本实验方案是一种高脂饮食喂养方法，用于诱导Drosophila（果蝇）肥胖，以研究与脂毒性相关的基础分子机制。同时，本方案还提供了一种高通量的三酰甘油检测方法，可用于在不同饮食、环境、遗传或生理条件下，测定Drosophila及其他（昆虫）模型中的脂肪积累情况。
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本文内容
摘要
摘要
心脏病是全球人类死亡的首要原因。大量研究表明，肥胖与人类心脏功能障碍之间存在密切关联，但要更深入阐明其中涉及的机制，仍需更多工具和研究投入。一个多世纪以来，遗传上高度可操作的模式生物果蝇（Drosophila）在发现关键基因和分子通路方面发挥了重要作用，这些基因和通路在不同物种间高度保守。许多生物学过程和疾病机制在果蝇中具有功能上的保守性，例如发育（例如，体轴模式、心脏）、癌症以及神经退行性疾病。近年来，对模式生物中肥胖及其继发性病理（如心脏病）的研究，在识别与人类代谢综合征相关的关键调控因子方面发挥了极为关键的作用。
在此，我们建议将该模式生物作为一种有效工具用于诱导肥胖， 即，过量脂肪积累，并建立一种高效监测以甘油三酯（TAGs）形式积累的脂肪含量的方案。果蝇除了具有高度保守但相对简单的基因组外，还具有较短的寿命，便于快速开展实验，且成本低廉。本文提供了一种高脂饮食（HFD）喂养的详细实验方案 果蝇 通过诱导肥胖并采用高通量三酰甘油（TAG）检测方法来测量脂肪含量的相应增加，旨在实现高度可重复性和高效性，适用于大规模的遗传学或化学筛选。这些实验方案为高效研究肥胖相关调控机制提供了新的机会，同时也为药物发现研究提供了标准化平台，可用于快速测试候选药物对肥胖、糖尿病及相关代谢性疾病发生或预防的影响。
引言
我们正处在一个肥胖及其相关经济负担成为全球性问题的时代1。每三个美国人中就有两个超重或肥胖，并伴有相关的心脏病理问题，而心血管疾病是成年人群死亡的首要原因2。为了充分研究代谢综合征调控中涉及的遗传和分子组分，亟需开发高效的新方法，并利用模式生物进行探索。因此，我们选择果蝇 Drosophila 作为模型，因为它与哺乳动物（包括小鼠和人类）共享最基本的生物学过程3,4,5,6。Drosophila 的基因组在进化过程中高度保守，但总体上更小，基因重复较少，代谢也更为简单，这使其成为研究多种人类疾病基本机制的理想模型4,7,8。此外，果蝇体内也存在类似于脂肪组织、肠道和胰腺所执行的特征性生理过程，并在葡萄糖和脂质代谢等调节功能中发挥与人类相似的作用9,10
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方案
1. 高脂饮食喂养方案
表1. 果蝇食物配方。
本表格总结了用于制备对照食物的不同成分。配制完成后，将10 mL食物倒入试管中，冷却后于4 °C长期保存。
- 高脂饮食（HFD）的制备
- 配制1 kg高脂食物时，使用分析天平分别称取700 g预制成的普通果蝇食物（见表1）和300 g椰子油，放入两个独立的容器中。
- 将每个容器分别放入微波炉中加热，直至内容物完全融化。将融化的椰子油倒入果蝇食物容器中，用打蛋器搅拌，直至椰子油与果蝇食物充分混合。
注意：混合物中不应有可见的食物块或油滴。微波加热果蝇食物时，每隔1分钟暂停一次，搅拌食物以防止沸腾溢出。 - 重新称量高脂食物的总重量。如果总重量小于1 kg（700 g食物 + 300 g椰子油），则加入约10 mL水，以补偿加热过程中蒸发的水分，并使总重量恢复至1 kg。
- 每支....
