阿尔茨海默病与轻度认知障碍中定向功能连接的格兰杰因果分析应用

摘要

基于静息态功能磁共振成像结合格兰杰因果分析，我们研究了阿尔茨海默病（AD）患者、轻度认知障碍（MCI）患者以及健康对照组中后扣带皮层与全脑之间定向功能连接的改变。

摘要

默认模式网络（Default Mode Network, DMN）中功能连接受损可能参与阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）的进展过程。后扣带皮层（Posterior Cingulate Cortex, PCC）是监测AD进展的潜在影像学标志物。既往研究未重点关注PCC与DMN以外脑区节点之间的功能连接，而本研究旨在探索这些被忽视的功能连接。数据采集采用功能磁共振成像（functional Magnetic Resonance Imaging, fMRI）和格兰杰因果分析（Granger Causality Analysis, GCA）。fMRI为研究不同脑区之间的动态相互作用提供了一种无创方法。GCA是一种统计假设检验方法，用于判断一个时间序列是否有助于预测另一个时间序列。简而言之，其判断依据是通过比较 "在最后一刻已知所有信息的情况下，X 的概率分布" 以及 "除 Y 外已知所有信息的情况下，此时 X 的概率分布"，以确定Y与X之间是否存在因果关系。该定义基于完整的信息源和稳定的时序序列。此分析的主要步骤是利用X和Y建立回归方程，并通过假设检验推断因果关系。由于格兰杰因果分析（GCA）能够测量因果效应，我们采用该方法研究功能连接的各向异性，并探讨后扣带皮层（PCC）的枢纽功能。本研究共筛选116名受试者进行磁共振成像（MRI）扫描，对神经影像数据进行预处理后，使用GCA推导每个脑区节点的因果关系。最终结果表明，在轻度认知障碍（MCI）组与阿尔茨海默病（AD）组之间，无论从PCC到全脑，还是从全脑到PCC的有向连接，均存在显著差异。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统的退行性疾病，可通过组织病理学、电生理学和神经影像学进行诊断¹。与记忆相关的默认模式网络（DMN）是大脑区域间相互作用的重要系统，其功能异常是AD的典型特征^2,3。后扣带皮层（PCC）是静息状态下传统默认网络中的一个重要区域，在情景记忆、空间注意、自我评估及其他认知功能中发挥关键作用^4,5,6,7。此外，PCC可能作为监测AD进展的影像学标志物。Liao et al. 采用格兰杰因果分析（GCA）发现，PCC是一个具有多种细胞构筑特征和多重连接的脑区，在脑功能结构中起重要作用⁸。Zhong et al. 报道指出，PCC是DMN内大多数其他脑区信息交互的汇聚中心³。此外，Miao et al. 研究表明，在DMN的核心区域中，PCC与其他节点之间的因果效应关系最强⁹。综上所述，这些证据表明PCC的定向连接在AD研究中具有重要价值，且作为DMN中的关键区域，PCC仍需进一步深入研究。

既往研究局限于后扣带皮层（PCC）与默认模式网络（DMN）内其他脑区之间的连接性；然而，PCC与DMN以外脑区之间的定向功能连接变化，以及这些变化对阿尔茨海默病（AD）的影响，尚未得到探索¹⁰。本研究进一步在正常健康对照者、轻度认知障碍（MCI）患者和AD患者中，探讨了这一尚未被研究的定向功能连接。通过观察PCC与全脑各区域之间的定向连接，我们旨在阐明与AD进展相关的脑功能变化，从而为评估疾病严重程度建立一种新的客观依据。

功能连接是指脑区间相互作用的一种表现，可通过脑部血氧水平依赖性（BOLD）功能磁共振成像（fMRI）信号中的低频波动（LFFs）同步性来反映。因此，为了观察后扣带皮层（PCC）与其他脑区之间的功能连接，我们以PCC作为感兴趣区域（ROI），利用格兰杰因果分析（GCA）对PCC与全脑网络之间的功能连接进行了fMRI分析。该技术直接利用神经影像数据推导出各个节点之间的基本关系¹¹。近年来，GCA已被应用于脑电图（EEG）和fMRI研究中，以揭示脑区之间的因果效应¹²。这些研究均表明，GCA技术可能最适合用于检测大脑中各节点之间的因果关系。

