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方法文章

氮气空化与差速离心法可用于监测培养细胞中外周膜蛋白的分布

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DOI：

10.3791/56037

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2017年8月18日

 , 
1Langone Medical Center, New York University

本文内容

摘要

本文介绍了基于氮气空化法对培养的哺乳动物细胞进行无去垢剂匀浆的实验方案，以及通过超速离心分离胞质蛋白和膜结合蛋白的方法。该方法适用于监测外周膜蛋白在可溶性组分与膜组分之间的分布情况。

摘要

培养的细胞可用于研究蛋白质的亚细胞分布，包括外周膜蛋白。基因编码的荧光标记蛋白已彻底改变了亚细胞蛋白分布的研究方式。然而，利用荧光显微镜对蛋白分布进行定量分析较为困难，尤其是当蛋白部分存在于胞质中时。此外，研究内源性蛋白往往具有重要意义。在亚细胞分级分离后，免疫印迹等生化检测方法仍是蛋白分布定量的金标准。尽管市面上存在旨在分离胞质或特定膜组分的商业试剂盒，但这些试剂盒大多基于去垢剂提取，可能不适用于研究易于从膜上解离的外周膜蛋白。本文介绍一种无去垢剂的细胞匀浆方案，通过氮气空穴化法进行细胞破碎，随后利用超速离心分离胞质蛋白与膜结合蛋白。我们验证了不同细胞类型中可溶性组分与沉淀组分内亚细胞器的分离效果，并比较了多种常见的非去垢剂依赖型机械匀浆方法在蛋白提取方面的表现。氮气空穴化法具有多项优势，其中尤为突出的是其在对脆弱细胞器造成最小物理和化学损伤的前提下，实现了高效的细胞破碎。结合超速离心技术，氮气空穴化法是一种研究外周膜蛋白在胞质与膜组分之间分布变化的优良方法。

引言

细胞蛋白质可分为两类：一类与膜相关，另一类则不与膜相关。非膜相关蛋白质存在于细胞质、核质以及内质网（ER）等细胞器的腔内。膜相关蛋白质又分为两类：整合膜蛋白和外周膜蛋白。整合膜蛋白也被称为跨膜蛋白，因为多肽链的一个或多个区段穿过膜结构，通常以由疏水性氨基酸组成的α螺旋形式存在。跨膜蛋白在生物合成过程中通过共翻译方式插入膜中，并保持这种构型直至被降解。外周膜蛋白则是在翻译后通过次级机制被招募至膜上，通常是由于与脂质等疏水性分子发生翻译后修饰所致。与整合膜蛋白不同，外周膜蛋白与细胞膜的结合是可逆的，并且可以受到调控。许多外周膜蛋白参与信号转导通路，其与膜的受控结合是激活或抑制信号通路的一种机制。一种典型的作为外周膜蛋白的信号分子是小GTP酶RAS。在经历一系列包括法呢基化脂质修饰在内的翻译后修饰后，成熟RAS蛋白的修饰化C末端插入细胞膜的胞质侧脂双层中。具体而言，RAS在质膜上与其下游效应因子RAF1相互作用。为了防止丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的持续激活，细胞内存在多层级的RAS调控机制。除了通过将GTP水解为GDP使RAS失活外，活化的RAS还可通过修饰或与溶解性因子相互作用而从质膜上解离，从而抑制信号传导。尽管荧光活体成像技术为细胞生物学家提供了观察荧光蛋白标记的外周膜蛋白亚细胞定位的机会1，但仍迫切需要通过简单的生物化学方法对内源性蛋白质的膜结合情况进行半定量评估。

对膜组分与可溶性组分之间蛋白质分布进行准确的生化评估，关键取决于两个因素：细胞匀浆化以及膜组分与可溶性组分的有效分离。尽管某些实验方案（包括目前最常用的商业化试剂盒）依赖于基于去垢剂的细胞匀浆方法，但这些方法可能将膜蛋白提取至可溶性相中，从而干扰分析结果2。因此，采用非去垢剂依赖的机械法进行细胞破碎可获得更清晰的结果。对于在培养体系中生长或从血液及器官中收获的细胞，存在多种机械破碎方法，包括Dounce匀浆、细针破碎、球轴承匀浆、超声处理和氮气空穴化法。本文将评估氮气空穴化法，并将其与其他方法进行比较。氮气空穴化法依赖于在高压条件下溶解于细胞胞浆中的氮气。在达到平衡后，细胞悬液被突然暴露于大气压下，导致胞浆内形成氮气气泡，气泡逸出时的膨胀作用使细胞破裂。若压力足够高，氮气逸出可破坏细胞核3以及溶酶体等膜结合细胞器4。然而，若压力保持足够低，则减压过程仅破坏质膜和内质网，而不影响其他细胞器，从而将胞浆液及完整的细胞质细胞器释放到匀浆液中，该匀浆液被称为“cavitate”5。正因如此，氮气空穴化法是分离溶酶体和线粒体等细胞器的首选方法。

