从交联骨骼肌制备高质量核的基于过滤的方法进行染色质免疫沉淀

摘要

我们提出了基于过滤的方案，以将高质量的细胞核与交联的小鼠骨骼肌分离，其中我们消除了超离心的需要，使其易于应用。我们显示从核制备的染色质适用于染色质免疫沉淀和可能的染色质免疫沉淀测序研究。

摘要

染色质免疫沉淀（ChIP）是确定蛋白质结合染色质DNA的有效方法。然而，富含纤维的骨骼肌由于技术上难以隔离高质量的细胞核而且对肌原纤维的污染最小，因此一直是ChIP的挑战。以前的方案尝试在交联之前纯化细胞核，这导致在延长的细胞核制备过程中DNA-蛋白质相互作用发生改变的风险。在目前的方案中，我们首先交联从小鼠收集的骨骼肌组织，并将组织切碎并超声处理。由于我们发现超速离心不能使用交联肌肉组织将原核与肌原纤维分开，我们设计了一个顺序的过滤程序，以获得没有显着肌原纤维污染的高质量细胞核。我们随后使用超声波仪制备了染色质，并且使用抗BMAL1抗体的ChIP测定显示强大的昼夜节律结合目的基因启动子的BMAL1模式。该过滤方案构成了将高质量细胞核与交联骨骼肌组织隔离的一种易于应用的方法，允许对昼夜节律和其他时间敏感性研究进行一致的样品处理。结合下一代测序（NGS），我们的方法可以部署用于骨骼肌功能的各种机械和基因组研究。

引言

骨骼肌在生理和行为中起重要作用。多核肌纤维由肌原纤维组成，其中肌动蛋白和肌球蛋白形成称为sarcomeres的功能单位以产生收缩力。骨骼肌也是身体中最大的代谢器官，占餐后葡萄糖摄入量的80％以上，调节胰岛素反应和代谢体内平衡^1,2 。肌肉生理和代谢受到昼夜节律钟的限制，内在的生物计时器3,4,5,6。例如， Bmal1的骨骼肌特异性缺失，核心昼夜节律钟成分之一，导致骨骼肌中胰岛素抵抗和葡萄糖摄取减少，发现动物发生2型糖尿病⁷ 。一世此外，骨骼肌也越来越被认为是内分泌器官⁸ ，分泌肌动蛋白以调节全身代谢和生理学。机械研究需要完全了解骨骼肌中的这些调节功能。

ChIP是描述DNA结合蛋白启动子募集的有力方法。最初开发了ChIP以鉴定染色质DNA ^9,10上的核小体组织。据报道，使用甲醛，硫酸二甲酯或紫外线照射（UV） ^11,12来交联蛋白质和染色质DNA的各种方法。甲醛交联是最常用的，保存染色质结构和DNA-蛋白相互作用^9,13,14 。交联色谱通过超声处理切片并用针对感兴趣的特定DNA结合蛋白^15,16的抗体进行免疫沉淀。近年来....

方案

动物护理在机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南下进行，并且程序是根据得克萨斯州休斯敦大学健康科学中心批准的动物方案进行的。

从交联骨骼肌中分离核

1. 称重和切碎后肢骨骼肌，从大约20周龄的C57BL / 6雄性小鼠分离，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，如先前详细描述的^22所述 。
   注意:我们通常从一只小鼠获得1.0 - 1.5 g骨骼肌。
   1. 将切碎的骨骼肌组织放入含有10mL PBS的50mL锥形管中。
2. 在4℃下以300xg离心5分钟。
3. 通过抽吸小心清除PBS上清液。
4. 通过使用具有1,2,3和4mL水的参考管估计每个50mL管中的颗粒体积。
5. 添加7卷冰冷的1％甲醛在PBS中，并使用探针组织匀浆器在冰上匀化样品（ 参见表材料 ）。
   注意:可选:均质程序可在冷藏室进行。
6. 通过在室温下孵育10分钟将样品交联。
7. 通过加入1M甘氨酸使终浓度为0.125M的交联反应骤冷，并在室温下孵育5分钟。
8. 在4℃下将样品以3,000xg离心5分钟。通过抽吸去除上清液。
9. 用含有新鲜蛋白酶抑制剂（0.2mM苯甲基磺酰氟（PMSF））的10mL冰冷碱性缓冲液（pH7.3的10mM HEPES-KOH....

