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方法文章

基于CRISPR/Cas9的原始生殖细胞移植实现育种跨越式发展 非洲爪蟾

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DOI：

10.3791/56035

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2018年2月1日

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

本文内容

摘要

对生存至关重要的基因在创建突变品系时会带来技术上的困难。跳跃式基因编辑技术通过将基因组编辑与原始生殖细胞移植相结合，可绕过致死效应，从而产生携带生殖系突变的野生型动物。该技术还能够在F1代高效地生成纯合无效突变体。本文展示了其中的移植步骤。

摘要

通过基因组编辑创建突变品系正在加速多种生物的遗传学分析。CRISPR/Cas9 技术已应用于非洲爪蟾， 非洲爪蟾，长期以来作为生物医学研究的模式生物。利用CRISPR/Cas9靶向诱变技术创建纯合突变品系的传统育种方案包含多个耗时且劳动密集的步骤。为促进突变胚胎的制备，特别是克服在敲除对胚胎发育至关重要的基因时所面临的困难，研究人员开发了一种名为“跳跃式遗传”（leapfrogging）的新方法。该技术利用了 非洲爪蟾 胚胎至 "剪切并粘贴" 胚胎学方法。Leapfrogging 技术利用将高效诱导突变的供体胚胎中的原始生殖细胞（PGCs）移植到经 PGC 消除处理的野生型同胞受体胚胎中。该方法通过构建体细胞为野生型而生殖系携带突变的嵌合个体，实现对必需基因的高效突变。当两个 F0 携带的动物 "跳跃式移植" (即， 突变的生殖细胞相互杂交后，会产生纯合子或复合杂合子的无效F1 胚胎，从而节省整整一个世代的时间来获取表型数据。Leapfrogging 还为分析母体效应基因提供了新方法，这类基因对传统的 F0 CRISPR/Cas9诱变后的表型分析。本文详细描述了跳跃式克隆（leapfrogging）方法，重点阐述如何成功进行原始生殖细胞（PGC）移植。

引言

自孟德尔定律被重新发现以来，基因型如何编码表型一直是生物学的核心问题。深入理解基因的作用、基因调控及其在基因网络中的相互作用，以及编码产物的功能，有望为揭示新的生物学机制和改善疾病状态提供有力工具。半个多世纪以来1，非洲爪蟾， 非洲爪蟾，长期以来一直是基础生物学和生物医学诸多领域研究的重要模式生物，包括发育的遗传调控。历史上，大多数关于 非洲爪蟾 已使用异源四倍体蛙， X. laevis但最近由于其二倍体特性， X. tropicalis 已开发为两栖类遗传学模型。已从两者中完成基因组序列的组装 非洲爪蟾 物种2,3。该 "蛙类群落" 正处于一个转折点，此时基础的基因组编辑技术已能够几乎随心所欲地研究基因功能。可编程的CRISPR/Cas9核酸酶使得基因诱变效率显著提高，且在大多数动物细胞中均可实现双等位基因突变4,5,6,7,8,9,10,11这些研究由 Bhattacharya 强调 等12 和 Shigeta 等13，已表明通过在 F 中进行诱变可研究许多基因的功能0 嵌合体动物。该方法具有诸多优势；然而，由于功能缺失（LOF）不完全，通过Cas9-sgRNA显微注射获得的胚胎常表现出表型变异。更为重要的是，在某些应用中建立突变品系具有显著优势——特别是当研究对象为存在母源mRNA贡献的基因时。母源mRNA和蛋白质及其对表观遗传的影响可在胚胎发育过程中持续较长时间14,15,16，使得许多基因在早期发育中的作用难以通过 F 研究0 分析。因此，需要其他LOF方法。

在构建突变品系时，获得纯合功能缺失（LOF）胚胎的过程存在多个障碍。首先，高效的诱变虽然可产生双等位基因突变，但可能导致必需基因功能丧失，从而使个体无法存活至性成熟，进而阻碍可育品系的建立。一个常见的解决方案是精确滴定所递送的Cas9-sgRNA的用量，其目标是在降低致死率的同时，最大限度地提高生殖系诱变效率。第二个问题源于标准的杂交策略，即表型分析需延迟至F2代才能进行。按照标准方法，将性成熟的F0代个体（其可通过生殖系传递突变等位基因）与野生型个体杂交，以产生F1代杂合"携带者"，再将后者培养至性成熟。随后将两只F1代杂合子个体进行互交，以期按照孟德尔遗传规律在F2代中获得25%的突变胚胎。因此，分析突变表型需要经过两代的繁育过程。所产生的突变个体可能是纯合子，也可能是复合杂合子（i.e., 携带两个不同突变等位基因的后代，具体取决于F1代互交亲本的基因型）。

