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方法文章

体内评估大鼠舌组织的力学与黏弹性特性

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DOI:

10.3791/56006

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2017年7月6日

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种在麻醉大鼠模型中进行的外科手术操作,用于测定舌肌的肌张力及黏弹性特性。该操作包括对舌下神经进行特异性刺激,并对肌肉施加被动李萨如力/形变曲线。

摘要

舌头是大多数脊椎动物口腔底部高度神经支配和血管化的肌肉性流体静力结构。其主要功能包括辅助咀嚼和吞咽,以及味觉感知和发音。因此,舌头的强度和体积可影响脊椎动物完成摄食、交流和呼吸等基本活动的能力。患有睡眠呼吸暂停的人类患者常表现为舌体增大,其特征为肌张力降低和肌内脂肪增加,这些变化可通过磁共振成像(MRI)进行可视化和量化。测量舌头力量生成能力及其黏弹性特性的方法,是获取功能信息并与影像数据相关联的重要工具。本文介绍了在麻醉的Zucker大鼠中测量舌力产生的技术。 通过 对舌下神经进行电刺激,并通过施加被动李萨如力/形变曲线来测定舌头的黏弹性特性。

引言

舌头在咀嚼、吞咽、味觉感知和言语中提供重要的支持作用。舌部具有独特的外在和内在肌肉结构,其神经支配及解剖与功能各不相同,这构成了这一肌肉性流体静力骨骼系统的独特性。近年来成像技术的进步为人们更详细地了解其复杂解剖结构提供了可能1。舌功能减退、舌萎缩、吞咽困难以及言语障碍也是多种肌病的常见表现,例如帕金森病2、肌萎缩侧索硬化症(ALS)3、强直性肌营养不良症(MD)4以及其他肌病。

与常见疾病状态相关的肌肉成分变化会影响舌的力学和黏弹性特性。例如,对舌力的功能分析揭示了与衰老5,6、缺氧7,8和肥胖9,10相关的收缩特性改变。在肌营养不良的情况下,纤维化程度增加导致肌肉刚度升高,这在应用利萨茹变形协议时表现为对变形的顺应性降低11。相反,肌肉脂肪含量的变化(如在肥胖患者中所记录的)会改变骨骼肌的代谢12和力学特性13,14,并预计会提高肌肉对变形的顺应性。舌脂肪含量增加也与人类阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)的发展相关17,其机制是通过增加舌体积至部分上气道阻塞(呼吸暂停)的程度15,16。与人类相似,在肥胖Zucker大鼠中也已观察到舌内脂肪浸润现象10,提示该模型是研究脂肪浸润对舌生理影响的有力工具。

测量舌肌力量需要精细的外科技术,以分离并双侧刺激舌下神经17,18。此类技术此前已在大鼠5,17,19,20、兔21和人类22,23中描述,但对研究者而言缺乏足够的可视化辅助。由于该技术具有高度专业性,提供一份详尽的操作方案将显著提升该技术的可及性与可重复性。本实验范式的目标是展示一种在大鼠模型中测量舌肌力量及其黏弹性特性的有效且可靠的技术。为实现该目标,首先对大鼠实施麻醉,暴露舌下神经,并对气管进行插管,以确保能够自由接触动物的舌体。随后,使用缝合线环将舌尖连接至一个能够同时控制力和长度的力传感器,同时采用两个双极钩状电极刺激舌下神经,以诱发舌肌收缩。完成力量测量后,利用力传感器的长度控制功能,按照固定振幅(李萨如曲线)、持续时间和频率的正弦波协议快速改变舌的长度,从而推导其黏弹性特性11,24。本方案将指导研究者完成解剖步骤、动物在实验平台上的定位、电极放置,以及最终的力和黏弹性数据采集与分析。

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方案

所有涉及动物受试者的操作均已被宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准(方案编号 805822)。所述操作为终末性操作,无需使用无菌条件或药品级产品。