方案

本研究经浙江省人民医院伦理委员会批准。所有纳入的受试者均签署了书面知情同意书。

1. 样本分类与筛选

1. 诊断并将116名患者分为阿尔茨海默病（AD）组和轻度认知障碍（MCI）组。
   注：采用2011年神经病学、交流障碍与中风研究所及阿尔茨海默病及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）的诊断标准，以及简易精神状态检查（MMSE）标准对MCI进行识别与分类，具体方法详见Yu et al.¹⁰
2. 选择健康对照组的受试者。
   注：对照组的年龄、性别和教育水平与MCI组和AD组患者相匹配。
3. 对所有受试者进行MMSE评估¹⁰。
4. 排除不符合纳入标准的受试者。所有受试者的排除标准见Yu et al.¹⁰
5. 使用磁共振成像（MRI）对受试者进行扫描；因头部运动导致数据不可用的受试者予以排除。
   注：最终，我们筛选出26名MCI患者、32名AD患者和58名健康对照者。

2. 神经影像的采集

1. 进入3.0 T MRI实验室前，请移除所有金属及磁性物品。
2. 在磁共振扫描床上安装MRI接收线圈。该接收线圈为8通道圆极化脑部相控阵线圈。
3. 指导受试者仰卧于床面上，头部朝前，身体长轴与床面长轴一致。将受试者头部置于线圈支架上，并确保眶耳线垂直于床面。
4. 告知受试者将上肢置于身体两侧，闭眼，扫描过程中尽量不思考特定内容，并尽可能减少移动。在受试者头部双侧颞区放置泡沫垫以限制头部运动，同时提供耳机以降低扫描仪噪声。
   注：泡沫垫尺寸为：长径 = 13 cm，短径 = 10 cm，最厚处 = 7 cm，最薄处 = 3 cm，平均厚度 = 5 cm。
5. 通过定位光调整头部位置，使矢状面定位光标位于面部正中线上，轴向定位光标与外眦平行。随后移动床面，使轴向定位光标位于眉弓处或其下方2 cm处。
6. 将头部移至磁体中心。进行功能性MRI脑部扫描，包括梯度回波平面成像（EPI-BOLD）和三维T1加权MPRAGE成像。
   注：采用以下参数：
   EPI-BOLD：TR/TE = 2,000/30 ms，层厚/层间距 = 3.2/0.8 mm，31层，矩阵 = 64 × 64，视野（FOV）= 220 × 220 mm，体素大小 = 3 × 3 × 4 mm，翻转角 = 90°，扫描时间484 s，共采集240幅图像。
   3D-T1-MPRAGE成像：TR/TE = 8.5/3.2 ms，翻转角 = 15°，视野 = 250 × 250 mm，矩阵 = 256 × 256，层数 = 176，层厚/间隙 = 1/0 mm，扫描时间353 s，共采集192幅图像。
7. 扫描结束后，确保受试者离开床面时的安全。

3. 数据预处理

注意：使用静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）数据处理软件包增强版（RESTplus）分析静息态脑功能的原始数据。