通过将可编程核酸酶介导的诱变限制在生殖细胞中，可以克服上述障碍，这一策略构成了名为“leapfrogging”的新方法17。leapfrogging 包含两个主要步骤：（1）在单细胞阶段显微注射 Cas mRNA 与 sgRNA，或核酸酶-sgRNA 复合物（原则上也可使用 TALEN 或锌指核酸酶），以高效地对胚胎基因组进行诱变；随后（2）将原始生殖细胞（PGC）移植到野生型同胞胚胎中，而这些胚胎自身的内源性 PGC 已被去除。当这两个步骤均高效完成时，即可实现由突变生殖细胞完全替代生殖系。Blackler 在 20 世纪 60 年代初已证明，Xenopus 的 PGC 可在神经胚晚期至尾芽早期阶段在胚胎之间进行移植18,19。为了实现 leapfrogging，该方法被改进为在囊胚期进行移植17，此时 PGC 定位于胚胎的植物极20,21。在原肠胚形成之前进行移植具有两个主要优势。首先，实验发现，在囊胚期进行移植时，移植物的植入效率以及后续的正常发育能力更高（未发表观察结果）。其次，由于合子转录刚刚开始，此时进行囊胚期移植可避免因发育相关基因突变导致原肠胚形成受阻或神经胚形态异常而引起的胚胎致死。携带 PGC 移植物的（"leapfrogged"）胚胎被培育至性成熟，这些 F0 个体之间的互交实验表明，在多数情况下，100% 的 F1 后代均表现出功能缺失（LOF）表型（其中大多数为复合杂合子），说明目标突变已实现生殖系的完全替代。

预计跨越式发展将加速遗传学研究方法的进步 非洲爪蟾跳跃式发展也为 "宿主转移" 方法22 用于母体效应基因的功能缺失分析（未发表观察结果）. 在本文中，详细描述了该方法，特别是专注于原始生殖细胞移植的技术。 X. tropicalis （略作修改以适应） X. laevis). 此处展示的原始生殖细胞移植有助于将该技术更快地转移至其他从事相关研究的实验室 非洲爪蟾该方法的原理应可成功应用于其他两栖动物（例如， 有尾两栖类），并且对本方法进行物种特异性改良后，可应用于其他多种能够实现高效诱变且原始生殖细胞易于移植的动物。

