本实验方案是一种高脂饮食喂养方法，用于诱导Drosophila（果蝇）肥胖，以研究与脂毒性相关的基础分子机制。同时，本方案还提供了一种高通量的三酰甘油检测方法，可用于在不同饮食、环境、遗传或生理条件下，测定Drosophila及其他（昆虫）模型中的脂肪积累情况。
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摘要
摘要
心脏病是全球人类死亡的首要原因。大量研究表明，肥胖与人类心脏功能障碍之间存在密切关联，但要更深入阐明其中涉及的机制，仍需更多工具和研究投入。一个多世纪以来，遗传上高度可操作的模式生物果蝇（Drosophila）在发现关键基因和分子通路方面发挥了重要作用，这些基因和通路在不同物种间高度保守。许多生物学过程和疾病机制在果蝇中具有功能上的保守性，例如发育（例如，体轴模式、心脏）、癌症以及神经退行性疾病。近年来，对模式生物中肥胖及其继发性病理（如心脏病）的研究，在识别与人类代谢综合征相关的关键调控因子方面发挥了极为关键的作用。
在此，我们建议将该模式生物作为一种有效工具用于诱导肥胖， 即，过量脂肪积累，并建立一种高效监测以甘油三酯（TAGs）形式积累的脂肪含量的方案。果蝇除了具有高度保守但相对简单的基因组外，还具有较短的寿命，便于快速开展实验，且成本低廉。本文提供了一种高脂饮食（HFD）喂养的详细实验方案 果蝇 通过诱导肥胖并采用高通量三酰甘油（TAG）检测方法来测量脂肪含量的相应增加，旨在实现高度可重复性和高效性，适用于大规模的遗传学或化学筛选。这些实验方案为高效研究肥胖相关调控机制提供了新的机会，同时也为药物发现研究提供了标准化平台，可用于快速测试候选药物对肥胖、糖尿病及相关代谢性疾病发生或预防的影响。
引言
我们正处在一个肥胖及其相关经济负担成为全球性问题的时代1。每三个美国人中就有两个超重或肥胖，并伴有相关的心脏病理问题，而心血管疾病是成年人群死亡的首要原因2。为了充分研究代谢综合征调控中涉及的遗传和分子组分，亟需开发高效的新方法，并利用模式生物进行探索。因此，我们选择果蝇 Drosophila 作为模型，因为它与哺乳动物（包括小鼠和人类）共享最基本的生物学过程3,4,5,6。Drosophila 的基因组在进化过程中高度保守，但总体上更小，基因重复较少，代谢也更为简单，这使其成为研究多种人类疾病基本机制的理想模型4,7,8。此外，果蝇体内也存在类似于脂肪组织、肠道和胰腺所执行的特征性生理过程，并在葡萄糖和脂质代谢等调节功能中发挥与人类相似的作用9,10,11。更重要的是，人类肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病调控中涉及的基本分子通路在 Drosophila melanogaster 中功能上是保守的12,13,14,15,16。与高等生物类似，Drosophila 拥有跳动的心脏，其发育过程与哺乳动物心脏的形成过程相似3,17。因此，建立一种可靠的高脂饮食（HFD）喂养方案以及适用于高效筛选的高通量TAG检测方法，并结合 Drosophila 的遗传工具箱，为研究和理解复杂代谢性疾病的遗传基础提供了重要手段。
高脂饮食（HFD）本身由标准的实验室果蝇食物添加椰子油制成，而椰子油主要由已知与代谢综合征相关的饱和脂肪酸组成18。在哺乳动物模型（如啮齿类动物）中诱导肥胖可能需要数月时间19,20，而我们在Drosophila中优化的高脂饮食喂养方案可在数天内有效且可重复地增加个体的脂肪含量12,14。该方案结合高通量TAG检测，可高效地大规模筛选遗传因素、环境影响及药物候选物对脂肪代谢的调节作用，从而发现新的脂肪代谢调控因子。因此，这些方案可能有助于理解及/或防治肥胖及其相关的人类疾病。
喂养方案具有多功能性，可用于研究单一饱和或不饱和脂肪酸的代谢和功能效应。这种高通量TAG检测方法的应用不仅限于 D. melanogaster，但可适用于多种具有角质层或坚韧细胞外基质的小型模式生物（例如，其他 黑腹果蝇 物种， 秀丽隐杆线虫 以及其它新兴无脊椎动物模式生物）在不同环境、遗传或生理条件下，于发育、成年或代谢疾病任一阶段测量脂肪含量。TAG 检测基于比色法测定一系列酶促反应，这些反应将 TAG 降解为游离脂肪酸、甘油、甘油-3-磷酸，最终生成 H2O2 与4-氨基安替比林（4-AAP）和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠（3,5 DHBS）反应生成红色产物，使用96孔分光光度计测定。
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方案
1. 高脂饮食喂养方案
表1. 果蝇食物配方。
本表格总结了用于制备对照食物的不同成分。配制完成后，将10 mL食物倒入试管中，冷却后于4 °C长期保存。
- 高脂饮食（HFD）的制备
- 配制1 kg高脂食物时，使用分析天平分别称取700 g预制成的普通果蝇食物（见表1）和300 g椰子油，放入两个独立的容器中。
- 将每个容器分别放入微波炉中加热，直至内容物完全融化。将融化的椰子油倒入果蝇食物容器中，用打蛋器搅拌，直至椰子油与果蝇食物充分混合。
