我们提出了一种基于过滤的实验方案，用于从交联的小鼠骨骼肌中分离高质量的细胞核，该方法无需超速离心，因而更易于应用。我们证明，由此获得的细胞核所提取的染色质适用于染色质免疫沉淀实验，并可能适用于染色质免疫沉淀测序研究。
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摘要
摘要
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于确定蛋白质与染色质DNA结合的强大方法。然而，由于富含纤维的骨骼肌在分离高质量细胞核时难以避免肌原纤维的污染，因此在ChIP应用中一直存在技术挑战。以往的实验方案尝试在交联前纯化细胞核，但这一过程耗时较长，可能导致DNA-蛋白质相互作用发生改变。在本方案中，我们首先对从小鼠获取的骨骼肌组织进行交联处理，随后将组织切碎并进行超声处理。由于我们发现使用交联后的肌肉组织时，超速离心法无法有效分离细胞核与肌原纤维，因此设计了一种连续过滤步骤，以获得几乎不含肌原纤维污染的高质量细胞核。接着，我们利用超声破碎仪制备染色质，并使用抗BMAL1抗体进行ChIP实验，结果清晰地揭示了BMAL1在靶基因启动子区域呈现显著的昼夜节律性结合模式。该过滤方案提供了一种简便可行的方法，可用于从交联的骨骼肌组织中分离高质量细胞核，从而实现昼夜节律及其他时间敏感型研究中样本处理的一致性。结合下一代测序技术（NGS），本方法可广泛应用于针对骨骼肌功能的多种机制性与基因组学研究。
引言
骨骼肌在生理和行为中发挥着重要作用。多核的肌纤维由肌原纤维组成，其中肌动蛋白和肌球蛋白形成称为肌节的功能单位，以产生收缩力。骨骼肌也是人体最大的代谢器官，占餐后葡萄糖摄取量的>80%，并调节胰岛素反应和代谢稳态1,2。肌肉的生理功能和代谢过程受到生物节律钟的紧密调控，生物节律钟是一种内在的生物计时系统3,4,5,6。例如，特异性敲除骨骼肌中的核心生物节律钟组分之一Bmal1基因，会导致骨骼肌胰岛素抵抗和葡萄糖摄取能力下降，动物模型最终发展为2型糖尿病7。此外，骨骼肌也日益被认为是一种内分泌器官8，可通过分泌肌因子来调节全身的代谢和生理功能。要全面理解骨骼肌中的这些调控功能，仍需开展深入的机制性研究。
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的方法，可用于阐明DNA结合蛋白在启动子区域的招募情况。ChIP最初被开发用于鉴定染色质DNA上的核小体排列结构9,10。此后，已有多种方法被报道用于通过甲醛、二甲基硫酸酯或紫外线照射（UV）将蛋白质与染色质DNA交联11,12。其中，甲醛交联应用最为广泛，可有效保持染色质结构及DNA-蛋白质相互作用9,13,14。交联后的染色质通过超声处理被打碎，并使用针对特定DNA结合蛋白的抗体进行免疫沉淀15,16。近年来，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术——即ChIP与高通量测序（NGS）相结合的方法——已被开发用于研究全基因组范围内的转录因子结合情况17，并在某些情况下用于监测时间序列中的动态变化18,19,20。例如，昼夜节律相关的ChIP-seq研究揭示了昼夜节律钟组分和组蛋白标记在基因组上高度有序的结合序列，从而驱动基因表达在约24小时的昼夜节律周期中实现时间上的精确调控18。
大多数现有的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案均针对软组织设计例如 肝脏，大脑 等等。），且针对骨骼肌等硬组织发表的方法极少。由于骨骼肌富含纤维，因此在技术上难以实现充分匀浆并分离出高质量的细胞核21，尤其是对于需要交联的ChIP实验。在最近的一项肌肉组织ChIP研究中22，卫星细胞从肌纤维中分离，并通过长时间的组织消化过程分别从这两种细胞类型中制备细胞核。整个过程耗时约三小时，之后才对分离的细胞核进行甲醛交联。尽管该方法避免了对肌纤维进行交联（因为交联会使肌肉组织更难有效匀浆），并能够获得高质量的细胞核，但从组织取样到细胞核交联之间存在显著的时间延迟，可能导致DNA-蛋白质相互作用发生改变。相比之下，大多数研究通常在实验处理或组织采集后立即进行交联，以保持DNA-蛋白质结合状态的实时性12另一个在交联前进行细胞核分离的缺点是，它排除了对时间敏感的应用，例如通常以3-4小时间隔采集的昼夜节律样本。由于未交联的细胞核在解剖后必须立即进行分离，而交联后的样本则可在整个时间过程结束后统一处理，从而确保更高的实验一致性。
已有其他关于从未交联的骨骼肌中分离细胞核的方案被报道。两项研究描述了使用梯度超速离心法将细胞核与残留的肌原纤维及细胞碎片分离的方法23,24。尽管蔗糖或胶体梯度超速离心法对未交联的肌肉组织有效，但我们的实验表明，在交联后，梯度超速离心法无法在梯度中将细胞核与细胞碎片有效分离。
因此，我们开发了一种利用交联的小鼠骨骼肌组织分离高质量细胞核的方案。我们设计了一种连续过滤方法，以有效将细胞核与碎片分离，而非采用梯度超速离心法。经过超声处理后，染色质样品成功应用于ChIP研究，结果显示BMAL1蛋白结合到靶启动子上呈现昼夜节律模式。我们的方法可广泛适用于肌肉组织的各种机制研究。