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方案

本文所述所有方法均已获得加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 原始生殖细胞移植的准备工作

  1. 提前准备好解剖工具，方法如前所述。23.
    注意：进行手术时，使用眉毛刀片在毛发环的辅助下进行切口，以稳定胚胎。眉毛和毛发环需用胶粘在已用火焰拉制并在变细处折断的硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管上（参见 图1A，箭头）以形成更短、更窄的尖端（图1B) 以在进行手术时获得更高的灵巧性。
  2. 使用先前所述的方法生成sgRNA24 .
    注意：简而言之，使用包含5'噬菌体T7启动子的互补脱氧寡核苷酸退火生成编码sgRNA的短DNA模板， "已填写" 由一种无错配的耐热DNA聚合酶完成。 体外 sgRNA合成反应孵育数小时至过夜（具体时间取决于所用试剂盒）。反应产物经DNA酶处理以去除模板。根据试剂盒制造商的说明，sgRNA通过苯酚/氯仿抽提和乙酸铵/异丙醇沉淀等标准方法进行纯化。24.
  3. 在进行显微注射前不久，首先在3 µL无RNase（经焦碳酸二乙酯处理）的H₂O中变性约250 ng的sgRNA，制备Cas9-sgRNA复合物。2在60–65 °C下孵育5分钟，随后在冰上快速冷却5分钟。短暂离心sgRNA，加入1 µL浓度为1 µg/µL的Cas9蛋白，于37 °C孵育10分钟以促进复合物形成。
    注意：孵育后，可在准备胚胎进行显微注射时将试管置于冰上。
  4. 获取 X. tropicalis 胚胎的 体外 采用先前所述的标准方法进行受精25去胶25,26 受精后10分钟的胚胎。
    注意：受精时间是指将精子悬液加入卵子后，再向培养皿中加入1/9倍浓度的Marc's改良Ringer液（MMR）的时间点。26。对于 X. tropicalis25，与……不同 X. laevis，于含有3%半胱氨酸游离碱的1/9x MMR溶液中进行去胶处理（不 HCl盐），调节pH至7.8–8.0，随后用1/9× MMR多次洗涤。将胚胎转移至含有1/9× MMR的琼脂糖（1%）包被培养皿中，于室温下放置。
  5. 立即将待注射的胚胎用巴斯德吸管转移至含有1x MMR的1%琼脂糖包被的培养皿中。
  6. 在单细胞期进行显微注射。参见参考文献26,27 详细描述 非洲爪蟾 显微注射方法
    1. 在动物极的单一位置向每个胚胎注射4 nL Cas9-sgRNA复合物（最终含量为1 ng Cas9和约250 pg sgRNA；参见 讨论)24注射部位愈合10-20分钟后，将胚胎转移至含1/9x MMR的琼脂糖包被培养皿中，在25 °C下孵育。同时制备一皿未注射的同胞胚胎，作为移植受体。
  7. 准备含有约5 mm厚的1%琼脂糖层的培养皿（60 mm），琼脂糖使用0.3x MMR配制，用于移植实验 X. tropicalis，或1x MMR用于 X. laevis.
    1. 通过将一个由96孔PCR板切割制成的3×4孔模具插入倒板时的熔融琼脂糖中，形成约3–4 mm深的凹陷（参见 图1C 和 D用夹子将模具固定在铁架台上，使其位于培养皿底部上方几毫米处，直至琼脂糖凝固。
    2. 此外，制备一块24孔板用于单独培养胚胎，方法是在孔中包被一层由1/9× MMR配制的1%琼脂糖薄层。
      注意：加入这些孔中的培养基为1/9x MMR，添加50 µg/mL硫酸庆大霉素。

2. 原始生殖细胞的移植

  1. 当胚胎刚刚达到 Nieuwkoop 和 Faber28 的囊胚 9 期（图 2A）时，即 X. tropicalis 受精后约 4.5 小时（hpf），将其从 25 °C 培养箱中取出，并在室温下平衡额外 0.5 小时。
  2. 在 5 hpf 开始移植操作（图 2B）时，使用巴斯德移液管将一个 PGC 供体胚胎（已注射 Cas9-sgRNA）转移至含有凹陷结构（步骤 1.7 中制备）的 60 mm 琼脂糖培养皿中，培养基于 0.3x MMR（若使用 X. laevis 则为 1x MMR）。同时将一个未注射的同胞胚胎（即移植物受体）转移至该培养皿中。
    注意：必须确保不混淆每个胚胎的身份。
  3. 使用镊子手动去除每个胚胎的卵黄膜，并旋转两个胚胎，使其植物极朝上且便于手术操作。
    注意：胚胎手动去卵黄膜的方法已有文献描述26。
  4. 使用眉刀刀片的锋利尖端，在受体胚胎植物极上未来瓶状细胞（标志原肠胚孔形成位置）将出现的区域内部，做四个呈方形的浅层切口。操作时将眉刀尖端插入胚胎表面下方，同时用毛环稳定胚胎，并进行向上的切割动作。
    注意：图 2 显示了从 4.5 至 7.0 hpf 每半小时间隔的胚胎植物极视图，以展示细胞大小，并提供瓶状细胞可能形成位置的参考（白色虚线圆圈）。目标是在黑色虚线框所示位置进行切口。
  5. 当四个边的切口完成界定后，继续使用眉刀以相似的切割动作加深每条切口，深度约为到达囊胚腔底距离的 1/3 至 1/2。
  6. 通过在深部植物极区域进行水平（平行于植物极表面）切割，将植物极组织外植体从受体胚胎中分离（图 3A 和 B）。
    注意：含 PGC 的植物极外植体每边大小约为 0.4–0.45 mm，深度约为 0.25–0.3 mm。该来自受体胚胎的植物极外植体不再需要，应予以移除并丢弃。
  7. 迅速重复此操作（步骤 2.4–2.6）于 PGC 供体胚胎，制备一个尺寸相似的植物极组织片段用于移植。
    注意：第二次解剖应尽快完成，以尽量减少受体胚胎开放性伤口的愈合时间。
  8. 一旦含有 PGC 的组织从供体胚胎中取出，使用眉刀和毛环将该外植体移至受体胚胎的切口处并准确定位。
    注意：供体移植物的内表面必须朝向受体胚胎内部。无需匹配移植物与受体胚胎的背腹轴或左右轴方向。
  9. 将眉刀刀柄的长边平行于移植物表面，轻轻按压，使移植物嵌入受体胚胎植物极表面的切口内。
  10. 移植物放置到位后，使用毛环或眉刀刀柄轻轻推动供体胚胎的"残体"，使其沿琼脂糖表面滑入一个凹陷中。确保残体的开放性伤口朝向液体主体部分；若未达到此方向，使用眉刀旋转胚胎以调整朝向。
  11. 将带有移植物且正在愈合的受体胚胎滑入相邻的凹陷中，并同样确保移植的植物极组织朝向液体主体部分。
  12. 重复此操作（步骤 2.1–2.11），使用另一对供体和受体胚胎创建另一对移植/残体组合；将这些组合转移至空的凹陷中。
    注意：必须做好记录，以准确追踪每一对残体与携带移植的胚胎。供体残体将作为评估 Cas9-sgRNA 诱导突变效率的替代样本，因为移植后的 PGC 无法在动物达到性成熟前轻易检测（见下文步骤 3.3 及讨论部分）。
  13. 持续进行移植操作，直至胚胎发育至早期原肠胚 10 期左右，即 X. tropicalis 约 6.5 hpf（参见图 2E）。