1. 手术操作

在动物舌头上进行手术步骤,使用器械,展示组织扩张与修复。
图1:手术操作步骤。
(A) 手术规划标记。红色虚线表示切口区域。两条黑色线表示下颌位置,底部黑色线标记胸廓位置。蓝色线表示舌骨。 (B) 钝性分离脂肪组织、舌下腺和颌下腺后,暴露二腹肌后腹(箭头所示)。 (C) 切除二腹肌后腹(绿色虚线),以暴露舌下神经(白色箭头)。 (D) 将舌下神经(白色箭头)从周围筋膜中游离出来。 (E) 通过轻轻牵拉气管周围的平滑肌(绿色箭头指示施力方向)暴露气管,并将其提起 (F) 以备插管。星号表示舌头在舌骨上的附着点。绿色虚线标记插管切口位置。白色箭头指示已预先打好的松结,用于在插管插入后固定导管。 (G) 切开气管以进行插管。 (H) 插入气管套管并用方结固定。 (I) 对舌头进行缝合。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 麻醉与手术准备
    1. 将大鼠放入含有4%异氟烷麻醉剂的诱导室中。
    2. 将动物仰卧于热源上,通过鼻罩以1 - 3%异氟烷维持麻醉,确保呼吸频率至少为每分钟70次。
    3. 用电动推剪和脱毛膏剃除颈部区域的毛发。使用脱毛膏时,用棉签将脱毛膏均匀涂抹于毛发区域,直至毛发完全去除。脱毛膏接触皮肤时间过长可能引起皮肤刺激。
    4. 用70%酒精清洁手术区域(图1A).
    5. 在进行初始切口前,检查动物的呼吸模式和反射(如脚趾夹捏反射消失)。持续监测和评估麻醉深度至关重要(每10分钟记录一次呼吸频率和反射消失情况);在整个手术过程中,动物必须维持在深度外科麻醉水平。
  2. 舌下神经识别
    1. 用手术剪沿图中红色虚线所示位置切开并去除皮肤,以暴露手术区域 图1A.
    2. 钝性分离穿过脂肪组织、舌下腺和下颌下腺以及气管周围的肌肉层。
      注意:解剖时应谨慎操作,尽可能使用钝性分离,并注意避免损伤颈部血管。
    3. 在气管外侧辨认二腹肌后腹(PD)图1B - 白色箭头)。舌下神经走行于该肌肉下方(图1C - 白色箭头)。使用电灼器在舌骨近端切除甲状软骨(图1C - 虚线)。
      注意:切勿让神经或其周围组织变干。在神经上滴加一滴矿物油以保护之。为避免刺激从电极场传播引起肌肉收缩,请仔细烧灼神经周围可能接触部位的肌肉组织。
    4. 使用一对精细镊子,将舌下神经从周围的筋膜中分离出来。借助钩子,确保至少有3 mm的神经暴露,以便连接双极电极。图1D).
    5. 使用微型止血钳,在远离舌骨的位置压榨舌下神经(图1D - 白色箭头)尽可能避免刺激的逆向传导。用显微止血钳对神经施加压力,持续5秒,以压榨神经。当止血钳夹住神经时,应可见舌根部出现短暂的抽搐。
    6. 对另一侧重复该操作步骤。
  3. 气管插管
    1. 通过钝性解剖轻轻分离周围平滑肌,暴露气管(图1E - 如绿色箭头所示)。
      注意:操作应谨慎,优先使用钝性分离。将套管的直径与气管直径进行比较。套管应与气管匹配良好,并在按照步骤1.3.2至1.3.5所述缝合后能稳定留置。
    2. 使用持针器轻轻提起气管,并将一根4-0缝线从气管下方穿过,靠近胸腔。在距喉部第6与第7软骨环之间打一个初始的松结图1F - 白色箭头)。插入套管后将此结扎紧,以固定其位置。
    3. 将移液管的管 stem(用矿物油润滑移液管以方便插入)从气管下方滑入,以抬起气管并便于插入套管(IV 14 g × 3.25" 套管)。
    4. 从喉部起第4与第5环之间切开一个小切口图1G - 白色箭头)。首次切开后,切口往往会扩大,因此初始切割需保守操作,以避免气管被完全切除。
      注意:在切开气管前,确保导管已准备就绪,且麻醉输送系统已开启。
    5. 通过套管开始麻醉给药,轻柔地将套管插入切口,并在气管内推进约5个气管环的长度。用缝线固定套管,以形成密闭的气道密封。图1H).
      注意:确保液体不进入切开的气管,以避免窒息。一旦切开气管,动物将呼吸室内空气,因此应迅速插入套管以维持麻醉气体的供给。在移动动物时(如有必要),需监测套管在气管内的正确位置。
    6. 轻轻地将动物从鼻罩中取出。
      注意:使用注射类麻醉剂替代异氟烷可省去气管插管步骤,并减少实验操作区域的管路干扰,从而简化实验流程。
  4. 舌部缝合
    1. 将一段20 cm长的5/0缝合线(建议使用黑色编织丝线)浸泡在PBS中。
    2. 在保持大鼠口腔张开的同时,用打结镊子轻轻夹住舌尖。
    3. 将缝线从舌尖向内侧穿过(图1I - 白色箭头)注意用生理盐水保持舌头湿润,以避免潜在的组织损伤。
    4. 打一个直径约4厘米的环(直径可根据动物与力传感器之间的距离进行调整)。
      注意:确保缝线和舌头保持湿润,以利于插入并避免对组织造成不必要的损伤。

