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方法文章

NOD.SCID 小鼠部分肝切除术后肝细胞脾内移植

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DOI：

10.3791/56018

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2018年2月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Immunology

本文内容

摘要

我们描述了一种在NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠中进行部分肝切除术（PHx）并通过脾脏移植细胞的实验方案。该方案中，首先进行切口以暴露并切除肝脏左叶，随后另作切口，用于将细胞移植至脾脏内。

摘要

部分肝切除术是一种多功能且可重复的方法，可用于研究肝脏再生以及细胞治疗在各种病理条件下的作用。部分肝切除还可通过加速新生血管形成和细胞向肝脏迁移，促进移植细胞的定植和增殖。本文中，我们描述了一种在非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷 NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠脾脏中进行30%肝切除及细胞移植的简单操作方案。

在本操作中，需制作两个小切口。第一个切口用于暴露并切除肝脏左叶，另一个小切口用于暴露脾脏，以便进行细胞的脾内移植。该操作无需特殊的外科手术技能，可在5至7分钟内完成，具有应激和疼痛更小、恢复更快、存活率更高的优点。我们已成功在部分肝切除的NOD.SCID小鼠中，移植了来源于表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠（转基因C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J）的肝细胞，以及人源类肝细胞（NeoHep）。

引言

目前，肝细胞移植被认为是一种治疗严重肝病患者的全器官移植替代方案。人们认为，它可作为患者等待全器官移植的过渡手段1。除了同种异体肝细胞2外，异种肝细胞3以及来源于干细胞的肝细胞4也正在动物模型中进行研究。在此背景下，移植细胞在受体体内的归巢能力及植入潜能，是细胞治疗急性肝衰竭（AHF）的重要评价标准。

用于研究肝细胞或类肝细胞的移植5，AHF 在动物模型中通过手术方式建立6 或药理学的7 操作步骤，随后进行细胞移植。通过药理学试剂建立急性肝衰竭（AHF）动物模型时，可使用多种肝毒素，例如d-氨基半乳糖胺8，对乙酰氨基酚9四氯化碳10，硫代乙酰胺11，刀豆蛋白A12脂多糖13, 等等已使用多种试剂。从该列表中，每种试剂均可为急性肝衰竭（AHF）产生一组独特的特征，但遗憾的是，尚无单一试剂能够模拟人类的AHF。此外，由肝毒素诱导的AHF所需时间较长，会使动物长期处于应激状态，且难以获得可重复的结果。

另一方面，部分肝切除术（PHx）的操作依赖于手术技巧，只有在掌握所需技能后才能获得可重复的结果。若仅通过手术干预诱导急性肝功能衰竭（AHF），则需要切除超过70%的肝脏组织；然而，即使肝切除比例低于70%，仍可用于研究移植细胞在肝脏中的植入和增殖情况，以分析其在肝损伤期间的治疗潜力14。肝细胞移植已在肝切除术后通过腹膜15、尾静脉16、肝静脉17或脾脏18等途径进行。目前，肝静脉输注和脾内移植肝细胞是首选方法，因其更易于重复操作。

本文描述了一种在 NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠中进行30%部分肝切除的手术步骤，即切除肝脏左叶。随后，在脾脏中移植 0.2 × 10⁶ 个表达 GFP 的小鼠肝细胞（C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J）以及人源 NeoHep19 细胞。该操作可实现移植细胞在肝脏中的定植。该方法是一种创伤最小、疼痛程度最低的技术。

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方案

本方案中所述的实验操作已获得印度新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会的批准，批准文件的序列编号为 IAEC#319/13。

注意：有关普通外科手术的优秀资源20以及啮齿类动物手术的具体操作方案21已有详细记载。对于首次进行动物手术的研究人员，建议在动物实验前先在模型上广泛练习外科操作技术。

1. 准备

  1. 实验前准备好无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水。
  2. 准备一套手术器械，包括剪刀、锯齿镊、组织镊、棉球、棉签、尼龙线和不同类型的微针持针器，并对器械进行高压灭菌。若实验方案中涉及免疫缺陷型 NOD.SCID 小鼠，应特别小心。
  3. 从术前准备到手术结束的整个实验过程均应在生物安全一级柜中进行。
  4. 手术前称量一只 6–8 周龄的 NOD.SCID 小鼠体重。本研究使用体重在 14–18 g 之间的小鼠。
  5. 使用毛发修剪器剃除小鼠上腹部中央及季肋区的毛发。用刮刀将脱毛膏均匀涂抹于该区域，彻底清除已剪短的毛发。2–5 分钟后，用一块湿润的无菌棉球轻轻擦去残留毛发。
  6. 将小鼠放入异氟烷麻醉舱，打开氧气瓶阀门。维持氧气流速为 4 L/min，异氟烷挥发浓度为 4%，以诱导麻醉。
    1. 通过轻捏脚趾确认小鼠已充分麻醉。
  7. 在生物安全柜内放置手术板。将动物置于手术板上，使其腹部朝上，头部前端插入连接异氟烷和氧气供应系统的鼻罩中。
  8. 将异氟烷挥发浓度降至 2%，并在整个手术过程中维持此浓度。
  9. 用浸有 70% 乙醇的无菌棉球擦拭小鼠皮肤，进行皮肤消毒和灭菌。