然而，这也是一种制备匀浆的优良方法，该匀浆可轻松分离为膜组分和可溶性组分。用于空穴作用过程中的压力容器（以下简称“"炸弹"）由耐高压的厚壁不锈钢外壳构成，配有从气罐输送氮气的进气口，以及带可调节排放阀的出料口。

自20世纪60年代以来，氮气空化已被用于细胞匀浆6。1961年，Hunter和Commerfold7确立了氮气空化作为哺乳动物组织破碎的一种可行方法。此后，研究人员已成功将该技术应用于多种细胞和组织，氮气空化已成为多种应用中的常规手段，包括膜制备8,9、细胞核和细胞器制备10,11以及不稳定生化物质的提取。目前，细胞生物学家更常使用其他细胞匀浆方法，原因是氮气匀浆的优势未被广泛宣传，氮气爆破装置价格昂贵，且存在一种误解，认为该方法需要相对大量的细胞。迄今为止，尚未发表关于通过氮气空化获得含完整细胞核的无细胞匀浆物的实验方案，大多数已发表的研究评估中使用的细胞悬液体积为20 mL。为了使这一经典技术适应当前小规模样品操作的需求，我们提出了一种专为培养细胞设计的改良版氮气空化方案。氮气空化后，通过差速离心将匀浆物分离为可溶性（S）和膜（P）组分：首先进行低速离心以去除细胞核和未破碎的细胞，然后进行高速离心（>100,000 x g）以将膜组分与可溶性组分分离。我们通过免疫印迹分析分离效率，并将氮气空化与其他机械破碎技术进行比较。此外，我们还研究了氮气空化过程中匀浆缓冲液的渗透压效应。

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方案

1. 缓冲液与仪器准备

  1. 将45 mL细胞破碎弹、15 mL离心管和超速离心管置于4 °C预冷。
  2. 按每2 × 107个细胞准备25 mL匀浆缓冲液，并在4 °C预冷。使用前立即加入一片蛋白酶抑制剂。
    注：匀浆缓冲液通常使用KCl而非NaCl，以更好地模拟细胞内盐离子组成。本方案所用匀浆缓冲液成分为pH 7.4的10 mM HEPES、10 mM KCl和1.5 mM MgCl2（下文简称低渗匀浆缓冲液）。大多数缓冲液均可根据需要调整用于氮气破胞法（见讨论部分）。
  3. 每个样品准备6 mL 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液，并在4 °C预冷。使用前新鲜加入蛋白酶抑制剂片剂。
    注：本方案所用PBS缓冲液成分为pH 7.4的10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、137 mM NaCl和2.7 mM KCl。
  4. 每个样品准备4 mL溶解缓冲液，并在4 °C预冷。使用前立即加入一片蛋白酶抑制剂。
    注：本方案所用溶解缓冲液为1×放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液，成分为pH 7.4的25 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% SDS、0.5%脱氧胆酸钠和1% NP-40。参见步骤4.6的注释。

2. 细胞收获

  1. 使用适合该细胞类型的推荐培养基培养 2 × 107–10 × 109 个组织培养细胞。通常，一个 15 cm 培养皿在 90% 汇合度下可收获约 2 × 107 个在 DMEM 中培养的 HEK-293 细胞（图 1）。
  2. 用真空泵吸除培养基。
  3. 对于贴壁细胞，将培养皿置于冰上，在培养皿中直接用预冷的匀浆缓冲液轻柔洗涤两次（每次每 15 cm 培养皿使用 10 mL 缓冲液），然后用大号细胞刮刀在适量匀浆缓冲液中收集细胞；对于悬浮细胞，以 500 × g 在 4 °C 离心 5 分钟，用预冷的匀浆缓冲液洗涤细胞沉淀两次（每次每 50 mL 培养物使用 10 mL 缓冲液），然后将洗涤后的细胞沉淀在冰上用适量匀浆缓冲液重悬。
    注意：缓冲液体积应根据目标实验所需的蛋白浓度，以及细胞破碎弹中允许的最小/最大体积来确定。一般建议为 2–10 × 107 个细胞/mL，或约为细胞沉淀体积的 10 倍。本方案针对三个 15 cm 培养皿的 HEK-293 细胞，使用 2 mL 匀浆缓冲液进行了优化。