2. 实验设置

大鼠脑部手术方法;电极插入、神经刺激实验、详细设置。
图2:动物的定位与固定。
(A) 小鼠被放置在实验平台上。通过施加垂直张力(绿色箭头)固定下颌并保持口腔张开。缝合线环连接至力传感器(白色箭头)。(B) 连接电极。(C) 每个安装在显微操作器上的电极均稳定地连接至神经。插图显示钩状电极的末端结构。(D) 使用游标卡尺测量舌头的最佳长度,从舌骨水平处的附着点至舌尖。本图中,电极为清晰显示解剖结构已被移除。请点击此处查看该图的放大版本。

注意:将动物仰卧于仪器的加热托盘上,并采取以下固定措施,以避免实验过程中动物移动。

  1. 使用一根直接连接到加热平台的塑料涂层金属扎带,将大鼠的鼻部固定在托盘上(图2A,2B)。
  2. 通过施加垂直张力保持大鼠口腔张开(使用一个三向转环连接9 kg测试单丝线,并用相机支架固定)(图2A - 绿色箭头)。
    注意:稳定大鼠的另一种方法是使用啮齿类动物开口器或其定制改装装置。必须保持口腔持续张开且稳定,以避免颈部移动,从而影响测量质量。
  3. 将缝合环连接至力传感器(图2A - 白色箭头)。
  4. 使用手术胶带固定大鼠的四肢和腹部,以限制在刺激过程中的运动。
  5. 将两个刺激用钩状双极电极放置在已解剖的舌下神经上,位置位于压伤部位近端(图2C)。
    1. 使用自行制作的刺激双极电极,该电极由一对外科级不锈钢29号针电极组成,通过塑料支撑物将其固定在一起,间距为2 mm(此处我们使用了用胶带绑在一起的两支1 mL移液器)。
    2. 将针电极的尖端弯成钩状,钩的尺寸应足够小,以便与神经形成稳定接触(直径约1 mm)(图2C - 插图)。
    3. 将每个电极的两根导线连接至可堆叠的双接线柱(香蕉插头转BNC插头),然后通过BNC分路器连接至原位肌肉测试系统(in situ Muscle Test System)的刺激模块(表3)。
      注意:确保动物状态稳定,颈部和舌头与力传感器杠杆对齐。持续监测呼吸频率,并确保固定装置不影响呼吸。

3. 最佳长度(L0)与最大等长收缩力的测定

  1. 逐渐调整舌头的长度,并施加等长单收缩刺激,直至获得最大收缩力。
    1. 将 L0 定义为等长单收缩力(表 1)达到最大值时的长度,并记录该长度用于后续力测量值的标准化,因为该长度因动物个体而异。使用游标卡尺测量从舌骨水平处的附着点到舌尖的舌头长度(图 2D)。
      注意:电极的正确放置至关重要,以确保与神经之间的最佳接触。在分别刺激两条神经中的一条或同时刺激两条神经时,理想的位置应产生相似且具有叠加效应的力。
  2. 实验开始前,将两个电极连接至刺激器,并施加一次测试性强直刺激(表 1)。在此收缩过程中,监测动物以确保其体位稳定,并检查是否存在颈部肌肉的非预期可见收缩。
  3. 通过施加一次单收缩,20 秒后再施加一次强直刺激,来测量等长收缩力。每轮刺激循环包含一次单收缩和一次强直刺激,共重复 3 次,每次刺激循环之间间隔 4 分钟以恢复,并记录最大单收缩力和最大强直收缩力。
  4. 在每次收缩之间滴加少量 PBS,始终保持舌头湿润。
    注意:若出现颈部肌肉收缩,应仔细调整电极位置,使其不接触任何周围肌肉组织;必要时,可对与电极接触的组织进行电灼处理。

4. 黏弹性性质测定(利萨茹曲线)