2. 手术步骤

  1. 部分肝切除术
    1. 使用直头手术剪在胸骨下方约1 cm处的皮肤上做一横向切口，切口方向垂直于剑突，与肋骨平行。
    2. 用镊子或无菌湿润棉签轻轻分离切口附近与腹肌层相连的皮肤，以区分皮肤与腹肌层。使用无菌棉签将PBS滴加至皮下区域，防止干燥。
    3. 在剑突下方的腹膜层做一横向切口，充分暴露左肝叶。使用两个湿润棉签暴露并轻轻抬起肝脏左叶。
    4. 将一根棉签置于切口腹侧，另一根置于膈肌侧。轻压朝向膈肌的棉签，同时用另一根棉签向滑动方向推动，以抬起肝脏左叶。
    5. 将带环的尼龙线从抬起的左肝叶中穿过，并借助显微镊或棉签将线环滑向靠近肝门的左叶基部。轻轻将尼龙线环推至左叶基部。
    6. 使用显微外科持针器和显微镊在左叶上方打结固定尼龙线两端，并在另一侧再打两个结加固。
    7. 使用剪刀将已结扎的肝叶切除。注意不要紧贴结扎线剪切。若手术操作时间超过5分钟，需定期用无菌PBS湿润腹腔及器官，防止因液体流失导致组织干燥。
    8. 使用4-0肠线连续缝合腹膜。随后尽快使用间断缝合法缝合皮肤。
  2. 细胞移植
    注：表达GFP的肝细胞根据Lee et al.22 和Shen et al.23 描述的方法，从转基因GFP小鼠（C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J）中分离获得。此外，也使用了来源于单核细胞分化的人源肝样细胞（NeoHep）24 进行移植。然而，本方案中也可使用其他来源的细胞。
    1. 将约0.2×10⁶个活细胞悬浮于约50 µL的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中，吸入配有30G针头的1 mL胰岛素注射器内。将注射器置于冰上保持低温。
    2. 将小鼠摆放成左侧朝上，便于术者操作。确定脾区位置，在季肋区附近横向切开皮肤，随后在腹膜层做一小切口，以暴露脾脏。
    3. 轻轻抬起脾脏，并用两根PBS湿润的棉签将其固定于腹腔外。
    4. 一手用两根棉签小心固定脾脏，另一手持注射器，使针头与脾脏表面完全垂直。轻柔穿刺脾脏，并缓慢将针头推入，深度不得超过2 mm。
    5. 缓慢推动注射器活塞，将细胞注入脾脏。移植完成后，保持针头静止，缓慢拔出，以避免出血或细胞流失。
    6. 用棉签将脾脏放回腹腔后，使用4-0肠线连续缝合腹膜层，并用相同缝线间断缝合皮肤。避免使用伤口夹闭合皮肤，应采用4-0缝线缝合。伤口夹会限制小鼠的自然活动，且常因松动而脱落。

3. 术后护理

  1. 缝合皮肤后，使用无菌棉签蘸取碘溶液（聚维酮碘）擦拭缝合部位周围的区域。
  2. 使用1 mL注射器，按600 mg/kg体重剂量（通常为每只小鼠100 µL生理盐水中含12 mg头孢噻肟）经腹腔注射抗生素头孢噻肟。
  3. 术后最多连续三天，每天经腹腔给予镇痛剂美洛昔康，剂量为1 mg/kg体重（通常为每只小鼠100 µL生理盐水中含12 µg美洛昔康）。
  4. 手术完成后，停止异氟烷气体的供应，并将小鼠放回独立通风的笼具中。

4. 安乐死与表征

  1. 在实验终点（术后1天和10天），根据机构动物伦理指南对小鼠实施安乐死。
  2. 通过眼球终末丛穿刺，对动物进行终末放血以采集血液。
  3. 从血液中分离血清。

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结果

30% 肝部分切除术后肝细胞增殖：通过细胞增殖标志物 Ki-67 的免疫组织化学（IHC）染色，检测小鼠 30% 肝部分切除术后残余肝脏中肝细胞的增殖情况。术后第 1 天处死小鼠，切除残余肝叶并制备石蜡切片。切片经 Ki-67 抗体孵育后，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行显色，以二氨基联苯胺（DAB）作为 HRP 的底物产生棕色信号以识别阳性染色细胞。细胞核使用苏木精复染，并在 20X 物镜下观察。图 1 显示了肝脏切片的代表性 IHC 图像。约 13% 的细胞（13.66 ± 0.317，N=3）呈 Ki-67 阳性，证实 30% 肝部分切除可促进小鼠肝脏中肝细胞的增殖。

解剖学研究：显示了NOD.SCID小鼠肝切除术后10天的肝脏代表性图像（见图2）。该图像证实，残留肝脏健康，无可见异常。

手术后第一小时内移植细...

