电休克发作（ECS）是一种用于重度抑郁症的电休克治疗的实验动物模型。ECS 全面刺激海马体内的活动，从而促进突触生成和突触可塑性。本文中，我们描述了在大鼠中诱导 ECS 的方法，以及对其海马体进行亚细胞分级分离以检测癫痫发作引起的突触蛋白变化的方法。
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摘要
摘要
电休克发作（ECS）是电休克治疗的一种实验性动物模型，而电休克治疗是治疗重度抑郁症最有效的方法。ECS可诱导全身性强直-阵挛性发作，且具有低死亡率和较少神经元损伤的特点，是广泛用于筛选抗癫痫药物的模型。本文介绍一种ECS诱导方法：通过耳夹电极向体重200–250 g的雄性大鼠施加持续0.5 s、强度为55 mA的短暂电流。这种双侧刺激可引发4–5级阵挛性发作，持续时间约为10秒。在急性或慢性ECS结束后，大多数大鼠的行为恢复至与假性“无发作”"no seizure"大鼠无法区分的水平。由于ECS可全局性增强脑部活动，因此也被用于结合多种方法研究活动依赖性的突触蛋白改变及其对突触强度的影响。特别是，通过突触后密度（PSD）的亚细胞分级分离结合蛋白质印迹法（Western blotting），可对这一特化突触结构中突触蛋白的丰度进行定量分析。与以往需要大量啮齿类动物脑组织的分级分离方法不同，本文描述了一种小规模的分级分离方法，可从单只大鼠的海马组织中分离PSD，且无需蔗糖梯度离心。利用该方法，我们证实所分离的PSD组分中含有突触后膜蛋白，包括PSD95、GluN2B和GluA2；而突触前标志物突触素（synaptophysin）以及可溶性胞质蛋白α-微管蛋白（α-tubulin）则未出现在PSD组分中，表明PSD成功分离。此外，慢性ECS降低了PSD中GluN2B的表达水平，说明我们建立的小规模PSD分级分离方法可用于检测单只大鼠在遗传、药物或机械干预后海马PSD蛋白的变化。
引言
电休克治疗已被用于治疗重度抑郁症患者，包括严重耐药性抑郁症、双相情感障碍性抑郁症、帕金森病以及精神分裂症1,2。在该疗法中，通过颅外电极向麻醉患者头部施加电刺激，从而诱发癫痫发作1,2,3。临床上，重复给予电休克治疗对耐药性抑郁障碍具有有益效果1,2,3。然而，其在人体中产生长期抗抑郁效应的确切机制仍不明确。电休克刺激（ECS）是电休克治疗的动物模型，被广泛用于研究其治疗机制。在啮齿类动物中，单次急性ECS处理和长期慢性ECS治疗均可促进海马区成体神经发生，并重组神经网络结构4,5，这可能有助于提高认知灵活性。此外，ECS通过全面增强脑内活动，改变了多种转录本（如脑源性神经营养因子）6以及多种蛋白质（包括代谢型谷氨酸受体17和N-甲基-....
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方案
所有涉及动物实验的操作程序均已获得伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 大鼠品系的维持
- 繁殖并饲养Sprague-Dawley大鼠（参见材料表），在标准条件下维持12小时光照-黑暗循环，并可自由获取食物和水。
- 在出生后第28天（P28）断奶，将幼鼠按性别分组饲养，每组2–4只同窝雄性或雌性幼鼠。
- 使用无毒的永久性黑色记号笔标记雄性大鼠的尾巴以进行个体识别。
- 每周称量雄性大鼠体重3次，并记录其体重数据。
2. ECS 仪器的准备
- 上午7:30，对动物准备室中的实验台进行消毒，并将一台ECS仪（脉冲发生器）放置在实验台上。
- 将一只体重为200–250 g的雄性大鼠放入一个带盖的清洁空笼中。对所有需要进行ECS诱导处理的雄性大鼠重复此步骤。让大鼠适应环境30分钟。
- 在大鼠于笼中适应期间，将用于ECS诱导的脉冲发生器参数设置为：频率100脉冲/秒，脉宽0.5 ms，电击持续时间0.5 s，电流55 mA（图1A）。
- 通过按下"RESET"按钮并确认"READY"指....
