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方法文章

氮气空化与差速离心法可用于监测培养细胞中外周膜蛋白的分布

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DOI：

10.3791/56037

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2017年8月18日

 , 
1Langone Medical Center, New York University

本文内容

摘要

本文介绍了基于氮气空化法对培养的哺乳动物细胞进行无去垢剂匀浆的实验方案，以及通过超速离心分离胞质蛋白和膜结合蛋白的方法。该方法适用于监测外周膜蛋白在可溶性组分与膜组分之间的分布情况。

摘要

培养的细胞可用于研究蛋白质的亚细胞分布，包括外周膜蛋白。基因编码的荧光标记蛋白已彻底改变了亚细胞蛋白分布的研究方式。然而，利用荧光显微镜对蛋白分布进行定量分析较为困难，尤其是当蛋白部分存在于胞质中时。此外，研究内源性蛋白往往具有重要意义。在亚细胞分级分离后，免疫印迹等生化检测方法仍是蛋白分布定量的金标准。尽管市面上存在旨在分离胞质或特定膜组分的商业试剂盒，但这些试剂盒大多基于去垢剂提取，可能不适用于研究易于从膜上解离的外周膜蛋白。本文介绍一种无去垢剂的细胞匀浆方案，通过氮气空穴化法进行细胞破碎，随后利用超速离心分离胞质蛋白与膜结合蛋白。我们验证了不同细胞类型中可溶性组分与沉淀组分内亚细胞器的分离效果，并比较了多种常见的非去垢剂依赖型机械匀浆方法在蛋白提取方面的表现。氮气空穴化法具有多项优势，其中尤为突出的是其在对脆弱细胞器造成最小物理和化学损伤的前提下，实现了高效的细胞破碎。结合超速离心技术，氮气空穴化法是一种研究外周膜蛋白在胞质与膜组分之间分布变化的优良方法。

引言

细胞蛋白质可分为两类：一类与膜相关，另一类则不与膜相关。非膜相关蛋白质存在于细胞质、核质以及内质网（ER）等细胞器的腔内。膜相关蛋白质又分为两类：整合膜蛋白和外周膜蛋白。整合膜蛋白也被称为跨膜蛋白，因为多肽链的一个或多个区段穿过膜结构，通常以由疏水性氨基酸组成的α螺旋形式存在。跨膜蛋白在生物合成过程中通过共翻译方式插入膜中，并保持这种构型直至被降解。外周膜蛋白则是在翻译后通过次级机制被招募至膜上，通常是由于与脂质等疏水性分子发生翻译后修饰所致。与整合膜蛋白不同，外周膜蛋白与细胞膜的结合是可逆的，并且可以受到调控。许多外周膜蛋白参与信号转导通路，其与膜的受控结合是激活或抑制信号通路的一种机制。一种典型的作为外周膜蛋白的信号分子是小GTP酶RAS。在经历一系列包括法呢基化脂质修饰在内的翻译后修饰后，成熟RAS蛋白的修饰化C末端插入细胞膜的胞质侧脂双层中。具体而言，RAS在质膜上与其下游效应因子RAF1相互作用。为了防止丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的持续激活，细胞内存在多层级的RAS调控机制。除了通过将GTP水解为GDP使RAS失活外，活化的RAS还可通过修饰或与溶解性因子相互作用而从质膜上解离，从而抑制信号传导。尽管荧光活体成像技术为细胞生物学家提供了观察荧光蛋白标记的外周膜蛋白亚细胞定位的机会1，但仍迫切需要通过简单的生物化学方法对内源性蛋白质的膜结合情况进行半定量评估。

对膜组分与可溶性组分之间蛋白质分布进行准确的生化评估....

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方案

1. 缓冲液与仪器准备

  1. 将45 mL细胞破碎弹、15 mL离心管和超速离心管置于4 °C预冷。
  2. 按每2 × 107个细胞准备25 mL匀浆缓冲液，并在4 °C预冷。使用前立即加入一片蛋白酶抑制剂。
    注：匀浆缓冲液通常使用KCl而非NaCl，以更好地模拟细胞内盐离子组成。本方案所用匀浆缓冲液成分为pH 7.4的10 mM HEPES、10 mM KCl和1.5 mM MgCl2（下文简称低渗匀浆缓冲液）。大多数缓冲液均可根据需要调整用于氮气破胞法（见讨论部分）。
  3. 每个样品准备6 mL 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液，并在4 °C预冷。使用前新鲜加入蛋白酶抑制剂片剂。
    注：本方案所用PBS缓冲液成分为pH 7.4的10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、137 mM NaCl和2.7 mM KCl。
  4. 每个样品准备4 mL溶解缓冲液，并在4 °C预冷。使用前立即加入一片蛋白酶抑制剂。
    注：本方案所用溶解缓冲液为1×放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液，成分为pH 7.4的25 mM Tris、150 mM NaCl、0.1% SDS、0.5%脱氧胆酸钠和1% NP-40。参见步骤4.6的注释。

