NOD.SCID 小鼠部分肝切除术后肝细胞脾内移植

摘要

我们描述了一种在NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdc^scid/J）小鼠中进行部分肝切除术（PHx）并通过脾脏移植细胞的实验方案。该方案中，首先进行切口以暴露并切除肝脏左叶，随后另作切口，用于将细胞移植至脾脏内。

摘要

部分肝切除术是一种多功能且可重复的方法，可用于研究肝脏再生以及细胞治疗在各种病理条件下的作用。部分肝切除还可通过加速新生血管形成和细胞向肝脏迁移，促进移植细胞的定植和增殖。本文中，我们描述了一种在非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷 NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdc^scid/J）小鼠脾脏中进行30%肝切除及细胞移植的简单操作方案。

在本操作中，需制作两个小切口。第一个切口用于暴露并切除肝脏左叶，另一个小切口用于暴露脾脏，以便进行细胞的脾内移植。该操作无需特殊的外科手术技能，可在5至7分钟内完成，具有应激和疼痛更小、恢复更快、存活率更高的优点。我们已成功在部分肝切除的NOD.SCID小鼠中，移植了来源于表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（转基因C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J）的肝细胞，以及人源类肝细胞（NeoHep）。

引言

目前，肝细胞移植被认为是一种治疗严重肝病患者的全器官移植替代方案。人们认为，它可作为患者等待全器官移植的过渡手段¹。除了同种异体肝细胞²外，异种肝细胞³以及来源于干细胞的肝细胞⁴也正在动物模型中进行研究。在此背景下，移植细胞在受体体内的归巢能力及植入潜能，是细胞治疗急性肝衰竭（AHF）的重要评价标准。

用于研究肝细胞或类肝细胞的移植⁵，AHF 在动物模型中通过手术方式建立⁶ 或药理学的⁷ 操作步骤，随后进行细胞移植。通过药理学试剂建立急性肝衰竭（AHF）动物模型时，可使用多种肝毒素，例如d-氨基半乳糖胺⁸，对乙酰氨基酚⁹四氯化碳¹⁰，硫代乙酰胺¹¹，刀豆蛋白A¹²脂多糖¹³, 等等已使用多种试剂。从该列表中，每种试剂均可为急性肝衰竭（AHF）产生....

方案

本方案中所述的实验操作已获得印度新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会的批准，批准文件的序列编号为 IAEC#319/13。

注意：有关普通外科手术的优秀资源²⁰以及啮齿类动物手术的具体操作方案²¹已有详细记载。对于首次进行动物手术的研究人员，建议在动物实验前先在模型上广泛练习外科操作技术。

1. 准备

1. 实验前准备好无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水。
2. 准备一套手术器械，包括剪刀、锯齿镊、组织镊、棉球、棉签、尼龙线和不同类型的微针持针器，并对器械进行高压灭菌。若实验方案中涉及免疫缺陷型 NOD.SCID 小鼠，应特别小心。
3. 从术前准备到手术结束的整个实验过程均应在生物安全一级柜中进行。
4. 手术前称量一只 6–8 周龄的 NOD.SCID 小鼠体重。本研究使用体重在 14–18 g 之间的小鼠。
5. 使用毛发修剪器剃除小鼠上腹部中央及季肋区的毛发。用刮刀将脱毛膏均匀涂抹于该区域，彻底清除已剪短的毛发。2–5 分钟后，用一块湿润的无菌棉球轻轻擦去残留毛发。
6. 将小鼠放入异氟烷麻醉舱，打开氧气瓶阀门。维持氧气流速为 4 L/min，异氟烷挥发浓度为 4%，以诱导麻醉。
   1. 通过....

结果

30% 肝部分切除术后肝细胞增殖：通过细胞增殖标志物 Ki-67 的免疫组织化学（IHC）染色，检测小鼠 30% 肝部分切除术后残余肝脏中肝细胞的增殖情况。术后第 1 天处死小鼠，切除残余肝叶并制备石蜡切片。切片经 Ki-67 抗体孵育后，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行显色，以二氨基联苯胺（DAB）作为 HRP 的底物产生棕色信号以识别阳性染色细胞。细胞核使用苏木精复染，并在 20X 物镜下观察。图 1 显示了肝脏切片的代表性 IHC 图像。约 13% 的细胞（13.66 ± 0.317，N=3）呈 Ki-67 阳性，证实 30% 肝部分切除可促进小鼠肝脏中肝细胞的增殖。

解剖学研究：显示了NOD.SCID小鼠肝切除术后10天的肝脏代表性图像（见图2）。该图像证实，残留肝脏健康，无可见异常。

手术后第一小时内移植细.......