3. 胚胎愈合后的护理

注意：移植物大约在30分钟内愈合到位，观察到一些来自细胞裂解的卵黄样碎片从胚胎中渗出是正常现象（图3C）。

  1. 愈合后，使用巴斯德移液管将胚胎从凹槽中极其轻柔地转移至已涂覆琼脂糖的24孔板的各个孔中。在转移过程中，通过液体混合去除渗出物（图3D）。
    1. 旋转胚胎，使其植物极朝上，面向大量溶液。同样，将供体残体和移植物受体放置在相邻的孔中，以便追踪胚胎配对情况；记录此信息。
  2. 将含有胚胎的24孔板转移至25 °C培养箱中过夜培养。
    注意：次日，胚胎将达到尾芽期阶段。
  3. 将移植物受体转移至新的涂有琼脂糖的6孔板中，每孔含1个胚胎，每孔加入1/9x MMR培养基，并补充50 µg/mL硫酸庆大霉素。清晰记录与这些移植物受体对应的供体残体。
  4. 为通过测序PCR扩增子5,17,24或其他依赖PCR扩增子的方法（见讨论部分）评估诱变效率，将单个残体转移至0.2 mL PCR条状管中。吸除大部分培养基，加入含蛋白酶K（PK）的100 µL裂解缓冲液24，使用P200移液器反复吹打进行匀浆。
  5. 在56 °C条件下进行胚胎裂解24，持续6小时至过夜，以允许PK充分消化。随后在90–95 °C加热10分钟以灭活PK，迅速冷却至4 °C。裂解产物无需进一步纯化，可直接用于PCR反应，以获得适用于Sanger直接测序的短扩增片段24。将裂解产物储存于-20 °C。
    注意：数天内，蝌蚪将达到摄食阶段（约第45–46期），可喂食浮游生物粉末悬浮液（sera Micron）。
  6. 约1周后，通过每日更换培养基以保持清洁并减少微生物过度生长，将蝌蚪转移至循环水系统中的小型水箱，采用滴流方式供水。利用测序数据将原始生殖细胞（PGCs）诱变效率高的蝌蚪与诱变效率较低的蝌蚪分离开。完成变态后，将幼蛙转移至实验室的成体水生系统中。
    注意：美国国家Xenopus资源中心（马萨诸塞州伍兹霍尔海洋生物实验室）制定的饲养方案为蝌蚪喂养29和成年蛙维护30提供了指导。