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方案
动物护理工作遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行，实验操作均依照休斯顿德克萨斯大学健康科学中心批准的动物实验方案开展。
1. 交联骨骼肌中细胞核的分离
- 称取并切碎从约20周龄C57BL/6雄性小鼠分离的后肢骨骼肌组织，置于冰上预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，具体操作如前所述22。
注意：通常每只小鼠可获得1.0–1.5 g骨骼肌组织。- 将切碎的骨骼肌组织放入含有10 mL PBS的50 mL锥形管中，置于冰上。
- 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
- 小心吸弃上清液。
- 使用分别装有1、2、3和4 mL水的对照管，估测每个50 mL管中沉淀的体积。
- 加入7倍体积的冰上预冷的含1%甲醛的PBS溶液，并使用探头式组织匀浆器在冰上进行匀浆（见材料表）。
可选：匀浆过程可在低温室中进行。 - 在室温下孵育10分钟，完成交联反应。
- 加入1 M甘氨酸至终浓度为0.125 M，以终止交联反应，并在室温下孵育5分钟。
- 在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，吸弃上清液。
- 用10 mL冰上预冷的基础缓冲液（10 mM HEPES-KOH，pH 7.3，10 mM EDTA，10 mM KCl，5 mM MgCl2，0.5 mM DTT）洗涤，其中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和10 µg/mL亮抑蛋白酶肽）。在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，小心吸弃上清液。
- 将沉淀重悬于6 mL裂解缓冲液（10 mM HEPES-KOH，pH 7.3，10 mM EDTA，10 mM KCl，5 mM MgCl2，0.5 mM DTT，1% Triton X-100）中，其中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（0.2 mM PMSF和10 µg/mL亮抑蛋白酶肽）。
- 将样品转移至预冷的15 mL Dounce匀浆器中，在冰上孵育10分钟。在冰上使用松散研杵缓慢匀浆15次，再用紧密研杵匀浆15次，以释放细胞核。
- 将匀浆液（6 mL）通过细胞筛（孔径：100 µm）过滤，并用4 mL裂解缓冲液冲洗。在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟。将沉淀重悬于5 mL冰上预冷的基础缓冲液中，并用紧密研杵匀浆10次，进一步释放细胞核。
- 取20 µL样品用于分光光度计测定DNA浓度（OD260/OD280），必要时用台盼蓝染色进行显微镜观察（见下文）（图1A）。
- 将悬液通过细胞筛（孔径：70 µm）过滤，用2 mL基础缓冲液冲洗管和滤膜，再次过滤（操作同上）。
- 按照步骤1.13的方法，依次使用孔径逐渐减小的细胞筛（40 µm、30 µm、20 µm和10 µm）重复过滤。
注意：在步骤1.12–1.14中，共使用了6种不同孔径的细胞筛。 - 在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL基础缓冲液中。
- 按上述方法测定DNA浓度。
注意：从一只动物的双侧后肢组织合并处理后，可获得约200 µg核DNA。可选：保留20 µL样品，用台盼蓝染色（储存浓度0.4%，1:5稀释）进行显微镜观察；细胞核将被染成蓝色（图1B）。 - 在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟，弃去上清液。将沉淀在-80 °C保存。
2. 超声处理
- 在500 µL SDS裂解缓冲液中解冻样品，并用移液器轻轻重悬。
- 将核DNA悬液转移至冰上的玻璃小瓶中。
- 使用碟形换能器产生的聚焦超声波能量进行超声处理。设备详细信息见材料表。使用以下设置：每脉冲循环数：200；强度：5；占空比：20；温度：4 - 6 °C；开启/关闭时间：30秒。
注意：超声处理效果评估示例见图2。 - 将超声处理后的染色质转移至1.5 mL离心管中。在12,000 × g离心15分钟，将上清液转移至新管中。取50 µL超声处理后的样品（约每肌肉样品7 - 10 µg）放入新的1.5 mL离心管中，在65 °C下反向交联过夜。其余样品于-80 °C保存。
3. 超声处理与定量评估