注意：混合物中不应有可见的食物块或油滴。微波加热果蝇食物时，每隔1分钟暂停一次，搅拌食物以防止沸腾溢出。 - 重新称量高脂食物的总重量。如果总重量小于1 kg（700 g食物 + 300 g椰子油），则加入约10 mL水，以补偿加热过程中蒸发的水分，并使总重量恢复至1 kg。
- 每支试管中倒入约10 mL充分混合的高脂食物（约占试管体积的25%）。随后用纱布覆盖管口，防止果蝇污染。在室温下冷却1小时，然后将试管转移至4 °C保存，可保存长达4周。
注意：普通食物（NF）作为对照食物使用，每支试管也倒入10 mL（约占试管体积的25%）NF。对于高脂饮食（HFD）组，用椰子油替代30%的NF食物。在对照和实验条件下，果蝇所给予的NF和HFD食物量相同（每管10 mL食物）。
图1高脂饮食喂养在 果蝇.
该示意图展示了果蝇在对照食物（正常饮食，未添加椰子油-NF）或高脂饮食（HFD，添加椰子油）下的不同喂养步骤。整个过程在初次收集成年果蝇后持续10天。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 高脂饮食喂养 D. melanogaster
注意：本方案包含适用于任何果蝇品系的对照食物和高脂饮食（HFD）喂养程序。对照组和实验组果蝇分别置于含有相同数量食物（正常食物或HFD）的试管中。- 使用 CO2 使果蝇麻醉。
注意：初学者请阅读参考文献21 关于饲养与处理的概述 D. melanogaster. - 从试管中收集0-5天龄的果蝇，通过翻转将果蝇转移至含有NF培养基（预先在室温下温育）的新试管中。将果蝇在25°C、60%湿度条件下继续培养5天 21 °C.
- 5天结束后，取出含有HFD和NF的样品管 4 °C.
注意：由于低温可能对活体果蝇造成应激，使用前请将试管置于室温下静置30分钟，使其升温。 - 使用擦拭纸清洁小瓶侧面并去除多余的液体。
- 将一小片约1 cm × 3 cm的滤纸插入高脂肪食物中，以吸收多余的液体。
注意：此步骤对于防止果蝇粘附在高脂食物上至关重要。 - 接下来，将果蝇转移至高脂食物上（通过翻转）。将试管水平侧放（不要直立），置于21-22 °C 5天。
注意：避免较高温度，因为这可能导致高脂肪食物部分融化，使果蝇粘附在食物上而死亡。 - 5 天后，将正常饲料（NF）和高脂饲料（HFD）中的果蝇翻转转移到无食物的新离心管中，使其肠道排空 30 分钟。随后，进行果蝇称重。
注意：本高脂饮食（HFD）喂养方案的关键步骤之一是制备混合均匀的HFD，确保无果蝇食物块或油相凝聚物。需充分均质混合，并将HFD冷却至45-30 °C 建议在将食物倒入小瓶并储存之前 4 °C对照组与实验组果蝇的年龄匹配非常重要，且在高脂饮食（HFD）喂养前应严格控制营养和环境条件。在喂养阶段，对照组和实验组果蝇必须接受等量的正常饮食（NF）和高脂饮食（HFD）。切勿从过度拥挤的试管或瓶子中收集果蝇（以避免跨代效应）。在NF和HFD喂养期间，每支试管中放置的果蝇数量不得超过25只，以防止饮食限制或其他拥挤效应。HFD由30%椰子油组成，因此温度高于 22 °C 可能会部分融化高脂饮食（HFD），导致果蝇粘附在油性食物上而死亡。在将果蝇转移至HFD之前，应清洗小瓶以去除残留油脂，并插入滤纸以吸收食物中多余的液体。果蝇在HFD上孵育期间，需将小瓶侧放，为果蝇提供一个无脂肪的水平表面。
- 使用 CO2 使果蝇麻醉。
- 称量果蝇
- 对于每种待测基因型和性别，使用超敏天平记录预先标记的空1.7 mL离心管的重量。
- 使用果蝇麻醉剂或 CO2麻醉后，用毛刷将36只相同基因型、性别和饲喂状态的果蝇收集至一个预先称重的1.7 mL离心管中。
- 使用相同的超灵敏天平称量含有果蝇的管子。
- 根据以下公式计算果蝇的平均重量：
注意：本方案中果蝇的数量为36只。 - 将装有果蝇的1.7 mL离心管浸入液氮中2分钟，进行速冻。收集并放入管盒中。随后将管盒转移至-80 °C （建议储存温度）用于储存，直至进行TAG检测时使用。
警告：液氮温度极低，请使用适当的个人防护装备。
2. TAG 检测
- 甘油三酯（TAG）标准品浓度的配制
- 配制 500 mL 的 PBT 缓冲液（PBS 1×，含 0.05% Triton）。
- 使用 0.5 mL 离心管和甘油三酯（TAG）溶液（材料表），用 PBT 缓冲液配制 100 µL 空白对照（仅含 PBT）以及 100 µL 的六种标准 TAG 浓度（2 µg/µL；1 µg/µL；0.5 µg/µL；0.25 µg/µL；0.125 µg/µL；0.0625 µg/µL）。
- 将离心管置于冰上，并立即开始研磨果蝇。
- 果蝇研磨
- 从 -80 °C 冰箱中取出冷冻的果蝇（见步骤 1.3），并将装有果蝇的离心管转移至冰上。
- 首先，将 2 mm 金属研磨珠放入 96 孔研磨珠分配器中，使用小毛刷去除多余的研磨珠。
- 将 96 孔研磨板倒置在研磨珠分配器上方，翻转以使金属珠直接落入研磨板的各孔中，确保每孔含有一颗研磨珠。
- 使用多通道移液器，向 96 孔研磨板的每一行各孔中加入 600 µL 的 PBT 缓冲液。
- 使用镊子向每孔中加入 3 只果蝇。在 96 孔研磨板的每一行/孔中标注果蝇的基因型、性别及食物处理条件。