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结果

图2 显示了来自PNS的细胞蛋白被分配到可溶性胞质组分（S）或膜沉淀组分（P）中的情况。我们检测了三种不同细胞类型的代表性细胞系：HEK-293（上皮细胞）、NIH-3T3（成纤维细胞）和Jurkat（淋巴细胞）。Rho鸟苷酸解离抑制因子（RhoGDI）和不依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CIMPR）分别作为胞质组分和膜组分的阳性对照。我们证实，在低渗缓冲液中以约350 psi的压力进行氮气空化处理，随后在350,000 × g条件下超速离心1小时，可有效分离胞质和膜组分。然后使用内质网、内体和溶酶体、线粒体、高尔基体及其他细胞器的标志物，分析从S和P组分中回收的总蛋白。所有跨膜蛋白均特异性存在于膜组分中，包括来自质膜的Na+/K+ ATP酶和表皮生长因子受体（EGFR）、来自内质网的钙网蛋白（calnexin）、来自溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）、来自线粒体的F0-ATP酶以及来自trans高尔基网络的Golgin .......

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讨论

与其它机械破碎方法相比，氮气空化法具有多种优势。其中最显著的优点是其能够温和而高效地均质化样品。减压的物理原理使样品冷却，避免了超声波法以及基于摩擦/剪切的技术所产生的局部加热损伤。空化作用在破坏细胞质膜方面也极为高效。由于减压时氮气泡在每个细胞内部生成，空化过程受细胞大小、样品体积或样品浓度的限制较小。因此，该方法相较于依赖间隙的Dounce匀浆法或针头通透匀浆法具有额外优势。氮气空化还能提供更一致的结果，因为通过相同压力可在整个样品中均匀施加并重复相同的破坏力。此外，每个细胞仅经历一次破碎过程，因此亚细胞组分不会持续暴露于变化的破坏力之下。这限制了细胞器的人为碎片化。由于使用氮气饱和细胞悬液且不含额外氧气，因破碎导致的不稳定细胞组分氧化问题也得以减轻。氮气空化所施加的有限物理和化学应力使其成为研究不稳定酶类和脆弱细胞器的理想技术，且该均质化方法的可重复性非常适合定量分析。

氮气空化在样品量、匀浆缓冲液组成以及细胞器完整性程度方面也具有显著的灵活性。要扩大匀浆规模，只需使用容量更大的加压容器，无需牺牲减压过程的速度、便捷性或效率。任何类型的匀浆缓冲液均可用于氮气空化，缓冲液的选择.......

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由 GM055279、CA116034 和 CA163489 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞破碎容器（45 mL）Parr Instrument4639氮气破胞炸弹
邓氏匀浆器（2 mL）Kontes885300-0002邓氏研杵和管
U-100 胰岛素注射器 28G½Becton Dickinson329461针头
Atg12 抗体Santa Cruz271688小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
β-肌动蛋白抗体Santa Cruz47778小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
β-微管蛋白抗体DSHBE7-s小鼠抗体，使用稀释比例为 1:5000
钙联蛋白抗体Santa Cruz23954小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
钙网蛋白抗体Santa Cruz373863小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
过氧化氢酶抗体Santa Cruz271803小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
CIMPR 抗体Abcam124767兔抗体，使用稀释比例为 1:1000
EEA1 抗体Santa Cruz137130小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
EGFR 抗体Santa Cruz373746小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
F0-ATP酶抗体Santa Cruz514419小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
F1-ATP酶抗体Santa Cruz55597小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
纤维蛋白抗体Santa Cruz374022小鼠抗体，使用稀释比例为 1:200
高尔基体蛋白97抗体Santa Cruz59820小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
HDAC1 抗体Santa Cruz81598小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
己糖激酶1抗体Cell Signaling Technology2024S兔抗体，使用稀释比例为 1:1000
核纤层蛋白A/C抗体Santa Cruz376248小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
LAMP1 抗体DSHBH4A3-c小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
Na+/K+ ATP酶抗体Santa Cruz48345小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
Rab7 抗体Abcam137029兔抗体，使用稀释比例为 1:1000
Rab9 抗体ThermoMA3-067小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
RCAS1 抗体Santa Cruz398052小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
RhoGDI 抗体Santa Cruz360兔抗体，使用稀释比例为 1:3000
核糖体蛋白S6抗体Santa Cruz74459小鼠抗体，使用稀释比例为 1:1000
Sec61a 抗体Santa Cruz12322山羊抗体，使用稀释比例为 1:1000
厚壁聚碳酸酯超速离心管Beckman Coulter349622用于超速离心的样品管
TLK-100.3 转子Beckman Coulter349481超速离心转子
Optima MAX 高容量个人超速离心机Beckman Coulter364300超速离心机
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合片剂Roche11697498001蛋白酶抑制剂
带25 cm手柄和3.0 cm刮刀的细胞刮铲Corning353089大型细胞刮铲
磁力搅拌子Fisher Scientific14-513-57SIX微型搅拌子
陶瓷顶面磁力搅拌器Fisher ScientificS504501AS磁力搅拌器

参考文献

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequen....

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