- 向保存的 50 µL 超声处理样品中加入 1.0 µL RNase A（500 U/mL RNase A：20,000 U/mL RNase T1），在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 加入 8 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL），在 55 °C 下孵育 30 分钟。
- 使用 DNA 提取试剂盒回收 DNA。
- 加入 5 倍体积的结合缓冲液，将混合物加入离心柱中，在 4,000 × g 条件下离心 10 分钟。
- 将穿流液重新加入同一离心柱中，再次离心。
- 用洗涤缓冲液洗涤两次，每次在 13,000 × g 条件下离心 1 分钟。
- 再次在 13,000 × g 条件下离心 1 分钟，以干燥离心柱。
- 加入 50 µL H2O，在 13,000 × g 条件下离心 1 分钟，洗脱 DNA。
- 将洗脱液重新加入同一离心柱中，再次离心。
- 使用分光光度计（OD260/OD280）定量 DNA 含量。将样品在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳，以评估超声处理产物的大小和量（1 µg）（图 2）。
注意：染色质的平均得率约为 20%。
4. 染色质免疫沉淀（ChIP）
- 将先前保存在 -80 °C 的染色质解冻，并分装至每管约 100 - 120 µg。用放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA 缓冲液）（20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM NaF，1 mM Na₃VO₄，1 mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC），0.1% 脱氧胆酸钠（w/v），1% Triton X-100）按 1:10 稀释。
- 若每组包含多个样本，将等量的染色质 DNA 混合，使最终总量约为每样本 100 - 120 µg。保留 10% 作为输入样本。
- 加入 40 µL（在 RIPA 缓冲液中为 50% v/v 悬浮液）经 BSA 预封闭（约 2 小时，4 °C）的 Protein A/G 琼脂糖（用于非鸡源抗体）或 IgY 磁珠（用于鸡源抗体），在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 3 小时。
- 以 1,000 × g 离心 10 分钟，小心将上清转移至新管中。
- 每约 25 - 100 µg 染色质 DNA 加入 1 µg 抗体。
- 在 4 °C 轻柔旋转过夜（约 15 rpm）。
- 加入 10 µL 经 BSA 预封闭（约 2 小时，4 °C）的 Protein A/G 琼脂糖（用于非鸡源抗体）或 IgY 磁珠（用于鸡源抗体），在 4 °C 冷室中旋转孵育 2 小时。
- 按以下步骤洗涤磁珠：用 1 mL RIPA 缓冲液洗涤 3 分钟，重复两次；用 1 mL 高盐缓冲液 （20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，500 mM NaCl，2 mM EDTA，1 mM PMSF，1% Triton X-100）洗涤 3 分钟，重复两次；用 1 mL LiCl 缓冲液 （20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，250 mM LiCl，2 mM EDTA，1 mM PMSF，1% 脱氧胆酸钠，0.5% NP40）洗涤 3 分钟，重复两次。
- 用 1 mL Tris-EDTA（TE）缓冲液 （10 mM Tris-HCl (pH 7.4)，1 mM EDTA）洗涤 3 分钟，一次。然后用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA 和 0.5% SDS）洗脱 DNA。
- 以 1,000 × g 离心 1 分钟，小心移除上清。
- 用 50 µL 洗脱缓冲液重悬磁珠。
- 在 65 °C 孵育 10 分钟。
- 以 12,000 × g 离心 5 分钟。
- 将上清转移至新管，再加入 50 µL 洗脱缓冲液，再次以 12,000 × g 离心 5 分钟。最终洗脱体积为 100 µL。
- 逆转交联并回收 DNA。
- 将洗脱的染色质在 65 °C 孵育过夜。
- 加入 1.0 µL RNase A，在 37 °C 孵育 30 分钟。
- 加入 8 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL），在 55 °C 孵育 30 分钟。
- 按照制造商说明书，使用 PCR 纯化试剂盒回收 DNA，洗脱体积为 50 µL。
- 按先前所述方法通过实时定量 PCR 分析结果25,26。
