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方法文章

大鼠电休克惊厥及海马组织分级分离以检测惊厥诱导的突触后密度蛋白变化

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DOI：

10.3791/56016

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2017年8月15日

 ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

本文内容

摘要

电休克发作（ECS）是一种用于重度抑郁症的电休克治疗的实验动物模型。ECS 全面刺激海马体内的活动，从而促进突触生成和突触可塑性。本文中，我们描述了在大鼠中诱导 ECS 的方法，以及对其海马体进行亚细胞分级分离以检测癫痫发作引起的突触蛋白变化的方法。

摘要

电休克发作（ECS）是电休克治疗的一种实验性动物模型，而电休克治疗是治疗重度抑郁症最有效的方法。ECS可诱导全身性强直-阵挛性发作，且具有低死亡率和较少神经元损伤的特点，是广泛用于筛选抗癫痫药物的模型。本文介绍一种ECS诱导方法：通过耳夹电极向体重200–250 g的雄性大鼠施加持续0.5 s、强度为55 mA的短暂电流。这种双侧刺激可引发4–5级阵挛性发作，持续时间约为10秒。在急性或慢性ECS结束后，大多数大鼠的行为恢复至与假性“无发作”"no seizure"大鼠无法区分的水平。由于ECS可全局性增强脑部活动，因此也被用于结合多种方法研究活动依赖性的突触蛋白改变及其对突触强度的影响。特别是，通过突触后密度（PSD）的亚细胞分级分离结合蛋白质印迹法（Western blotting），可对这一特化突触结构中突触蛋白的丰度进行定量分析。与以往需要大量啮齿类动物脑组织的分级分离方法不同，本文描述了一种小规模的分级分离方法，可从单只大鼠的海马组织中分离PSD，且无需蔗糖梯度离心。利用该方法，我们证实所分离的PSD组分中含有突触后膜蛋白，包括PSD95、GluN2B和GluA2；而突触前标志物突触素（synaptophysin）以及可溶性胞质蛋白α-微管蛋白（α-tubulin）则未出现在PSD组分中，表明PSD成功分离。此外，慢性ECS降低了PSD中GluN2B的表达水平，说明我们建立的小规模PSD分级分离方法可用于检测单只大鼠在遗传、药物或机械干预后海马PSD蛋白的变化。

引言

电休克治疗已被用于治疗重度抑郁症患者，包括严重耐药性抑郁症、双相情感障碍性抑郁症、帕金森病以及精神分裂症1,2。在该疗法中，通过颅外电极向麻醉患者头部施加电刺激，从而诱发癫痫发作1,2,3。临床上，重复给予电休克治疗对耐药性抑郁障碍具有有益效果1,2,3。然而，其在人体中产生长期抗抑郁效应的确切机制仍不明确。电休克刺激（ECS）是电休克治疗的动物模型，被广泛用于研究其治疗机制。在啮齿类动物中，单次急性ECS处理和长期慢性ECS治疗均可促进海马区成体神经发生，并重组神经网络结构4,5，这可能有助于提高认知灵活性。此外，ECS通过全面增强脑内活动，改变了多种转录本（如脑源性神经营养因子）6以及多种蛋白质（包括代谢型谷氨酸受体17和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）型谷氨酸受体亚基）7的表达水平。这些变化参与介导了海马区突触数量、结构和功能强度的长期改变7,8,9。

在ECS模型中，通过立体定位植入电极、角膜电极或耳电极对啮齿类动物施加电刺激，以诱发全身性强直-阵挛性发作10,11立体定位电极植入涉及脑部手术，需要较长时间训练实验人员的外科操作技能，以尽量减少组织损伤。相比之下，较微创的角膜电极可能引起角膜擦伤和干燥，并需要使用麻醉。耳夹式电极的使用可避免上述局限，因其可在无需手术或麻醉的情况下用于啮齿类动物，且造成的损伤极小。事实上，我们发现向清醒大鼠施加的电流 通过 耳夹电极可稳定诱导4-5级强直-阵挛性癫痫发作，并改变其海马组织中的突触蛋白10.