结果

这里我们在组织收集后立即进行甲醛交联，以保持实时的DNA-蛋白质相互作用。然而，我们发现通常用于细胞核分离的蔗糖或胶体梯度^23,24在分离细胞核和肌原纤维方面无效（数据未显示）。原因可能是交联赋予核和肌原纤维相似的重力。因此，我们开发了一个串联过滤方法，以有效地从核部分去除大的肌原纤维和其他碎屑。经过100μm过滤后，仍有较大的组织碎屑和肌原纤维（ 图 1A ）。相比之下，在顺序过滤结束时，大部分大的组织碎片，完整的细胞和大的肌原纤维被成功地去除（ 图1B ）。

27或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） ^28的超声处理，但在我们的经验中，它干扰了骨骼肌细胞核的超声处理，并导致广泛的涂片无效超声处理使用目前的方案，.......

讨论

在这里，我们描述了一种使用交联骨骼肌组织分离高质量细胞核的可靠方法。进行顺序过滤以有效地将细胞核与碎片分离，来自碟形换能器的超声波能量剪切染色质进行ChIP分析。结果显示BMAL1与靶启动子的昼夜节律时间特异性结合。

当交联发生时，ChIP可用于捕获基因组DNA上的实时蛋白质占用。为了利用这种潜力，我们旨在开发一种方法，允许在组织解剖时交叉骨骼肌，并简化细胞核分离而不进行梯度超速离心。由于与软组织如肝脏相比，纤维丰富的骨骼肌的均质化困难，我们在冰冷的PBS中切碎肌肉组织，然后将样品在甲醛缓冲液中匀化。淬火后，组织悬浮液离心并用冰冷的碱缓冲液冲洗，以清除任何剩余的甲醛。通过Dounce匀浆释放细胞核，依次过滤匀浆，逐渐去除细胞碎片和肌原纤维。我们设计了一系列过滤以最大限度地减少过滤器堵塞，这可能不利地影响产量。当顺序过滤完成时，只剩下非常短的肌原纤维。

超声处理和ChIP程序从以前的报告^12中进行了改进，包括超声处理时间和SDS缓冲液量。碟形超声波清洗机允许在冷水浴中将玻璃小瓶中的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料
甲醛溶液	Sigma Aldrich	F8775
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-5
台盼蓝溶液 （0.4%）	Fisher Scientific	15250061
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
蛋白酶 K	Sigma Aldrich	3115887001
鸡抗 BMAL1 抗体			在鸡 （Cocalico Biologicals） 中针对抗原 aa 318 - 579 产生，并使用相同的抗原亲和纯化 IgY。
鸡 IgY 沉淀树脂	金斯瑞	L00405
设备
KINEMATICA Polytron PT2100 台式均质器	Fisher Scientific	08-451-178
15 mL Dounce 组织研磨机	Whearton	357544
Falcon 细胞过滤器 100 µm	Fisher Scientific	08-771-19
Falcon 细胞过滤器 70 µm	Fisher Scientific	08-771-1
Falcon 细胞过滤器 40 µm	Fisher Scientific	08-771-2
多过滤器 30 µm	PluriSelect	43-50030-03
pluriStrainer 20 µm	PluriSelect	43-50020-03
pluriStrainer 10 µm	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 聚焦超声仪	Covaris	型号 S2
Labquake	Thermo Scientific	C415110
CCD 显微镜相机	Leica Microsystems	DFC3000 G
试剂盒
DNA 提取试剂盒	Thermo Scientific	K0691
Buffers
所有缓冲液组分均在方案中进行了说明。每个组件均购自 Sigma Aldrich