1. 在 MATLAB 中打开 RESTplus，左键点击 Pipeline。
2. 将相关文件导入 RESTplus。选择工作目录，然后选择起始的 EPI 和 T1 目录。
3. 将 DICOM 文件转换为 NIFTI 格式。在预处理中勾选 DICOM to NIFTI 选项，并勾选 EPI DICOM to NIFTI 和 T1 DICOM to NIFTI 参数。
4. 通过勾选 Remove first n time points 并将 n 参数设置为 10，去除前 10 个时间点。
5. 根据静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）参数设置切片时间。勾选 Slice timing 选项。根据研究的 rs-fMRI 参数设置切片数量，并输入切片采集顺序。
   注意：脑扫描中每一层数据的采集并非在同一时间点完成，因此需要校准至同一时间点。
6. 校正时间与头部运动。勾选 Realign 选项。
   注意：过度头部运动的排除标准为任意方向上的平移超过 >2.0 mm 或旋转超过 >2.0°。在 RESTplus 中该参数为默认设置（左键点击 'Realign' 选项即可）。
7. 使用 T1 图像统一分割法进行空间标准化，并将所有脑图像标准化至同一空间。勾选 Normalize 选项，并保留底部的默认参数。选择 Normalize by using T1 image unified segmentation 和 European 参数。
   注意：使用 3 × 3 × 3 mm 的体素对 rs-fMRI 图像进行重采样，RESTplus 中其他参数均为默认设置，只需左键点击 'Normalize by using T1 image unified segmentation' 选项即可。
8. 使用全宽半高（FWHM）为 6 mm 的各向同性高斯核进行空间平滑。勾选 Smooth 选项。
9. 通过勾选 Detrend 去除线性趋势。
10. 回归去除干扰协变量信号（白质、脑脊液、全局信号），以提高信噪比。勾选 Nuisance covariates regression 及以下参数：6 个头部运动参数、全局平均信号、白质信号 和 脑脊液信号。
    注意：此步骤中，默认将 'Polynomial trend' 设置为 1，并默认选择 '6 head motion parameters'、'Nuisance regressors (WM, CSF, Global)' 和 'add mean back' 选项。
11. 使用带通滤波保留 0.01 - 0.08 Hz 范围内的信号，去除高频生理噪声和低频漂移。勾选 Filter 选项。

4. 定向连通性分析

注意：在提取种子区域的平均 BOLD 信号强度后，对全脑每个体素的 BOLD 信号进行 GCA 分析。

1. 使用 REST 工具箱中的 REST-GCA 进行基于体素的格兰杰因果分析（GCA）。在后处理选项框中，勾选 GCA。
2. 将“order”参数默认设置为 1，并在输入中选择相应参数。
3. 定义感兴趣区域（ROI），并在后扣带回（PCC）中确定种子点。选择 Define ROI，然后选择球形 ROI（Spherical ROI）。点击 Next。根据已知数据设置种子 ROI 的中心坐标和半径，然后选择 OK。
   注意：参考先前的研究¹³，默认将默认模式网络（DMN）的 ROI 置于 PCC（中心坐标 x = 0, y = -53, z = 26，半径 = 6 mm）。
4. 点击 Run 和 OK 以运行程序。
5. 在相关文件数据处理完成后，查找名为 ZGCA 和 GCA 的文件夹。将 ZGCA 文件夹中的文件整理出来，并按 xx、xy、yx、yy 分类至四个子文件夹中。
   注意：后续主要使用 xy 和 yx 两个子文件夹。三组文件数据（'AD'、'MCI'、'NC'）均按照上述步骤 3.1–4.5 进行处理和分类。
6. 通过 MATLAB 打开 RESTplus，左键点击 Statistical Analysis，然后左键点击 REST Two-Sample T-Test。
7. 将输出结果命名为 T1xy，并设置输出目录。左键点击 Add Group Images，打开 AD Results 文件夹中的 xy 子文件夹以及 NC Results 文件夹中的 xy 子文件夹。
8. 在 Mask File 选项中，左键点击以打开 'mask' 文件夹中的 BrainMask_05_61*73*61 子文件。
9. 选择 Compute 以运行程序。
10. 将输出结果命名为 T2xy，并设置输出目录。左键点击 Add Group Images，打开 AD Results 文件夹中的 xy 子文件夹以及 MCI Results 文件夹中的 xy 子文件夹。重复步骤 4.8–4.9。
11. 将输出结果命名为 T3xy，并设置输出目录。左键点击 Add Group Images，打开 MCI Results 文件夹中的 xy 子文件夹以及 NC Results 文件夹中的 xy 子文件夹。重复步骤 4.8–4.9。
12. 将输出结果命名为 T1yx，并设置输出目录。左键点击 Add Group Images，打开 AD Results 文件夹中的 yx 子文件夹以及 NC Results 文件夹中的 yx 子文件夹。重复步骤 4.8–4.9。
13. 将输出结果命名为 T2yx，并设置输出目录。左键点击 Add Group Images，打开 AD Results 文件夹中的 yx 子文件夹以及 MCI Results 文件夹中的 yx 子文件夹。重复步骤 4.8–4.9。
14. 将输出结果命名为 T3yx，并设置输出目录。左键点击 Add Group Images，打开 MCI Results 文件夹中的 yx 子文件夹以及 NC Results 文件夹中的 yx 子文件夹。重复步骤 4.8–4.9。
15. 最终，按照步骤 4.6–4.14 获得六个结果文件，左键点击 RESTplus 中的 viewer 查看结果。在 Underlay 中导入名为 ch2 的模板。
16. 在输出目录中找到这六个结果文件，依次填入 Overlay，生成最终的结果图，六个结果文件分别对应六幅图像。
17. 使用统计产品与服务解决方案（SPSS）处理上一步获得的数据。
    1. 连续变量以均值和标准差（SD）表示。
    2. 分类变量以数量和百分比表示，并采用卡方检验。
       注意：所有 p 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

