应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑片中的神经元

摘要

本方案描述了如何使用近期开发的用于标准体外电生理学设备的系统，开展自动图像引导的膜片钳实验。

摘要

全细胞膜片钳是测量单个细胞电学特性的金标准方法。然而，该方法 体外 由于操作复杂且高度依赖用户操作与控制，膜片钳技术仍是一项具有挑战性且通量较低的技术。本文展示了一种用于图像引导的自动膜片钳系统 体外 急性脑片中的全细胞膜片钳实验。我们的系统采用基于计算机视觉的算法，用于检测荧光标记的细胞，并通过显微操作器和移液管内压控制，实现对目标细胞的全自动膜片钳操作。整个过程高度自动化，几乎无需人工干预。实验中的实时信息，包括电学阻抗和移液管内压，均以电子方式记录，便于后续分析以及针对不同细胞类型的优化。尽管本系统以急性脑片记录为描述背景，但也可应用于解离神经元、器官型脑片培养以及其他非神经元细胞类型的自动图像引导膜片钳实验。

引言

膜片钳技术最初由 Neher 和 Sakmann 在 20 世纪 70 年代开发，用于研究可兴奋膜的离子通道¹自那时以来，膜片钳技术已被应用于细胞、突触和环路水平上多种不同研究领域的研究——两者均 体外 和 体内—在多种不同细胞类型中，包括神经元、心肌细胞、非洲爪蟾卵母细胞以及人工脂质体²该过程包括准确识别和定位目标细胞，通过精细的显微操作器控制将膜片电极移至细胞附近，在适当时机对电极施加正压和负压以形成紧密的千兆欧姆封接（gigaseal），并进一步破膜以建立全细胞记录构型。膜片钳技术通常以手动方式进行，需要经过长期训练才能掌握。即使对于经验丰富的研究人员，其实验成功率仍然相对较低。近年来，已有多种尝试致力于实现膜片钳实验的自动化。目前发展出两种主要的自动化策略：一是在标准膜片钳设备基础上进行改进，实现对封接过程的自动控制；二是从零开始设计全新的设备与技术。前一种策略可适配现有硬件，适用于多种膜片钳应用，包括 体内 盲法膜片钳^3,4,5, 体外 急性脑片、器官型脑片培养及离体培养神经元的膜片钳记录⁶它能够通过同时使用多个显微操作器来....

方案

1. 系统设置

1. 构建压力控制单元。
   1. 根据电路图组装压力控制单元（图1）。根据电路原理图制造的印刷电路板（PCB）上焊接必要的部件（图1b）。使用标准电阻、发光二极管（LED）、金属氧化物半导体场效应晶体管（MOSFET）、电容器和连接器（参见 材料表）。将电磁阀焊接到PCB上。使用电线将气泵和气压传感器连接到PCB。
      注：在备齐所有必要部件的情况下，构建压力控制单元大约需要 2 h。
2. 连接辅助数据采集（DAQ）板卡。
   1. 将印刷电路板的数据输出端连接至数据采集板，按照 表1.
      注意：数据采集板（DAQ板）将处于运行状态 "单端模式。" 端口图示可在用户手册中找到（参见 材料表).
   2. 连接 "AIn Pr S" 连接至其中一个模拟输入（AI）通道 "R-Gr" 连接到次级数据采集板的模拟地之一。
   3. 将放大器的主输出端连接至次级数据采集板的一个AI通道，将接地端连接至该板的模拟地。
      注意：可使用标准BNC电缆连接放大器的主输出端。
   4. 剥去另一端的绝缘....

结果

我们的系统已测试用于急性脑切片、小鼠诱导性多能干细胞（iPSCs）分化而来的神经元以及人工表达特定通道的HEK 293细胞的膜片钳记录。图3展示了一项使用Thy1-ChR2-YFP转基因小鼠（B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/EYFP)18Gfng/J）的实验，该小鼠的视觉皮层第5层锥体神经元被荧光标记。目标细胞是自动识别出的绿色荧光阳性细胞之一（图3b）。图3a为记录到的神经元的微分干涉差（DIC）图像。全细胞构型通过自动膜片钳方案的步骤2.5至2.6建立，并通过阶跃电流注入诱发的动作电位进行验证（图3c）。

为了演示“命令序列”（Command Sequence）功能，我们在对脑片细胞进行膜片钳记录的同时，使.......

讨论

此处，我们介绍一种用于自动图像引导的膜片钳记录方法 体外该过程的关键步骤总结如下。首先，利用显微镜获取的一系列图像，通过计算机视觉技术自动识别移液管尖端。然后利用该信息计算显微镜坐标系与操纵器坐标系之间的坐标变换函数。通过计算机视觉自动检测荧光标记的细胞并确定其坐标。上述步骤结合移液管定位和自动封接算法，使用开源的 Python 编程语言以及 PyQT 和 OpenCV 库实现集成。

与现有方法相比 体外 膜片钳技术，该系统在多个方面实现了显著改进。它最大限度地减少了人为干预。该系统自动化了膜片钳实验中的大部分步骤，从而大幅降低了对人工操作的需求。部分尚需手动完成的步骤，例如在低倍与高倍显微镜物镜之间切换，可通过增加电动化硬件实现自动化。

膜片钳技术提高了通量。使用该系统进行的膜片钳实验获得了更高的成功率和更短的单次实验时间，从而显著提升了整体通量。用于荧光细胞检测和移液管尖端检测的计算机视觉算法非常稳健，错误率极低。移液管尖端检测的平均误差为1.6 µm，荧光细胞检测的假阳性率为4.9% .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCD相机	QImaging	Rolera Bolt
电生理记录系统	Scientifica	SliceScope Pro 2000	包含显微镜和操纵器。本文中演示的由制造商提供的操纵器控制软件为“Linlab2”。
放大器	Molecular Devices	MultiClamp 700B	计算机控制的微电极放大器
数模转换器	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED光源	Cool LED	pE-100	波长488 nm
数据采集板	Measurement Computing	USB1208-FS	辅助DAQ。 使用手册地址：http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
电磁阀	The Lee Co.	LHDA0531115H
气泵	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
气压传感器	Freescale semiconductor	MPXV7025G
脑片固定装置	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	RC-40灌流 chamber 配套的2.0 mm、19.7 mm平头脑片锚定套件
Python	Anaconda	版本 2.7（适用于Windows的32位）	https://www.continuum.io/downloads
螺丝端子	Sparkfun	PRT - 08084	3.5 mm间距螺丝端子（2针）
（2针）
N沟道MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP插座焊尾式 - 8针	Sparkfun	PRT-07937
LED - 基础红色 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - 基础绿色 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC桶形电源插座/连接器（SMD）	Sparkfun	PRT-12748
壁式交流适配器电源 - 12 V直流 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
导线 - 混合套装（实心芯，22 AWG）	Sparkfun	PRT-11367
带锁三通阀（公头x母头x母头）	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 柔性管路	Fisher scientific	14-171-129	外径：1/8 英寸 内径：1/16 英寸
BNC公头转BNC公头同轴电缆	Belkin Components	F3K101-06-E
560 欧姆电阻（5%容差）	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II