- 将盖子紧密盖在 96 孔研磨板上，必要时可在顶部用封口膜密封，以防泄漏。
- 将 96 孔研磨板正确放入研磨仪中，将仪器调至最高速度，按下“运行”键，研磨 3 分钟。
- 研磨 3 分钟后停止，随后进行离心：在 4 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 15 分钟。离心后小心操作研磨板，避免上清液与沉淀混合。
- 样品加样与甘油三酯（TAG）含量测定
- 取一个新的 96 孔比色板。使用多通道移液器，向每行各孔中加入 200 µL 的 TAG 试剂。
- 向第一行第一孔中加入 20 µL 的 PBT 缓冲液作为空白对照。通过上下吹打混匀，避免产生气泡。
- 向第一行其余各孔中分别加入 20 µL 的各标准品稀释液（来自步骤 2.1.2），并通过上下吹打混匀，避免产生气泡。
- 使用多通道移液器，将研磨板中每行的上清液各 20 µL 转移至 96 孔比色板的对应行中。通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。
- 随后，在 96 孔板上方覆盖一层透气封板膜。
- 将 96 孔板在 37 °C 下孵育 10 分钟。
注：若孔中有气泡，需以 2,000 × g 离心 2 分钟以去除所有气泡。气泡的存在会影响吸光度读数。 - 使用兼容的酶标仪在 550 nm 波长下读取各孔的吸光度值。随后绘制标准曲线，并确定未知样品的浓度 [µg/µL]。
- 为计算每只果蝇平均体重中的 TAG 含量，请使用以下公式：
注：在本实验方案中，3 只果蝇在 600 µL PBT 中被研磨，因此每只果蝇的平均体积为 200 µL。
- Bradford 法测定蛋白含量并以蛋白含量归一化 TAG 含量
- 使用 PBT 缓冲液配制七种牛血清白蛋白（BSA）标准品稀释液，每种 100 µL（75 µg/mL；100 µg/mL；150 µg/mL；200 µg/mL；250 µg/mL；500 µg/mL；1,000 µg/mL）。
- 取一个新的 96 孔板，使用多通道移液器向每行各孔中加入 200 µL 的 1× Bradford 试剂。
- 在第一行第一孔中加入 10 µL 的 PBT 缓冲液作为空白对照。通过上下吹打混匀，避免产生气泡。
- 向第一行其余各孔中分别加入 10 µL 的各标准品稀释液，并通过上下吹打混匀，避免产生气泡。
- 使用多通道移液器，将研磨板中每行的果蝇上清液各 10 µL 转移至 96 孔板的对应行中。通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。
- 在 96 孔板上方覆盖一层透气封板膜。
- 在室温下孵育 5 分钟。若孔中有气泡，需以 2,000 × g 离心 2 分钟以去除气泡。
注：气泡的存在会影响吸光度读数。 - 使用分光光度计在 595 nm 波长下读取空白对照、标准品及未知样品的吸光度值。利用标准曲线确定每行样品的浓度 [µg/µL]。
- 使用以下公式，以蛋白含量对 TAG 含量进行归一化：
![生化分析中蛋白相对TAG含量的计算公式，[TAG]/[Protein] 比值公式。](/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg "figure-protocol-5")
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结果
在D. melanogaster中，与其他物种一样，雄性和雌性之间存在性二型性22。众所周知，雌性个体体型较大，腹部脂肪含量高于雄性22。为了验证我们实验方案的有效性，我们进行了甘油三酯（TAG）检测，以确定标准实验室野生型（w1118）果蝇雌雄个体之间TAG含量的差异。结果显示，雌性果蝇的整体脂肪含量高于雄性（图2A, B）。数据还表明，该检测方法具有良好的稳定性，在孵育后长达50分钟内TAG定量结果无变化，且不因生物样本数量（3只或5只果蝇）不同而产生差异。
HFD 摄入已被证明可导致人类和小鼠肥胖19,
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讨论
小鼠肥胖诱导可能需要数月时间19,20在果蝇中，该高脂饮食喂养方案可在数天甚至更短时间内诱导脂肪过度积累，仅在18小时后即可观察到脂肪积累增加（参见 图2）。采用所述方案进行HFD喂养可增加葡萄糖含量 12 并减少 Bmm 脂酶和PGC-1表达24。这与成年个体的禁食情况相反 果蝇 导致脂肪和葡萄糖含量迅速下降25,26 且增加 Bmm 表达24。此外，升高 Bmm 或 PGC-1 水平可抵御高脂饮食诱导的肥胖14,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Erika Taylor对本文稿的编辑。本研究由美国国立卫生研究院向R.B.提供的资助（P01 HL098053、P01 AG033561和R01 HL054732）、向S.B.D.提供的博士后研究补充资助（R01 HL085481）和奖学金（AAUW），以及美国心脏协会向S.B.D.和R.T.B.提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塔尔博伊兹球形滴管/珠子分配器 | Talboys | #: 930150 | |