为了研究电休克治疗（ECS）诱导的突触蛋白在啮齿类动物特定脑区中的丰度变化，选择最适合检测和定量这些蛋白的实验方法至关重要。脑组织的亚细胞分级分离技术可用于粗略分离可溶性胞质蛋白、膜蛋白、细胞器结合蛋白，甚至某些特殊亚细胞结构（如突触后致密区，PSD12,13,14）中的蛋白。PSD 是神经元中一种致密且高度有序的亚细胞结构域，其中突触蛋白在突触后膜及其邻近区域高度富集12,13,15。分离PSD组分有助于研究在PSD中富集的突触蛋白，因为PSD中突触后谷氨酸受体、支架蛋白和信号转导蛋白在丰度和功能上的动态变化12,15,16,17，与突触可塑性以及多种神经系统疾病中观察到的突触病变密切相关17,18。以往用于纯化PSD的亚细胞分级方法，是通过蔗糖梯度差速离心法从脑组织的粗膜组分中分离去污剂不溶性组分14,19。该传统方法的主要挑战在于需要大量啮齿类动物脑组织14,19。每种处理条件需准备10至20只动物才能获得足够的PSD组分，耗时且成本高昂，若处理组数较多，则在实际操作中难以实现。

为克服这一挑战，我们改进了一种更简便的方法，可直接分离突触后密度（PSD）组分，而无需蔗糖梯度离心20,21，并进一步优化该方法，使其适用于从单只大鼠脑的海马组织中分离PSD。我们这种小规模PSD分级分离方法可从两个海马组织中获得约30–50 µg的PSD蛋白，足以用于多项生化检测，包括免疫共沉淀和蛋白质印迹（Western blotting）。蛋白质印迹结果表明，该PSD分离方法成功富集了突触后密度蛋白95（PSD-95），同时排除了突触前标志物突触素（synaptophysin）以及可溶性胞质蛋白α-微管蛋白（α-tubulin），验证了方法的有效性。我们的电休克（ECS）诱导及小规模PSD分级分离方法易于推广至其他啮齿类动物脑区，为评估ECS对PSD蛋白表达的影响提供了一种相对简便且可靠的手段。

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方案

所有涉及动物实验的操作程序均已获得伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 大鼠品系的维持

  1. 繁殖并饲养Sprague-Dawley大鼠（参见材料表），在标准条件下维持12小时光照-黑暗循环，并可自由获取食物和水。
  2. 在出生后第28天（P28）断奶，将幼鼠按性别分组饲养，每组2–4只同窝雄性或雌性幼鼠。
  3. 使用无毒的永久性黑色记号笔标记雄性大鼠的尾巴以进行个体识别。
  4. 每周称量雄性大鼠体重3次，并记录其体重数据。

2. ECS 仪器的准备

  1. 上午7:30，对动物准备室中的实验台进行消毒，并将一台ECS仪（脉冲发生器）放置在实验台上。
  2. 将一只体重为200–250 g的雄性大鼠放入一个带盖的清洁空笼中。对所有需要进行ECS诱导处理的雄性大鼠重复此步骤。让大鼠适应环境30分钟。
  3. 在大鼠于笼中适应期间，将用于ECS诱导的脉冲发生器参数设置为：频率100脉冲/秒，脉宽0.5 ms，电击持续时间0.5 s，电流55 mA（图1A）。
  4. 通过按下"RESET"按钮并确认"READY"指示灯亮起，完成脉冲发生器的准备。确保耳夹未连接至脉冲发生器，然后按住"SHOCK"按钮数秒钟。
    注意：此时脉冲发生器已准备好用于ECS诱导。
  5. 将耳夹插入脉冲发生器。

3. 急性电休克刺激的诱导

注意：见 图1B，上图。

  1. 用无菌生理盐水润湿耳夹，并确保其充分浸透。
  2. 用浸有无菌生理盐水的纱布包裹大鼠耳朵以润湿耳部，润湿后取下纱布。
  3. 每只耳朵各夹一个耳夹，位置应置于主软骨带以外。
  4. 在电惊厥发作（ECS）仪器上确认已形成有效回路；若未形成，仪器将显示错误信息或读数为 "1"。
  5. 佩戴厚实的非金属手套。用戴手套的手轻轻握住大鼠，按下 "SHOCK" 按钮数秒，同时缓慢松开对大鼠的握持，观察其是否出现惊厥。对于假刺激（sham）无惊厥（"no seizure"，NS）对照组，操作步骤相同，但不施加电流。
  6. 当强直阵挛发作开始时，断开耳夹连接，并根据修订的Racine评分标准22记录惊厥行为，该标准包括："口部及面部运动"（1期）、"点头动作"（2期）、"前肢阵挛"（3期）、"直立伴前肢阵挛"（4期）以及 "直立跌倒伴前肢阵挛"（5期）。惊厥持续时间应约为10秒，使用计时器记录惊厥持续时间。
  7. 惊厥结束后，将大鼠放回其原饲养笼中。继续观察5分钟，确认大鼠已从惊厥中恢复。单独饲养于笼内，并将笼子送回恢复室。
  8. 对下一只大鼠重复上述ECS诱导操作。
  9. 在当天剩余时间内持续监测大鼠，并在次日至少于上午和下午各监测一次，直至实验结束实施安乐死。
    注意：ECS诱导方法可能产生临床症状作为偶然的副作用，需引起重视。例如，ECS诱导方案可能导致惊厥持续时间超过15秒，从而给大鼠带来不必要的痛苦。在此情况下，应使用地西泮（10 mg/kg，腹腔注射）或戊巴比妥钠（25–30 mg/kg，腹腔注射）终止惊厥。若大鼠在惊厥停止后出现呼吸困难或严重行为异常，应通过吸入二氧化碳后断头的方式实施安乐死。