人口统计学信息

表1列出了受试者的基本特征。所有受试者的教育程度均在初中及以上。三组之间在年龄、性别和教育程度方面相似（P >0.05），而MMSE评分差异具有显著性（p <0.01）。

定向脑功能连接

首先确定了全脑中的活跃节点。利用GCA技术，分析了阿尔茨海默病（AD）、轻度认知障碍（MCI）和对照组中从后扣带回皮层（PCC）到全脑以及从全脑到PCC的定向功能连接（图1，图2；

讨论

本报告介绍了一种用于比较阿尔茨海默病（AD）、轻度认知障碍（MCI）和对照组之间从后扣带回皮层（PCC）到全脑以及从全脑到PCC的定向功能连接性的方法。此外，该流程中的一个关键步骤是在实验前对样本进行分类和筛选。因此，分类与筛选标准至关重要，因为若标准有误，将可能影响结果的准确性。如本方案所述，我们采用了2011年NINCDS-ADRDA诊断标准以及简易精神状态检查（MMSE）作为MCI识别与分类的标准；我们的筛选标准也参照了上述方案。我们排除了不符合试验条件的受试者，随后对剩余受试者进行准确分类，这是后续实验的基础。关键的格兰杰因果分析（GCA）利用神经影像数据，推导出AD、MCI和对照组之间从PCC到全脑以及从全脑到PCC的定向功能连接性。本方案中详细阐述了GCA分析的具体步骤。该技术发现了各组间在定向连接性上的显著差异，并较好地解释了功能变化与阿尔茨海默病进展之间的相关性。

在本研究的数据分析中，个体之间存在差异（不包括年龄、性别和教育水平，因为这三项在3组之间相似，因此难以对结论进行客观评估）。为解决这一问题，我们对各组数据进行分析，而非分析个体数据。各组中的变量以均值和标...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
116 名患者	浙江省人民’医院	-	本研究经浙江省人民医院伦理委员会批准。’医院。每位入组受试者均签署了书面知情同意书。
西门子Trio 3.0 T磁共振成像扫描仪	西门子，德国埃朗根	20571	配备 AudioComfort 技术，可降低高达 90% 的声学噪声；在低噪声水平下提供高性能；超轻重量线圈；独特的磁共振成像序列设计；可无限制支持高达 400 磅的重量。
RESTplus	中国浙江杭州，杭州师范大学	20160122	RESTplus 源自 REST（静息态功能磁共振成像数据处理工具包），是一个便捷的工具包，可用于计算功能连接（FC）、局部一致性（ReHo）、低频波动振幅（ALFF）、分数低频波动振幅（fALFF）、格兰杰因果性、节点度中心性以及体素镜像同伦连接（VMHC），并进行统计分析。
DPARSF	中国浙江省杭州市杭州师范大学	130615	静息态功能磁共振成像数据处理助手（DPARSF）是基于SPM开发的DPABI平台中的一个便捷插件软件。您只需整理好DICOM文件并点击数个按钮设置参数，DPARSF即可自动完成所有预处理步骤，并生成功能连接、局部一致性（ReHo）、低频振幅（ALFF/fALFF）、节点度中心性、体素镜像同伦连接（VMHC）等分析结果。
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