

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作者声明他们没有竞争的金融利益。

Acknowledgements

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这项工作得到了全 Medizinische Forschung 在苏黎世大学的 Forschungskredit, 苏黎世大学, absciex NMSCh在研究金10.216 和 12.176, 瑞士国立心脏病学会, 瑞士国家科学依据授予 [320030-122273] 并且 [310030-143992], 第七框架节目, 生活阀门, 欧共体根据授予 [242008], 奥尔加 Mayenfisch 基础, EMDO 基础, 启动的津贴2012大学医院苏黎世和米切尔癌症研究所的内部资金。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
肿瘤解离试剂盒，人Miltenyi Biotec130-095-929组织解离系统，试剂盒，包括组织解离管和组织解离酶
gentleMACS 解离器Miltenyi Biotec130-093-235组织解离系统，解离器
Thermo Scientific™山顿™一次性手术刀 10 号，无菌，独立包装，5.75 （14.6 厘米）Thermo-Fisher3120032
70 µM 细胞过滤器康宁10054-456
RPMI 1640 培养基Thermo-Fisher32404014 
摇床平台VWR40000-300
50 ml 离心管Thermo-Fisher339652
15 ml 离心管Thermo-Fisher339650
EBM-2 基础培养基LonzaCC-3156AFMC 基础培养基
FGF 2 人（以大肠杆菌表达，非糖基化）Prospec BioCYT-218bFGF，AFMC 培养基
EGF Human 补充剂，PichiaProspec BioCYT-332 EGF，AFMC 培养基的补充剂
LR3 胰岛素样生长因子-1 人重组Prospec BioCYT-022IGF，AFMC 培养基
牛血清补充剂，胚胎干细胞合格的Thermo-Fisher10439024FBS
抗生素-抗真菌剂 （100X）Thermo-Fisher15240062 对于原代 AFSC/AMSC，对于常规 AFSC/AMSC，应该没有必要，不要在转染细胞的培养基中使用！
Accutase 细胞分离解决方案StemCell Technologies07920细胞分离酶
CryoStor™CS10StemCell Technologies07930完全冻存培养基
PBS，pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree 质粒 Maxi 试剂盒 （10）Qiagen12362用于质粒分离
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K，重编程因子 Oct4+Sox2，Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K，重编程因子 Oct4+Sox2，SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L，重编程因子 c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c 紫外-可见分光光度计Thermo-FisherND-2000C分光光度计
Neon®转染系统Thermo-FisherMPK5000转染系统，组件：
Neon 移液器 - 转染移液器
Neon 设备 -
Neon® 转染设备转染系统 10 µL 试剂盒Thermo-FisherMPK1025用于 Neon 转染系统的耗材试剂盒，包含：
Neon 针头 - 转染针头
Neon 管 - 转染管
缓冲液 R - 重悬缓冲液
缓冲液 E - 电解缓冲液
Stemolecule™丁酸钠StemGent04-0005重编程小分子增强剂
TeSR-E8StemCell Technologies05940E8 培养基
连蛋白 XF™StemCell Technologies07180VTN，储备液浓度 250 µg/ml，用于 1 µ 包衣;g/cm2玻连蛋白稀释液 （CellAdhere） 缓冲液
CellAdhere™稀释缓冲液StemCell Technologies07183玻连蛋白稀释缓冲液
UltraPure™ 0.5M EDTA，pH 8.0Thermo-Fisher15575020使用前用 PBS 稀释至 0.5 mM
®FL成像系统Thermo-Fisher ScientificAMF4300LCD成像显微镜
CKX53 倒置显微镜奥林巴斯相差细胞培养显微镜
刺穿™ 16%甲醛（w / v），不含甲醇的Thermo-Fisher28908使用前用PBS稀释至4%，稀释后可在2-8°C储存;C 1 周
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050透化缓冲液，冷却至 -20 °C;C 使用前
小鼠 IgG1， κ同种型对照，Alexa Fluor®488BD Biosciences 557782Oct3/4A、Nanog
小鼠 IgG1 和 kappa 的同种型对照;同种型对照，Alexa Fluor®647BD Biosciences557783对照 Sox2
小鼠抗人 Oct3/4（人亚型 A），Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
小鼠抗人 Nanog，Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
小鼠抗人 Sox-2，Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