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结果
在D. melanogaster中，与其他物种一样，雄性和雌性之间存在性二型性22。众所周知，雌性个体体型较大，腹部脂肪含量高于雄性22。为了验证我们实验方案的有效性，我们进行了甘油三酯（TAG）检测，以确定标准实验室野生型（w1118）果蝇雌雄个体之间TAG含量的差异。结果显示，雌性果蝇的整体脂肪含量高于雄性（图2A, B）。数据还表明，该检测方法具有良好的稳定性，在孵育后长达50分钟内TAG定量结果无变化，且不因生物样本数量（3只或5只果蝇）不同而产生差异。
HFD 摄入已被证明可导致人类和小鼠肥胖19,
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讨论
小鼠肥胖诱导可能需要数月时间19,20在果蝇中，该高脂饮食喂养方案可在数天甚至更短时间内诱导脂肪过度积累，仅在18小时后即可观察到脂肪积累增加（参见 图2）。采用所述方案进行HFD喂养可增加葡萄糖含量 12 并减少 Bmm 脂酶和PGC-1表达24。这与成年个体的禁食情况相反 果蝇 导致脂肪和葡萄糖含量迅速下降25,26 且增加 Bmm 表达24。此外，升高 Bmm 或 PGC-1 水平可抵御高脂饮食诱导的肥胖14,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Erika Taylor对本文稿的编辑。本研究由美国国立卫生研究院向R.B.提供的资助（P01 HL098053、P01 AG033561和R01 HL054732）、向S.B.D.提供的博士后研究补充资助（R01 HL085481）和奖学金（AAUW），以及美国心脏协会向S.B.D.和R.T.B.提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塔尔博伊兹球形滴管/珠子分配器 | Talboys | #: 930150 | |
| 塔尔博伊兹高通量均质仪 | Talboys | #: 930145 | |
| 研磨珠，不锈钢 | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 颗珠子 |
| 96 孔深孔微孔板，Masterblock | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | 每箱 80 块板 |
| Greiner 96 孔平底微孔板 | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 块板 |
| Greiner 多孔板密封盖膜 | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 片密封膜 |
| 试剂储液槽 | Thomas Scientific | # 1192T71 | 每包 12 个 |
| 赛默飞世尔 Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 µL 多通道移液器 |
| 赛默飞世尔 Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300 µL 多通道移液器 |
| 赛默飞世尔 Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100 µL 多通道移液器 |
| 多通道移液器吸头 | Denville Scientific Inc | # P3131-S | 适用于 10 µL 移液器 |
| 多通道移液器吸头 | Denville Scientific Inc | # P3133-S | 适用于 200 µL 移液器 |
| 多通道移液器吸头 | Denville Scientific Inc | #P1125 | 适用于 100 µL 移液器 |
| 镊子 | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | 超细镊子 |
| 梅特勒托利多 Excellence XS 分析天平，制造商编号 XS64 | Cole-Parmer 科学专家 | # EW-11333-00 | |
| 梅特勒托利多 Excellence XS 顶部加载天平 | Cole-Parmer 科学专家 | # EW-11333-49 | |
| 96 孔微孔板离心机 | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| 微孔板读板仪 | Molecular Devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line 台式轨道环境摇床培养箱 | Biostad | # 3527 | |
| Infinity 甘油三酯试剂 | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| 甘油三酯标准品 | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford 蛋白检测试剂盒 | Bio-RAD | # 500-0205 | 1 倍染料试剂 |
| 椰子油 | Nutiva | # 692752200014 | 15 盎司罐装 |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| 透气箔膜 | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 片 |
| 滤纸 | VWR | # 28317-241 | 每包 100 张 |
| 果蝇培养管 | Genesee Scientific | 货号 #: 32-116SB | |
| Quick Start 牛血清白蛋白标准品 | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap 麻醉剂 | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes 低尘擦拭纸 | Uline | # S-8115 | 单层，4.4 x 8.4" |
参考文献
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from:
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