3. 氮气空化

  1. 将细胞悬液转移至置于磁力搅拌器上冰浴中的洁净且预冷的破壁罐内。
    注意：破壁罐内含有高压、低温的氮气——请佩戴适当的个人防护装备。
  2. 在破壁罐内放入一个微型磁力搅拌子，并开启磁力搅拌器以维持细胞悬液的均匀性。
  3. 向悬液中加入一片蛋白酶抑制剂片剂，并按照制造商说明关闭破壁罐。
  4. 根据制造商说明，使用氮气钢瓶逐步对破壁罐加压，直至压力表读数达到 300 至 600 psi。关闭所有阀门，并断开氮气钢瓶。
    注：所需压力可能因细胞类型而异。本实验中，HEK-293、NIH-3T3 和 Jurkat 细胞的空化处理压力为 350 至 400 psi。
  5. 静置 20 分钟，使氮气充分溶解并在细胞内达到平衡。
  6. 用布巾擦去排放阀周围的多余水分。轻轻打开排放阀，使匀浆液逐滴释放，并收集至预冷的 15 mL 离心管中。
    注：在收集接近结束时，会有匀浆液喷射，同时伴随气体释放发出嘶嘶声。确保气体喷出不会导致已收集的空化产物从管中溅出（因此使用 15 mL 管而非 1.5 mL 管）。一旦出现喷射，立即关闭排放阀，并迅速打开氮气进气阀以释放破壁罐内压力，使罐内剩余细胞完成空化。随后打开破壁罐，回收空化产物并进行彻底清洗。
    注：最终获得的空化产物应呈乳白色，表面带有泡沫。在离心前，用移液器枪头轻轻搅拌，使泡沫消散。
    注：使用相差显微镜检查空化产物，以评估匀浆效率。取 15 µL 空化产物滴加于载玻片表面，加盖盖玻片。若在 20X 物镜下观察到未破碎细胞过多，则需重复步骤 3.4–3.6。
    注：若匀浆缓冲液中未含 EDTA 或 EGTA，应在排放后 5 分钟内向收集的空化产物中添加，使其终浓度为 1 mM。

4. 细胞质组分与膜组分的分离

  1. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 10 分钟，去除未破碎的细胞和细胞核。
    注意：重复离心步骤，直至无可见沉淀产生，并收集上清液（即核后上清液，PNS），避免吸取顶部的泡沫。如有必要，可对泡沫部分再次离心，进一步收集并合并 PNS（图 1）。
  2. 根据需要处理 PNS 以获得目标组分。若需分离胞质组分和膜组分，将 PNS 转移至聚碳酸酯超速离心管中，并按所需条件进行超速离心。本方案适用于在聚碳酸酯超速离心管中处理体积 <3.5 mL 的样品，并在 4 °C 条件下以 350,000 × g 离心 1 小时。
  3. 使用 1 mL 移液器收集上清液（即 S 组分）。
  4. 用 3 mL 冷 PBS 小心冲洗沉淀，避免扰动沉淀。通过真空抽吸去除 PBS。
    注意：若更关注胞质蛋白对膜组分的污染而非样品损失，可将沉淀重悬于 3 mL 冷 PBS 中，并按步骤 4.2 再次进行超速离心。随后通过真空抽吸去除 PBS。
  5. 将沉淀完全重悬于适量体积的含去垢剂的溶解缓冲液中。为实现细胞量的一致性，所用溶解缓冲液的体积应与胞质组分的体积相同。
    注意：建议使用 1× RIPA 缓冲液作为溶解缓冲液，以实现高效的膜蛋白提取。若膜组分无需后续检测，可使用 1× Laemmli 样品缓冲液以获得最大化的膜蛋白提取效率。
    注意：建议将沉淀在溶解缓冲液中解离并转移至洁净离心管中，在 4 °C 条件下置于旋转混合仪上充分混匀，以实现最大化的膜蛋白提取。
    注意：若沉淀过于黏稠（脂质过多），难以在溶解缓冲液中有效从超速离心管中移除，建议使用液氮对沉淀进行速冻，并在沉淀融化前用小型金属刮刀迅速将其从超速离心管中刮下。
    注意：作为替代方案，膜沉淀也可仅重悬于不含去垢剂的缓冲液中而不进行溶解，从而制备膜囊泡悬液形式的 P 组分，此时无需执行步骤 4.6 的离心操作。此类 P 组分适用于研究依赖膜结合状态的酶活性等功能。
  6. 将步骤 4.5 中完全溶解的沉淀悬液在台式离心机中于 4 °C 以 20,000 × g 离心 10 分钟。使用 1 mL 移液器收集上清液（即 P 组分），弃去沉淀（不溶性脂质）。
  7. 对胞质组分和/或膜组分进行所需的检测（如 Western 印迹），或将其保存于 -80 °C 以备后续使用。