讨论

部分肝切除术是研究肝脏再生的成熟技术，而大范围肝切除被报道可模拟急性肝衰竭（AHF）模型。在AHF的动物模型中，啮齿类动物尤其是小鼠是最常用的研究模型。为建立小鼠肝损伤模型，已有报道称实施高达70%的肝切除可获得较高的存活率^25,26。然而，在裸鼠及其他免疫缺陷小鼠中，70%肝切除被报道具有致死性，动物在24小时内死亡²⁷。

Mitchell 和 Willenbring²⁸ 报道了一种在小鼠中可重复且耐受性良好的三分之二部分肝切除方法。对于 NOD.SCID 小鼠，当肝切除范围限制在左肝叶切除（约占总肝质量的 30%）时，我们获得了 100% 的存活率。与裸鼠的观察结果一致²⁷，我们发现，在 NOD.SCID 小鼠中，若肝切除比例进一步增加，将导致存活率显著下降。此外，在 30% 部分肝切除术后 1 天，残余肝叶肝细胞的增殖.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
气体麻醉系统	Ugo Basile；意大利	211000
体重秤	Goldtech；印度		本地采购
生物安全柜（I级）	Kartos国际；  印度		本地采购
理发剪	松下  日本	ER-GY10
直柄手术剪，刃口锋利/双锋	Major Surgicals；印度		本地采购
带锯齿的镊子	Major Surgicals；印度		本地采购
微针持针器  直的 &和弯曲的	麦西亚人  英格兰	BS-13-8
1 ml 胰岛素注射器，配 30G × 5/16 针头	一次性运输车；印度
1 ml 注射器配 26 G × 1/2 针头	BD；美国	REF 303060
尼龙线	强大；印度		(1-0) 本地采购
MERSUTURES 4-0 无菌手术缝合针线	Ethicon, Johnson & Johnson，印度	NW 5047
TRUGUT 76 厘米 4-0 可吸收外科缝线	Sutures India Pvt. Ltd；印度	SN 5048	无菌外科缝合针，铬制肠线
棉签	Pure Swabs Pvt Ltd  印度		本地采购
手术胶带	3M 印度；印度	1530-1	微孔手术胶带
切片机	意大利 Histo-Line Laboratories	MRS3500
Shandon Cryotome E 冷冻切片机	Thermo Electron Corporation；美国
共聚焦激光扫描显微镜	卡尔·蔡司；德国	LSM 510 META
明场显微镜	日本 Olympus	LX51
自动分析仪	郁金香，阿尔托桑特拉克鲁斯，印度	Screen Maaster 3000	用于肝功能检测的生化分析仪
流式细胞仪	BD；美国	BD FACSverse	移植后细胞存留情况的评估
Veet 脱毛膏	Reckitt Benckiser，印度
FORANE	雅培；美国		异氟烷 USP 99.9%
Taxim	AlKem；印度		头孢噻肟钠注射液
聚维酮碘溶液	Win-Medicare  印度		聚维酮碘
多聚甲醛	Himedia；印度	GRM 3660
Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）	Life technologies，Thermo Fisher scientific；美国	12200-036
蔗糖	Sigma；美国	S0389
Tissue-Tek	Sakura；美国	25608-930	O.C.T. 化合物
DAPI	Himedia；印度	MB 097
抗白蛋白山羊多克隆抗体	赛默飞世尔科技，Pierce，美国	PA126081
抗连接蛋白32/GJB1多克隆抗体	abcam，英国	ab64609-500
抗GFP兔多克隆抗体	Santa Cruz 生物技术公司；美国	SC 8334
Alexa Fluor 594 驴抗山羊	Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；  美国	A11058
Alexa Fluor 488 驴抗羊	Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；  美国	A11015
Alexa Fluor 594 鸡抗兔	Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；  美国	A21442
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG	Invitrogen，Thermo Fisher Scientific；美国	65-6120
抗Ki67抗体	abcam，英国	ab15580
抗原修复液，柠檬酸基	Vector Laboratories，美国	H-3300
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Life technologies，Thermo Fisher scientific；美国	P36966
SGOT（ASAT）试剂盒	印度珊瑚临床系统
SGPT（ALAT）试剂盒	印度珊瑚临床系统
碱性磷酸酶检测试剂盒（DEA）	印度珊瑚临床系统
迈耶氏苏木精溶液	Sigma；美国	MHS16
伊红Y醇溶液	Sigma；美国	HT110132
DPX封片剂	Sigma；美国	6522
美洛昔（止痛药）	Intas Pharmaceuticals Ltd；印度		美洛昔康注射液
DAB增强型液体底物系统四盐酸盐	Sigma；美国	D3939