4. 慢性电休克刺激的诱导

注意：见图1B，下方面板。

  1. 按照上述步骤 1 - 3 的方法，连续七天每天早晨在同一时间诱导一次电休克刺激（ECS）。
  2. 将大鼠放回饲养笼后，每天观察两次。

5. 大鼠海马组织的匀浆与分级分离

注意：参见图2。

  1. 配制新鲜的匀浆缓冲液（溶液A），其中包含320 mM蔗糖、5 mM焦磷酸钠、1 mM EDTA、10 mM HEPES（pH 7.4）、200 nM冈田酸以及蛋白酶抑制剂。使用孔径为0.22 µm的滤器对缓冲液进行真空过滤除菌，并置于冰上备用。
  2. 在急性电休克（ECS）或慢性ECS后的指定时间点（图1），通过吸入CO2 5–10分钟处死大鼠，随后使用断头器进行断头。
  3. 取出大脑，在置于冰上的金属板上分离海马组织，操作方法如前所述23,24。
  4. 将一只大鼠的两个海马组织置于30 mm的组织培养皿中，用剪刀将其剪成小块。
  5. 用1 mL移液器将剪碎的海马组织转移至手动玻璃匀浆器中，并加入1 mL预冷的匀浆缓冲液（溶液A，步骤5.1）。将圆头研杵插入玻璃匀浆器中，在保持匀浆器处于冰上的条件下，轻柔而稳定地上下研磨10–15次，持续约1分钟，直至海马组织的小块完全消失。
  6. 用1 mL移液器将匀浆液转移至1.7 mL微量离心管中，在4 °C条件下以800 × g离心10分钟，以分离上清液（S1组分）和沉淀（P1组分，含不溶性组织和细胞核）。用1 mL移液器分别取50 µL和950 µL S1组分转移至两个新的1.7 mL微量离心管中，并将这些管子置于冰上保存。将P1组分沉淀也保留在冰上。
  7. 将S1组分（950 µL）在4 °C条件下以13,800 × g离心10分钟，分离出富含胞质可溶性蛋白的上清液（S2组分）和富含膜结合蛋白（包括突触体蛋白）的沉淀（P2组分）。用1 mL移液器将S2组分转移至新的1.7 mL微量离心管中，并置于冰上保存。
  8. 用1 mL移液器将沉淀（P2组分）重悬于498 µL预冷的纯水中。使用20 µL移液器加入2 µL 1 M HEPES（pH 7.4），使终浓度达到4 mM HEPES（pH 7.4）。在4 °C条件下振荡孵育30分钟。将重悬后的P2组分置于冰上保存。
  9. 使用BCA法测定S1、S2和P2组分的蛋白浓度。向各组分中加入50 mM HEPES（pH 7.4），调节蛋白浓度至1 mg/mL，随后保存于-80 °C备用；或直接对P2组分进行处理以分离突触后密度（PSD）组分。

6. 从粗膜蛋白（P2）组分中分离PSD

  1. 将P2组分（500 µL）在4 °C条件下以25,000 x g离心20分钟，以分离裂解上清液（LS2组分）和裂解沉淀物（LP1组分）。使用1 mL移液器将LS2组分转移至新的1.7 mL微量离心管中，并置于冰上保存。
  2. 将LP1沉淀物用1 mL移液器重悬于250 µL 50 mM HEPES（pH 7.4）与250 µL含1%去垢剂的1×PBS缓冲液的混合液中。在4 °C下轻柔振荡孵育15分钟。
  3. 将重悬的LP1沉淀物在25,000 × g、4 °C条件下离心3小时，以分离上清液（非PSD组分）与沉淀物（PSD组分）。将上清液转移至1.7 mL微量离心管中，使用200 µL移液器将PSD沉淀物重悬于100 µL 50 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中。
  4. 使用BCA法测定LS2、非PSD和PSD组分的蛋白浓度。向每种组分中加入50 mM HEPES（pH 7.4），调节蛋白浓度至1 mg/mL，保存于-80 °C，待用。
    注意：步骤 5 - 6 中使用的所有溶液（即， 溶液A、HEPES缓冲液和PBS缓冲液应使用不含离子、有机污染物及颗粒的纯化水配制。