小鼠 IgGM，κ同种型对照，Alexa Fluor®488BD Biosciences401617TRA-1-60
小鼠 IgGM &kappa 的同种型对照;同种型对照，Alexa Fluor®647BD Biosciences401618TRA-1-81
小鼠抗人 TRA-1-60 的同种型对照，Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
小鼠抗人 TRA-1-81，Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
小鼠 IgG1 和 kappa;同种型对照，Alexa Fluor®488BD Biosciences400129SSEA-1
小鼠 IgG3 &kappa 的同种型对照;同种型对照，Alexa Fluor®647BD Biosciences401321SSEA-4
小鼠抗人SSEA-1的同种型对照，Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
抗人SSEA-4，Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F（ab'）2片段山羊抗小鼠IgG+IgM，Alexa Fluor® 488Jackson Immunoresearch115-606-068以 1：600 的稀释度使用或进一步优化
Affinipure F（ab'）2 片段山羊抗小鼠 IgG+IgM，Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-068以 1：600 的稀释度使用或进一步优化
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490储备液 10 mM，进一步稀释至 1：12.000 以获得工作溶液
Corning®基质胶®生长因子降低、无酚红的康宁356231基底膜基质 （BMM）
scid-米色小鼠，雌性TaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus 迷你试剂盒 （50）Qiagen74134RNA 分离试剂盒
T-25 培养瓶，经组织培养处理的Thermo-Fisher156367
T-75 培养瓶，经组织培养处理的Thermo-Fisher
Nunc™ 组织培养皿Thermo-Fisher12-567-650 10 cm 组织培养皿
6 孔板，组织培养处理Thermo-Fisher140675
Neubauer 计数室（血细胞计数器）VWR15170-173
Frosty 先生™Thermo-Fisher5100-0001 冷冻容器 冷冻容器
FACS 管， 圆底聚苯乙烯试管， 5 ml康宁3520585 ml 聚苯乙烯管
Eppendorf 管， 1.5 mlThermo-Fisher05-402-961.5 ml 微量离心管
PCR 管， 200 &微量;lThermo-Fisher14-222-262
移液器吸头，100 至 1250 和微量;lThermo-Fisher02-707-407窄口径 1 mL 吸头
移液器吸头，5 至 300 和微量吸头;lThermo-Fisher02-707-410
移液器吸头，0.1 至 10 和微量;lThermo-Fisher02-707-437
大口径移液器吸头，1000 &lVWR89049-166大口径 1 mL 吸头
玻璃 巴斯德移液器Thermo-Fisher13-678-20A
乙醇，200 标准真空 Thermo-Fisher04-355-451
涡旋混合器VWR10153-842
腔室盖玻片，8 孔，1.5 mm 硼硅酸盐玻璃Thermo-Fisher155409玻璃底共聚焦级培养器皿
22G 针头VWR82002-366
胰岛素注射器Thermo-Fisher22-253-260
福尔马林溶液，中性缓冲，10%Sigma-AldrichHT501128-4L固定外植畸胎瘤
Illumina HT-12 v4 表达 BeachChipIlluminaBD-103-0204表达微阵列，由 PluriTest 支持，制造商停产
PrimeView 人类基因组 U219 阵列板Thermo-Fisher901605表达微阵列芯片（原 Affymetrix 品牌），即将得到 PluriTest
GeneChip&trade 的支持;人类基因组 U133 Plus 2.0 阵列Thermo-Fisher902482表达微阵列芯片（原 Affymetrix 品牌），由 CellNet 支持，即将由 PluriTest
PluriTest® 提供支持;Coriell Institutewww.pluritest.org，多能性生物信息学评估免费服务，接受微阵列数据 - 来自 HT-12 v4 平台的 *.idat 文件，即将支持 U133、U219 微阵列和 RNA 测序数据
CellNet约翰霍普金斯大学cellnet.hms.harvard.edu，基于 U133 微阵列数据，包括多能干细胞的细胞类型生物信息学鉴定免费服务 - *.cel 文件，即将支持 RNA测序数据
胎，玻小鼠156499

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell....

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Amniotic Fluid CellsMembrane Mesenchymal Stem CellsEpisomal ReprogrammingChemically Defined ConditionsHuman Recombinant VitronectinE8 MediumFlow CytometryConfocal ImagingTeratoma FormationTranscriptional Profiling

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