注：引物序列列于 图 3 图注 中。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示（图 3）。
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结果
我们在组织采集后立即进行甲醛交联，以保存实时的DNA-蛋白质相互作用。然而，我们发现蔗糖或胶体梯度（常用于细胞核分离23,24）在分离细胞核与肌原纤维方面效果不佳（数据未显示）。原因可能是交联使细胞核和肌原纤维具有相似的沉降重力。因此，我们开发了一种连续过滤方法，以有效去除细胞核组分中的大块肌原纤维及其他碎片。经过100 µm过滤后，仍存在大量组织碎片和肌原纤维（图1A）；相比之下，在完成连续过滤后，绝大多数大块组织碎片、完整细胞以及大块肌原纤维均被成功去除（图1B）。
这些细胞核用于碟状超声处理。将储存在 -80 °C 的细胞核重悬于 SDS 裂解缓...
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讨论
本文介绍了一种可靠的方法，利用交联的骨骼肌组织分离高质量的细胞核。通过连续过滤有效将细胞核与碎片分离，并利用碟形换能器产生的超声波声能对染色质进行剪切，以用于ChIP分析。结果表明，BMAL1在特定昼夜节律时间结合到靶基因启动子区域。
染色质免疫沉淀（ChIP）可用于在交联发生时捕获蛋白质在基因组DNA上的实时占据情况。为了充分利用这一潜力，我们旨在开发一种方法，能够在组织解剖的同时对骨骼肌进行交联，并在无需梯度超速离心的情况下简化细胞核的分离流程。由于富含纤维的骨骼肌组织相较于肝脏等软组织更难均质化，我们将肌肉组织在冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中切碎，随后在甲醛缓冲液中进行均质化处理。交联反应终止后，将组织悬液离心，并用冰冻的基础缓冲液洗涤，以去除残留的甲醛。通过Dounce匀浆器释放细胞核，匀浆液依次经过滤处理，逐步去除细胞碎片和肌原纤维。我们设计了这一系列过滤步骤，以最大程度减少滤器堵塞，避免影响细胞核得率。完成逐级过滤后，仅残留极短的肌原纤维片段。
超声处理和染色质免疫沉淀（ChIP）步骤参照先前的报道
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Karyn Esser、Nobuya Koike 和 Noheon Park 提供的有益建议。本工作部分由美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，项目号 R01GM114424）资助 S.-H.Y.，以及由罗伯特·A·韦尔奇基金会（AU-1731）和美国国立卫生研究院/国家衰老研究所（NIH/NIA，项目号 R01AG045828）资助 Z.C.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 甲醛溶液 | Sigma Aldrich | F8775 | |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| 蛋白酶K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| 鸡抗BMAL1抗体 | 以氨基酸318–579为抗原免疫鸡（Cocalico Biologicals）制备，IgY通过相同抗原亲和纯化获得。 | ||
| 鸡IgY沉淀树脂 | GenScript | L00405 | |
| 设备 | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 台式匀浆器 | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce 组织研磨器 | Wheaton | 357544 | |
| Falcon 细胞筛 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon 细胞筛 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon 细胞筛 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 聚焦式超声破碎仪 | Covaris | 型号 S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD 显微镜相机 | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| 试剂盒 | |||
| DNA提取试剂盒 | Thermo Scientific | K0691 | |
| 缓冲液 | |||
| 所有缓冲液组分均在实验方案中描述，各组分均购自Sigma Aldrich |
参考文献
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