| 塔尔博伊兹高通量均质仪 | Talboys | #: 930145 | |
| 研磨珠，不锈钢 | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 颗珠子 |
| 96 孔深孔微孔板，Masterblock | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | 每箱 80 块板 |
| Greiner 96 孔平底微孔板 | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 块板 |
| Greiner 多孔板密封盖膜 | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 片密封膜 |
| 试剂储液槽 | Thomas Scientific | # 1192T71 | 每包 12 个 |
| 赛默飞世尔 Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 µL 多通道移液器 |
| 赛默飞世尔 Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300 µL 多通道移液器 |
| 赛默飞世尔 Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100 µL 多通道移液器 |
| 多通道移液器吸头 | Denville Scientific Inc | # P3131-S | 适用于 10 µL 移液器 |
| 多通道移液器吸头 | Denville Scientific Inc | # P3133-S | 适用于 200 µL 移液器 |
| 多通道移液器吸头 | Denville Scientific Inc | #P1125 | 适用于 100 µL 移液器 |
| 镊子 | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | 超细镊子 |
| 梅特勒托利多 Excellence XS 分析天平，制造商编号 XS64 | Cole-Parmer 科学专家 | # EW-11333-00 | |
| 梅特勒托利多 Excellence XS 顶部加载天平 | Cole-Parmer 科学专家 | # EW-11333-49 | |
| 96 孔微孔板离心机 | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| 微孔板读板仪 | Molecular Devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line 台式轨道环境摇床培养箱 | Biostad | # 3527 | |
| Infinity 甘油三酯试剂 | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| 甘油三酯标准品 | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford 蛋白检测试剂盒 | Bio-RAD | # 500-0205 | 1 倍染料试剂 |
| 椰子油 | Nutiva | # 692752200014 | 15 盎司罐装 |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| 透气箔膜 | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 片 |
| 滤纸 | VWR | # 28317-241 | 每包 100 张 |
| 果蝇培养管 | Genesee Scientific | 货号 #: 32-116SB | |
| Quick Start 牛血清白蛋白标准品 | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap 麻醉剂 | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes 低尘擦拭纸 | Uline | # S-8115 | 单层，4.4 x 8.4" |
参考文献
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38(2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587(2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673(2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175(2013).
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