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讨论

部分肝切除术是研究肝脏再生的成熟技术，而大范围肝切除被报道可模拟急性肝衰竭（AHF）模型。在AHF的动物模型中，啮齿类动物尤其是小鼠是最常用的研究模型。为建立小鼠肝损伤模型，已有报道称实施高达70%的肝切除可获得较高的存活率25,26。然而，在裸鼠及其他免疫缺陷小鼠中，70%肝切除被报道具有致死性，动物在24小时内死亡27。

Mitchell 和 Willenbring28 报道了一种在小鼠中可重复且耐受性良好的三分之二部分肝切除方法。对于 NOD.SCID 小鼠，当肝切除范围限制在左肝叶切除（约占总肝质量的 30%）时，我们获得了 100% 的存活率。与裸鼠的观察结果一致27，我们发现，在 NOD.SCID 小鼠中，若肝切除比例进一步增加，将导致存活率显著下降。此外，在 30% 部分肝切除术后 1 天，残余肝叶肝细胞的增殖...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心资助。Bhattacharjee 博士目前的单位是洛杉矶儿童医院胃肠病学、肝病学和营养科。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
气体麻醉系统Ugo Basile；意大利211000
体重秤Goldtech；印度本地采购
生物安全柜（I级）Kartos国际；  印度本地采购
理发剪松下  日本 ER-GY10 
直柄手术剪，刃口锋利/双锋Major Surgicals；印度本地采购
带锯齿的镊子Major Surgicals；印度本地采购
微针持针器  直的 &和弯曲的 麦西亚人  英格兰 BS-13-8
1 ml 胰岛素注射器，配 30G × 5/16 针头 一次性运输车；印度
1 ml 注射器配 26 G × 1/2 针头BD；美国 REF 303060
尼龙线  强大；印度(1-0) 本地采购
MERSUTURES 4-0 无菌手术缝合针线Ethicon, Johnson & Johnson，印度NW 5047
TRUGUT 76 厘米 4-0 可吸收外科缝线Sutures India Pvt. Ltd；印度SN 5048无菌外科缝合针，铬制肠线
棉签Pure Swabs Pvt Ltd  印度本地采购
手术胶带3M 印度；印度1530-1微孔手术胶带
切片机意大利 Histo-Line LaboratoriesMRS3500
Shandon Cryotome E 冷冻切片机Thermo Electron Corporation；美国
共聚焦激光扫描显微镜卡尔·蔡司；德国 LSM 510 META
明场显微镜日本 OlympusLX51
自动分析仪郁金香，阿尔托桑特拉克鲁斯，印度Screen Maaster 3000用于肝功能检测的生化分析仪
流式细胞仪BD；美国 BD FACSverse移植后细胞存留情况的评估
Veet 脱毛膏 Reckitt Benckiser，印度
FORANE雅培；美国异氟烷 USP 99.9% 
TaximAlKem；印度头孢噻肟钠注射液
聚维酮碘溶液 Win-Medicare  印度聚维酮碘
多聚甲醛Himedia；印度GRM 3660
Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）Life technologies，Thermo Fisher scientific；美国12200-036
蔗糖Sigma；美国S0389
Tissue-TekSakura；美国25608-930O.C.T. 化合物
DAPIHimedia；印度MB 097
抗白蛋白山羊多克隆抗体赛默飞世尔科技，Pierce，美国PA126081
抗连接蛋白32/GJB1多克隆抗体abcam，英国ab64609-500
抗GFP兔多克隆抗体 Santa Cruz 生物技术公司；美国SC 8334
Alexa Fluor 594 驴抗山羊 Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；  美国A11058
Alexa Fluor 488 驴抗羊 Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；  美国A11015
Alexa Fluor 594 鸡抗兔 Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific；  美国A21442
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgGInvitrogen，Thermo Fisher Scientific；美国 65-6120
抗Ki67抗体abcam，英国ab15580
抗原修复液，柠檬酸基Vector Laboratories，美国H-3300
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂Life technologies，Thermo Fisher scientific；美国P36966
SGOT（ASAT）试剂盒印度珊瑚临床系统
SGPT（ALAT）试剂盒印度珊瑚临床系统
碱性磷酸酶检测试剂盒（DEA）印度珊瑚临床系统
迈耶氏苏木精溶液Sigma；美国MHS16
伊红Y醇溶液Sigma；美国HT110132
DPX封片剂 Sigma；美国6522
美洛昔（止痛药）Intas Pharmaceuticals Ltd；印度美洛昔康注射液 
DAB增强型液体底物系统四盐酸盐Sigma；美国D3939

参考文献

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