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结果

移植后，在投入精力进行动物饲养以将动物培育至性成熟之前，应先对CRISPR/Cas9诱变效果进行定性评估。由于携带leapfrog移植的动物在体细胞中为野生型，且其生殖系难以直接取样检测，因此保存供体胚胎的尸体显得尤为重要。通过对尸体提取DNA进行分析，可间接反映移植生殖系中发生的诱变程度17。

评估诱变效果的一种方法是直接测序跨越目标基因组区域的PCR扩增子。如果需要对来自多个动物的大量单个克隆DNA片段进行测序，则该方法将变得尤为昂贵且效率低下。相比之下，可对来源于基因型嵌合胚胎、在靶位点具有异质性的扩增子进行测序，以评估每个胚胎中的诱变效率19。染色图谱的可视化结果显示，在靶序列上游为野生型序列（峰形清晰），而在Cas9催化的双链断裂位点下游，峰形则变得“混乱”（即每个核苷酸位置上出现对应多个碱基的峰共同存在）。此类...

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讨论

本报告提供了一种详细的含有原始生殖细胞（PGCs）的植物组织移植方案。PGCs的移植可与基因组编辑技术（例如，CRISPR/Cas9）结合使用，以在几乎保持动物所有体细胞为遗传野生型的同时，对其生殖系进行修饰。为了成功实现跨代遗传，实施移植前需考虑若干关键因素。

为确保生殖系被突变等位基因完全替换，建议首先确定 体内 sgRNA的效率。经验表明，使用CRISPRDirect（https://crispr.dbcls.jp/）或CRISPRScan（http://www.crisprscan.org/）设计的大多数sgRNA在每胚胎注射250 pg时即具有较高效率。然而，在某些情况下，可能需要使用更高浓度（例如，该 gsc Blitz 等人发表的 sgRNA17，所需量约为每胚胎1 ng）。评估靶位点的突变效率至关重要，而使用TIDE可实现定量分析31. 本文重点介绍的方法采用直接对PCR扩增子进行Sanger测序（代...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国立儿童健康与人类发育研究所资助项目（资助号：5R21HD080684-02）的支持。作者谨此感谢Ken Cho持续的热情支持与帮助。作者还感谢Bruce Blumberg提供相机设备，Rebekah Charney对稿件的审阅，以及国家Xenopus资源中心（RRID:SCR_013731）的Sean McNamara和Marcin Wlizla，感谢他们在X. tropicalis喂养及动物护理方案方面提供的宝贵交流与建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜蒙特 #5 镊子精细科学工具公司11252-20 或 11252-30
眉毛刀自制
毛发环自制
巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃费舍尔科技公司13-678-20A
Krazy Glue（基于氰基丙烯酸酯）埃尔默产品公司KG581用于将眉毛和毛发环固定在巴斯德吸管中，也可使用其他类似的胶水。
定制寡脱氧核苷酸集成DNA技术公司定制订购sgRNA合成所用的模板寡核苷酸，设计细节参见Nakayama等，2014年。
Megascript T7 试剂盒Ambion/赛默飞世尔科技AM1334也可使用Megashortscript T7（AM1354）试剂盒
Tris缓冲酚来自任何商业供应商的高质量蒸馏酚
氯仿来自任何商业供应商的高质量氯仿
乙醇来自任何商业供应商的高质量乙醇
焦碳酸二乙酯（DEPC）西格玛化学公司D5758-50ML
Cas9蛋白，含核定位信号PNA Bio公司CP01按照生产商建议，使用DEPC处理水重悬
10倍浓度Marc's改良Ringer溶液自制。1倍浓度MMR溶液（不含EDTA）配方（参考文献26）：100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、5 mM HEPES。调节pH至7.4。
琼脂糖任何分子生物学级琼脂糖均可满足要求
60 mm × 15 mm 培养皿Falcon351007
24孔板Falcon3047
L-半胱氨酸西格玛化学公司C7352-100G游离碱形式，非盐酸盐
蛋白酶K罗氏公司03 115 828 001通常来自罗氏，浓度约为20 mg/mL
sera Micronsera蝌蚪饲料。在生长培养基中重悬。可通过多种在线零售商购买

参考文献

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15(2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22(2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148(2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168(2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157(2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587(2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282(2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

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基于CRISPR/Cas9的原始生殖细胞移植实现育种跨越式发展 非洲爪蟾
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