  1. 在等长力测定后,让舌头休息 3 - 5 分钟。从 L 开始绘制利萨如曲线0因此,动物和力传感器的位置绝不能改变。
  2. 不刺激舌下神经,施加被动拉伸循环(表 2)随着位移(d)的增加 即 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50% 的 L0 (更高的振幅可能需要使用双模式控制器,其行程值需超过305C-LR型号的规格)。例如,40% L的振幅0 将导致舌头从+20%L处发生变形0 至 -20% L0.
    1. 使用固定的2 Hz正弦频率,每个周期内重复10次,每个周期总持续时间为5秒。过去曾对膈肌等组织采用过改变正弦频率的方法。24 并可被采纳以修改实验方案。
    2. 每次循环之间间隔30秒,并确保整个过程中舌头保持湿润。
      注意:操作过程中需保持舌头湿润,可添加数滴 PBS。在拉伸过程中,尤其是位移达到 40% 或更高时,应确保固定下颌的夹具稳定不动。
  3. 实验结束后,动物仍处于深度外科麻醉状态时,立即根据批准的IACUC动物实验方案实施安乐死。解剖舌组织以进行后续处理(即 冰冻切片或用于生化分析的储存。

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结果

肌肉收缩曲线图与三维图,显示强直收缩实验中的力-位移相关性
图3:代表性结果。
(A) 成功记录的肌肉抽搐力和强直收缩力曲线示例。相应的刺激信号以红色曲线表示。 (B) 由于次最大收缩(蓝色迹线)及颈部肌肉的间接刺激,导致舌肌强直收缩失败的示例。上述两种情况均可通过重新放置刺激电极,或避免电极末端与周围肌肉组织接触而得到改善。 (C) L 的正弦波位移示例0 (L 的 25%)0用于测定舌头的黏弹性特性。平均伸长力(蓝色方块)和缩短力(绿色方块)可用于计算峰-峰值力。24红色方框表示用于分析的范围...

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讨论

舌部代谢和/或成分的变化,例如肥胖导致的舌脂肪浸润,预计会引起本方案所评估参数的可量化改变。量化舌肌力量具有重要意义,因为伸舌与缩舌活动之间的失衡或整体舌肌力量减弱可能导致上气道闭塞15。旨在增强舌肌力量的锻炼技术已在大鼠中成功应用25,26,也在人类中得到应用27,28,29,并有效减轻了睡眠呼吸暂停的严重程度。此外,舌下神经刺激现已成为阻塞性睡眠呼吸暂停的一种外科治疗方法22,23,30。

本实验方案旨在指导用户分析舌肌的力学和...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院两项基金的资助:HL089447(“肥胖与阻塞性睡眠呼吸暂停:舌脂肪与代谢功能的重要作用研究”)和 HL094307(“肥胖与舌脂肪之间关系的研究”)

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
加热手术托盘(SurgiSuite)Kent ScientificSurgiSuite-LG包含加热平台
LED照明与放大装置套件Kent ScientificSURGI-5003
RC2 啮齿类动物电路控制器VetEquip922100
异氟烷Butler Schein 动物健康供应公司29405
酒精消毒棉Webcol6818
棉签MediChoiceWOD1002
毛发修剪器Conair
脱毛膏Nair
医用胶带Transpore3M
D-PBSCorning21-030-CM
手术剪World Precision Instruments503717-12
止血钳Merit97-458可使用任何组织钳代替
微解剖镊,弯头,带齿,10.2 cm,不锈钢World Precision Instruments504479
打结镊Fine Science Tools18025-10
钝头微钩Fine Science Tools10062-12
微型止血夹Fine Science Tools12075-14
热灼器WPI501292一次性灼器成本较低,可供选择
静脉用14号×3.25"套管BDB-D382268H用于气管插管
编织型不可吸收丝线,4-0规格Harvard ApparatusSP104用于固定气管套管
编织型不可吸收丝线,5/0规格Surgik LC, USAESILRC15387550用于缝合舌头
塑料包被金属扎带(或电线)用于将大鼠鼻部固定在平台上
相机支架
三向旋转接头及Trilene 9 Kg张力单丝线Berkley用于固定下颌并保持口腔张开
带角度调节功能的相机支架用于支撑三向旋转接头并保持口腔张开
in situ 肌肉测试系统Aurora Scientific809C该系统专为小鼠设计,通过延长平台进行改装;也可使用专用于大鼠的806D系统
双模式肌肉杠杆(力传感器)Aurora Scientific305C-LR309C比305C-LR具有更高的位移能力。更多信息和规格链接:http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/
针状电极(外科级不锈钢,29号规格)AD InstrumentsMLA1204推荐在小鼠中使用300C型号
磁力支架World Precision InstrumentsM10用于制作双极刺激钩状电极
Kite手动显微操作器World Precision InstrumentsKITE-R 和 KITE-L需配合钢制底板使用
可堆叠双接线柱,带香蕉插孔×BNC插孔McMaster Carr6704K13
碳纤维复合材料数显卡尺VWR36934-152

参考文献

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