7. 蛋白质印迹法

  1. 将每种蛋白质组分在冰上解冻。使用20 µL移液器将每种组分（S2、P2和PSD，浓度为1 mg/mL）各12 µL转移至新的1.7 mL微量离心管中。
  2. 加入3 µL 5x SDS上样缓冲液，在水浴中75 °C孵育30分钟。将样品冷却至室温（RT）。
  3. 使用20 µL移液器将10 µL蛋白质样品加入4-20%梯度15孔梳状SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶的每个加样孔中。在SDS-PAGE装置中，以80-100 V电压在电泳缓冲液（25 mM Tris、190 mM甘氨酸和0.1% SDS；pH 8.3）中进行电泳。
    注意：每块凝胶应包含急性或慢性ECS后不同时间点的NS大鼠和ECS大鼠的蛋白质样品。
  4. 在转移缓冲液（25 mM Tris、190 mM甘氨酸和20%甲醇；pH 8.3）中，使用转膜装置以25-30 V（60 mA）将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续9-12小时。
  5. 从转膜装置中取出PVDF膜，在Tris缓冲盐水（TBS）中于室温下在多功能旋转器上洗涤5分钟。
  6. 用含5%脱脂奶粉和0.1% Tween-20的TBS封闭膜1小时。随后在洗涤缓冲液（含1%脱脂奶粉和0.1% Tween-20的TBS）中，于4 °C在多功能旋转器上与一抗（表1）孵育过夜（稀释比例见材料表）。
  7. 用洗涤缓冲液洗涤膜4次，每次10分钟，然后在室温下于多功能旋转器上用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在洗涤缓冲液中孵育1小时。
  8. 用洗涤缓冲液洗涤膜4次，每次10分钟，再用TBS洗涤5分钟。
  9. 用增强型化学发光底物孵育膜1分钟，随后将膜暴露于X射线胶片。使用胶片处理器显影曝光后的胶片。

8. 蛋白质印迹的定量分析

  1. 将 Western 印迹扫描为 TIFF 文件并保存至计算机。
  2. 在 ImageJ 程序中以灰度图像打开 Western 印迹文件，路径为 "文件" → "打开图像" → 右箭头 "灰度"。
  3. 从 ImageJ 工具栏中选择矩形选区工具，绘制一个覆盖目标蛋白单一条带的矩形区域。
  4. 在 "分析" 菜单下，点击 "测量"，以获取所选条带的面积和平均密度。
  5. 保持矩形区域的大小和形状不变，将其移至无信号的背景区域。重复步骤 8.4，测量该背景区域的面积和平均密度。
  6. 用 Western 印迹条带的平均密度值减去背景区域的平均密度值，得到目标蛋白条带经背景校正后的密度值。
  7. 对所有感兴趣的 Western 印迹条带重复步骤 8.2 至 8.6。
  8. 将目标蛋白经背景校正后的条带密度值除以内参蛋白（如 α-Tubulin）的经背景校正后的条带密度值，得到目标蛋白的标准化表达值。

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结果

使用本文所述的详细操作步骤，通过耳夹电极给予大鼠一次电刺激（55 mA，100 脉冲/秒，持续 0.5 秒），可诱导出非复发性的 4-5 级强直-阵挛性癫痫发作图1A-B共有8只大鼠接受了急性电休克刺激（ECS）诱导，并出现4-5级强直-阵挛性发作。发作持续约10秒，所有大鼠均在发作停止后1-2分钟内恢复。假手术“无发作”组大鼠未接受电击，因此未出现发作，共使用4只假手术大鼠。对于慢性ECS诱导，大鼠连续7天每天接受一次电击，每次电击均引发4-5级强直-阵挛性发作。图1A-B）。共有8只大鼠接受了慢性电休克刺激（ECS）诱导，另有4只假手术大鼠作为“无癫痫发作”对照组。尽管大多数接受慢性ECS的大鼠在行为上与假手术“无癫痫发作”大鼠难以区分，但少数大鼠在第7天时出现身体震颤和探索活动减少的现象。th 电击

