我们提出了一种基于过滤的实验方案，用于从交联的小鼠骨骼肌中分离高质量的细胞核，该方法无需超速离心，因而更易于应用。我们证明，由此获得的细胞核所提取的染色质适用于染色质免疫沉淀实验，并可能适用于染色质免疫沉淀测序研究。
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摘要
摘要
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于确定蛋白质与染色质DNA结合的强大方法。然而，由于富含纤维的骨骼肌在分离高质量细胞核时难以避免肌原纤维的污染，因此在ChIP应用中一直存在技术挑战。以往的实验方案尝试在交联前纯化细胞核，但这一过程耗时较长，可能导致DNA-蛋白质相互作用发生改变。在本方案中，我们首先对从小鼠获取的骨骼肌组织进行交联处理，随后将组织切碎并进行超声处理。由于我们发现使用交联后的肌肉组织时，超速离心法无法有效分离细胞核与肌原纤维，因此设计了一种连续过滤步骤，以获得几乎不含肌原纤维污染的高质量细胞核。接着，我们利用超声破碎仪制备染色质，并使用抗BMAL1抗体进行ChIP实验，结果清晰地揭示了BMAL1在靶基因启动子区域呈现显著的昼夜节律性结合模式。该过滤方案提供了一种简便可行的方法，可用于从交联的骨骼肌组织中分离高质量细胞核，从而实现昼夜节律及其他时间敏感型研究中样本处理的一致性。结合下一代测序技术（NGS），本方法可广泛应用于针对骨骼肌功能的多种机制性与基因组学研究。
引言
骨骼肌在生理和行为中发挥着重要作用。多核的肌纤维由肌原纤维组成，其中肌动蛋白和肌球蛋白形成称为肌节的功能单位，以产生收缩力。骨骼肌也是人体最大的代谢器官，占餐后葡萄糖摄取量的>80%，并调节胰岛素反应和代谢稳态1,2。肌肉的生理功能和代谢过程受到生物节律钟的紧密调控，生物节律钟是一种内在的生物计时系统3,4,5,6。例如，特异性敲除骨骼肌中的核心生物节律钟组分之一Bmal1基因，会导致骨骼肌胰岛素抵抗和葡萄糖摄取能力下降，动物模型最终发展为2型糖尿病7。此外，骨骼肌也日益被认为是一种内分泌器官8，可通过分泌肌因子来调节全身的代谢和生理功能。要全面理解骨骼肌中的这些调控功能，仍需开展深入的机制性研究。
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的方法，可用于阐明DNA结合蛋白在启动子区域的招募情况。ChIP最初被开发用于鉴定染色质DNA上的核小体排列结构9
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方案
动物护理工作遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行，实验操作均依照休斯顿德克萨斯大学健康科学中心批准的动物实验方案开展。
1. 交联骨骼肌中细胞核的分离
- 称取并切碎从约20周龄C57BL/6雄性小鼠分离的后肢骨骼肌组织，置于冰上预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，具体操作如前所述22。
注意：通常每只小鼠可获得1.0–1.5 g骨骼肌组织。- 将切碎的骨骼肌组织放入含有10 mL PBS的50 mL锥形管中，置于冰上。
- 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。
- 小心吸弃上清液。
- 使用分别装有1、2、3和4 mL水的对照管，估测每个50 mL管中沉淀的体积。
- 加入7倍体积的冰上预冷的含1%甲醛的PBS溶液，并使用探头式组织匀浆器在冰上进行匀浆（见材料表）。
可选：匀浆过程可在低温室中进行。 - 在室温下孵育10分钟，完成交联反应。
- 加入1 M甘氨酸至终浓度为0.125 M，以终止交联反应，并在室温下孵育5分钟。
- 在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，吸弃上清液。
- 用10 mL冰上预冷的基础缓冲液（10 mM HEPES....
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结果
我们在组织采集后立即进行甲醛交联，以保存实时的DNA-蛋白质相互作用。然而，我们发现蔗糖或胶体梯度（常用于细胞核分离23,24）无法有效将细胞核与肌原纤维分离（数据未显示）。原因可能是交联使细胞核和肌原纤维具有相似的沉降重力。因此，我们开发了一种连续过滤方法，以有效去除细胞核组分中的大块肌原纤维及其他碎片。经过100 µm过滤后，仍存在大量组织碎片和肌原纤维（图1A）；相比之下，在完成连续过滤后，大部分大块组织碎片、完整细胞以及大块肌原纤维均被成功去除（图1B）。
这些细胞核用于碟状超声处理。将储存在 -80 °C 的细胞核重悬于 SDS 裂解缓冲液中.......
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讨论
本文介绍了一种可靠的方法，利用交联的骨骼肌组织分离高质量的细胞核。通过连续过滤有效将细胞核与碎片分离，并利用碟形换能器产生的超声波声能对染色质进行剪切，以用于ChIP分析。结果表明，BMAL1在特定昼夜节律时间结合到靶基因启动子区域。
染色质免疫沉淀（ChIP）可用于在交联发生时捕获蛋白质在基因组DNA上的实时占据情况。为了充分利用这一潜力，我们旨在开发一种方法，能够在组织解剖的同时对骨骼肌进行交联，并在无需梯度超速离心的情况下简化细胞核的分离流程。由于富含纤维的骨骼肌组织相较于肝脏等软组织更难均质化，我们将肌肉组织在冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中切碎，随后在甲醛缓冲液中进行均质化处理。交联反应终止后，将组织悬液离心，并用冰冻的基础缓冲液洗涤，以去除残留的甲醛。通过Dounce匀浆器释放细胞核，匀浆液依次经过滤处理，逐步去除细胞碎片和肌原纤维。我们设计了这一系列过滤步骤，以最大程度减少滤器堵塞，避免影响细胞核得率。完成逐级过滤后，仅残留极短的肌原纤维片段。
超声处理和染色质免疫沉淀（ChIP）步骤参照先前的报道
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Karyn Esser、Nobuya Koike 和 Noheon Park 提供的有益建议。本工作部分由美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，项目号 R01GM114424）资助 S.-H.Y.，以及由罗伯特·A·韦尔奇基金会（AU-1731）和美国国立卫生研究院/国家衰老研究所（NIH/NIA，项目号 R01AG045828）资助 Z.C.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 甲醛溶液 | Sigma Aldrich | F8775 | |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| 蛋白酶K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| 鸡抗BMAL1抗体 | 以氨基酸318–579为抗原免疫鸡（Cocalico Biologicals）制备，IgY通过相同抗原亲和纯化获得。 | ||
| 鸡IgY沉淀树脂 | GenScript | L00405 | |
| 设备 | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 台式匀浆器 | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce 组织研磨器 | Wheaton | 357544 | |
| Falcon 细胞筛 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon 细胞筛 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon 细胞筛 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 聚焦式超声破碎仪 | Covaris | 型号 S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD 显微镜相机 | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| 试剂盒 | |||
| DNA提取试剂盒 | Thermo Scientific | K0691 | |
| 缓冲液 | |||
| 所有缓冲液组分均在实验方案中描述，各组分均购自Sigma Aldrich |
参考文献
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R.
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重印与许可