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结果
使用本文所述的详细操作步骤，通过耳夹电极向大鼠施加一次电刺激（55 mA，100 脉冲/秒，持续 0.5 秒）可诱导出非复发性的 4-5 级强直-阵挛性癫痫发作图1A-B共有8只大鼠接受了急性电休克刺激（ECS）诱导，并出现4-5级强直-阵挛性发作。发作持续约10秒，所有大鼠在发作停止后1-2分钟内恢复。假手术“无发作”组大鼠未接受电击，因此未出现发作，共使用4只假手术大鼠。对于慢性ECS诱导，大鼠连续7天每天接受一次电击，每次电击均引发4-5级强直-阵挛性发作。图1A-B）。共有8只大鼠接受了慢性电休克刺激（ECS）诱导，另有4只假手术大鼠作为“无癫痫发作”对照组。尽管大多数接受慢性ECS的大鼠在行为上与假手术“无癫痫发作”大鼠无法区分，但少数大鼠在第7天时出现身体震颤和探索活动减少的现象。th 电击
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讨论
本文介绍一种在大鼠中诱导电休克（ECS）的方法，该方法可引发其海马体内神经元活动的全局性刺激。ECS 是电休克治疗的动物模型，后者在临床上用于治疗人类药物难治性抑郁症1,2,3。尽管电休克治疗已被用于治疗重度抑郁症，但其确切的作用机制仍不明确。由于 ECS 能在啮齿类动物中诱导出类似抗抑郁的行为，并促进海马齿状回的神经发生4,32，因此 ECS 被广泛用于研究海马齿状回中新生成的成年神经元是否参与抗抑郁行为5,32。
ECS通过立体定位植入电极、角膜电极或耳夹电极向啮齿类动物传递电流，可诱导轻度至重度的全身性强直-阵挛性癫痫发作3.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Eric C. Bolton 博士允许我们使用他的离心机进行组分分离，以及约翰斯·霍普金斯大学 Richard L. Huganir 实验室的 Graham H. Diering 博士为我们提供了突触后密度（PSD）组分分离的小规模实验方案。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Spargue-Dawley 大鼠 | Charles River Laboratories | ECS 用品 | |
| 脉冲发生器 | Ugo Bsile, Comerio, 意大利 | 57800 | ECS 用品 |
| MilliQ 水纯化系统 | EMD Millipore | Z00Q0VWW | 亚细胞组分分离用品 |
| 蔗糖 | Em science | SX 1075-3 | 亚细胞组分分离用品 |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | 亚细胞组分分离用品 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | SIGMA-ALDRICH | E9884 | 亚细胞组分分离用品 |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | 亚细胞组分分离用品 |
| 冈田酸 | TOCRIS | 1136 | 亚细胞组分分离用品 |
| Halt 蛋白酶抑制剂 | Thermo Scientific | 78429 | 亚细胞组分分离用品 |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | 亚细胞组分分离用品 |
| EMD Millipore Sterito 无菌真空瓶顶过滤器 | Fisher Scientific | SCGPS05RE | 亚细胞组分分离用品 |
| 虹膜剪刀 | WPI（World Precision Instruments） | 500216-G | 亚细胞组分分离用品 |
| 30 mm 组织培养皿 | Fisher Scientific | 08-772B | 亚细胞组分分离用品 |
| 玻璃匀浆器及聚四氟乙烯（Teflon）研杵 | VWR | 89026-384 | 亚细胞组分分离用品 |
| 1.7 mL 微量离心管 | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | 亚细胞组分分离用品 |
| Sorvall Legend XT/XF 离心机 | Thermo Fisher | 75004521 | 亚细胞组分分离用品 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂 A，500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot 用品 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂 B，25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot 用品 |
| SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） | BIO-RAD | #4561086S | Western blot 用品 |
| 电泳缓冲液 | 实验室自制 | Western blot 用品 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于预制胶，可同时运行 4 块胶） | BIO-RAD | #1658004 | Western blot 用品 |
| 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Milipore | IPVH00010 | Western blot 用品 |
| 转膜缓冲液 | 实验室自制 | Western blot 用品 | |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot 用品 |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot 用品 |
| 十二烷基硫酸钠 | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot 用品 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot 用品 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | PSD 分离用去垢剂 |
| Mini Trans-Blot 转印模块 | BIO-RAD | #1703935 | Western blot 用品 |
| 脱脂速溶奶粉 | Great value | Western blot 用品 | |
| 多功能旋转摇床 | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot 用品 |
| Hyblot CL 自显影胶片 | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot 用品 |
| 增强型化学发光底物 | Thermo Scientific | 32106 | Western blot 用品 |
| Konica SRX-101A 胶片处理仪 | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot 用品 |
| 抗体名称 | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | 抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 兔 |
| 突触素（Synaptophysin） | Cell Signaling | #4329 | 抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 兔 |
| α-微管蛋白（alpha-Tubulin） | Santacruz | SC-5286 | 抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 小鼠 |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | 抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 小鼠 |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | 抗体稀释倍数 = 1:500 - 1,000，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 兔 |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | 抗体稀释倍数 = 1:200 - 500，孵育时间 = 9 - 12 小时，反应温度 = 4 °C，宿主物种 = 小鼠 |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠 IgG（H+L） | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | 抗体稀释倍数 = 1:2,000-5,000，孵育时间 = 1 小时，反应温度 = 室温（RT），宿主物种 = 驴 |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗兔 IgG（H+L） | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | 抗体稀释倍数 = 1:2,000-5,000，孵育时间 = 1 小时，反应温度 = 室温（RT），宿主物种 = 驴 |
参考文献
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al.
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