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讨论

本文介绍一种在大鼠中诱导电休克（ECS）的方法，该方法可引发其海马体内神经元活动的全局性刺激。ECS 是电休克治疗的动物模型，后者在临床上用于治疗人类药物难治性抑郁症1,2,3。尽管电休克治疗已被用于治疗重度抑郁症，但其确切的作用机制仍不明确。由于 ECS 能在啮齿类动物中诱导出类似抗抑郁的行为，并促进海马齿状回的神经发生4,32，因此 ECS 被广泛用于研究海马齿状回中新生成的成年神经元是否参与抗抑郁行为5,32。

ECS通过立体定位植入电极、角膜电极或耳夹电极向啮齿类动物传递电流，可诱导轻度至重度的全身性强直-阵挛性癫痫发作3...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Eric C. Bolton 博士允许我们使用他的离心机进行组分分离，以及约翰斯·霍普金斯大学 Richard L. Huganir 实验室的 Graham H. Diering 博士为我们提供了突触后密度（PSD）组分分离的小规模实验方案。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Spargue-Dawley 大鼠Charles River LaboratoriesECS 用品
脉冲发生器Ugo Bsile, Comerio, 意大利57800ECS 用品
MilliQ 水纯化系统EMD MilliporeZ00Q0VWW亚细胞组分分离用品
蔗糖Em scienceSX 1075-3亚细胞组分分离用品
Na4O7P2SIGMA-ALDRICH221368亚细胞组分分离用品
乙二胺四乙酸（EDTA）SIGMA-ALDRICHE9884亚细胞组分分离用品
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527亚细胞组分分离用品
冈田酸TOCRIS1136亚细胞组分分离用品
Halt 蛋白酶抑制剂Thermo Scientific78429亚细胞组分分离用品
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060亚细胞组分分离用品
EMD Millipore Sterito 无菌真空瓶顶过滤器Fisher ScientificSCGPS05RE亚细胞组分分离用品
虹膜剪刀WPI（World Precision Instruments）500216-G亚细胞组分分离用品
30 mm 组织培养皿Fisher Scientific08-772B亚细胞组分分离用品
玻璃匀浆器及聚四氟乙烯（Teflon）研杵VWR89026-384亚细胞组分分离用品
1.7 mL 微量离心管DENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)亚细胞组分分离用品
Sorvall Legend XT/XF 离心机 Thermo Fisher75004521亚细胞组分分离用品
Pierce BCA 蛋白检测试剂 A，500 mLThermo Fisher#23228Western blot 用品
Pierce BCA 蛋白检测试剂 B，25 mLThermo Fisher#1859078Western blot 用品
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）BIO-RAD#4561086SWestern blot 用品
电泳缓冲液实验室自制Western blot 用品 
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于预制胶，可同时运行 4 块胶）BIO-RAD#1658004Western blot 用品
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 MiliporeIPVH00010Western blot 用品
转膜缓冲液实验室自制Western blot 用品 
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1Western blot 用品
甘氨酸Fisher ScientificBP381-5Western blot 用品
十二烷基硫酸钠SIGMA-ALDRICH436143Western blot 用品
甲醇 Fisher ScientificA454-4Western blot 用品
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500PSD 分离用去垢剂
Mini Trans-Blot 转印模块 BIO-RAD#1703935Western blot 用品
脱脂速溶奶粉Great valueWestern blot 用品
多功能旋转摇床 Thermo ScientificModel-2314Western blot 用品
Hyblot CL 自显影胶片DENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Western blot 用品
增强型化学发光底物 Thermo Scientific32106Western blot 用品
Konica SRX-101A 胶片处理仪KONICA MINOLTASRX-101AWestern blot 用品
抗体名称
PSD-95Cell Signaling#2507抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 兔
突触素（Synaptophysin）Cell Signaling#4329抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 兔
α-微管蛋白（alpha-Tubulin）SantacruzSC-5286抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 小鼠
GluN2BNeuromab75-097抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 小鼠
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 兔
STEPSantacruzSC-23892抗体稀释倍数 = 1:200 - 500，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 小鼠
辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠 IgG（H+L）Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150抗体稀释倍数 = 1:2,000-5,000，孵育时间 = 1 小时，反应温度 = 室温（RT），宿主物种 = 驴
辣根过氧化物酶标记的驴抗兔 IgG（H+L）Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152抗体稀释倍数 = 1:2,000-5,000，孵育时间 = 1 小时，反应温度 = 室温（RT），宿主物种 = 驴

参考文献

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