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结果

图2 显示了来自PNS的细胞蛋白被分配到可溶性胞质组分（S）或膜沉淀组分（P）中的情况。我们检测了三种不同细胞类型的代表性细胞系：HEK-293（上皮细胞）、NIH-3T3（成纤维细胞）和Jurkat（淋巴细胞）。Rho鸟苷酸解离抑制因子（RhoGDI）和不依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CIMPR）分别作为胞质组分和膜组分的阳性对照。我们证实，在低渗缓冲液中以约350 psi的压力进行氮气空化处理，随后在350,000 × g条件下超速离心1小时，可有效分离胞质和膜组分。然后使用内质网、内体和溶酶体、线粒体、高尔基体及其他细胞器的标志物，分析从S和P组分中回收的总蛋白。所有跨膜蛋白均特异性存在于膜组分中，包括来自质膜的Na+/K+ ATP酶和表皮生长因子受体（EGFR）、来自内质网的钙网蛋白（calnexin）、来自溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）、来自线粒体的F0-ATP酶以及来自trans高尔基网络的Golgin ...

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讨论

与其它机械破碎方法相比，氮气空化法具有多种优势。其中最显著的优点是其能够温和而高效地均质化样品。减压的物理原理使样品冷却，避免了超声波法以及基于摩擦/剪切的技术所产生的局部加热损伤。空化作用在破坏细胞质膜方面也极为高效。由于减压时氮气泡在每个细胞内部生成，空化过程受细胞大小、样品体积或样品浓度的限制较小。因此，该方法相较于依赖间隙的Dounce匀浆法或针头通透匀浆法具有额外优势。氮气空化还能提供更一致的结果，因为通过相同压力可在整个样品中均匀施加并重复相同的破坏力。此外，每个细胞仅经历一次破碎过程，因此亚细胞组分不会持续暴露于变化的破坏力之下。这限制了细胞器的人为碎片化。由于使用氮气饱和细胞悬液且不含额外氧气，因破碎导致的不稳定细胞组分氧化问题也得以减轻。氮气空化所施加的有限物理和化学应力使其成为研究不稳定酶类和脆弱细胞器的理想技术，且该均质化方法的可重复性非常适合定量分析。

氮气空化在样品量、匀浆缓冲液组成以及细胞器完整性程度方面也具有显著的灵活性。要扩大匀浆规模，只需使用容量更大的加压容器，无需牺牲减压过程的速度、便捷性或效率。任何类型的匀浆缓冲液均可用于氮气空化，缓冲液的选择...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由 GM055279、CA116034 和 CA163489 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞破碎容器（45 mL）Parr Instrument4639氮气破胞炸弹
邓氏匀浆器（2 mL）Kontes885300-0002邓氏研杵和管
U-100 胰岛素注射器 28G½Becton Dickinson329461针头
Atg12 抗体Santa Cruz271688小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
β-肌动蛋白抗体Santa Cruz47778小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
β-微管蛋白抗体DSHBE7-s小鼠抗体，使用稀释比例为 1:5000
钙联蛋白抗体Santa Cruz23954小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
钙网蛋白抗体Santa Cruz373863小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
过氧化氢酶抗体Santa Cruz271803小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
CIMPR 抗体Abcam124767兔抗体，使用稀释比例为 1:1000
EEA1 抗体Santa Cruz137130小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
EGFR 抗体Santa Cruz373746小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
F0-ATP酶抗体Santa Cruz514419小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
F1-ATP酶抗体Santa Cruz55597小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
纤维蛋白抗体Santa Cruz374022小鼠抗体，使用稀释比例为 1:200
高尔基体蛋白97抗体Santa Cruz59820小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
HDAC1 抗体Santa Cruz81598小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
己糖激酶1抗体Cell Signaling Technology2024S兔抗体，使用稀释比例为 1:1000
核纤层蛋白A/C抗体Santa Cruz376248小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
LAMP1 抗体DSHBH4A3-c小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
Na+/K+ ATP酶抗体Santa Cruz48345小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
Rab7 抗体Abcam137029兔抗体，使用稀释比例为 1:1000
Rab9 抗体ThermoMA3-067小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
RCAS1 抗体Santa Cruz398052小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
RhoGDI 抗体Santa Cruz360兔抗体，使用稀释比例为 1:3000
核糖体蛋白S6抗体Santa Cruz74459小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
Sec61a 抗体Santa Cruz12322山羊抗体，使用稀释比例为 1:1000
厚壁聚碳酸酯超速离心管Beckman Coulter349622用于超速离心的样品管
TLK-100.3 转子Beckman Coulter349481超速离心转子
Optima MAX 高容量个人超速离心机Beckman Coulter364300超速离心机
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合片剂Roche11697498001蛋白酶抑制剂
带25 cm手柄和3.0 cm刮刀的细胞刮铲Corning353089大型细胞刮铲
磁力搅拌子Fisher Scientific14-513-57SIX微型搅拌子
陶瓷顶面磁力搅拌器Fisher ScientificS504501AS磁力搅拌器

参考文献

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