本文描述了在雌性大鼠中进行超声检查以建立生殖与妇科研究实验模型的应用价值。文中展示了如何进行超声影像评估的逐步操作说明。
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本文内容
摘要
摘要
随着辅助生殖技术的发展以及人类研究中存在的伦理限制，大鼠动物模型在生殖医学中得到了广泛应用。过去，对啮齿类动物生殖系统发育的研究主要依赖于对离体组织进行一次性组织学检查。近年来，随着高分辨率经腹超声技术的发展，现已可对大鼠生殖器官进行高质量的超声成像，从而为研究生殖系统提供了新方法。本研究采用高分辨率超声成像系统获取图像，对28只8周龄未妊娠的雌性大鼠以及5只妊娠的Sprague-Dawley大鼠进行了妇科超声检查。我们描述了在动情周期不同阶段的典型图像中识别生殖系统器官及相关结构的方法。采用彩色多普勒血流成像技术测量子宫动脉血流，评估妊娠不同阶段子宫血流模式的变化。我们已证实，超声检查是一种评估内生殖器官变化的有效方法。该技术的应用使得在不处死动物的前提下，开展包括药物或手术干预在内的进一步实验成为可能，并能够持续监测内脏器官的超声影像变化。
引言
大鼠动物模型已广泛应用于生殖医学领域，包括胚胎和卵巢移植1,2。然而，过去对啮齿类动物生殖系统发育的研究主要依赖于对切除组织的一次性组织学检查，无法实现对大鼠生殖器官日复一日变化的纵向研究3。超声技术在人类辅助生殖技术中已广泛应用超过30年，但这一重要技术直到近期才被应用于大鼠研究。
我们的目标是建立一种超声影像方法，用于评估 Sprague-Dawley 大鼠的生殖器官，以设计适用于生殖与妇科学研究的实验模型，并展示该操作过程，因为据我们所知，目前尚无关于此操作的可视化出版物。本文描述了雌性大鼠生殖系统的超声检查步骤，并利用高分辨率超声技术展示其解剖结构及子宫动脉血流的超声影像结果。我们对非妊娠动物在动情周期不同阶段的子宫内膜特征、卵巢形态及子宫动脉血流情况进行监测，以评估动情周期各阶段子宫内膜厚度、卵巢形态及子宫血流的显著差异，该模式与人类相似。我们采用高质量超声设备，频率为 70 MHz，分辨率达到 30 µm。 我们的另一项目标是评估妊娠大鼠子宫血流阻力的变化。该技术可实现对生殖器官每日变化的无创性研究，而无需处死动物。
在大鼠上使用超声技术存在若干技术难点。这些难点包括：大鼠子宫内膜比人类女性薄得多4。大鼠卵巢成像困难的原因在于其皮肤和腹壁肌肉较厚，导致超声波几乎完全衰减5，此外在未妊娠大鼠中子宫动脉更难定位。我们已解决了该操作中的许多技术问题，对于尚存的问题，本文也展示了如何将其影响降至最低。
无需处死动物即可成功监测大鼠生殖器官的超声影像变化，这将为建立生殖医学及其他外科手术的未来动物模型开辟可能性。
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方案
本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议，并符合ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南的要求。实验方案已获得符合欧盟指令2010/63/EU的动物实验许可，授权编号为A13170404（附件1）。所有实验均在欧盟认证的实验室中进行，遵循国家关于动物伦理护理的指导原则（RD 53/2013，欧盟指令63/2010）。该实验方案已通过穆尔西亚大学动物实验伦理委员会的批准。
1. 动物准备
注：所有实验均得到穆尔西亚大学动物实验科和穆尔西亚大学妇产科系的支持。
- 所有实验均使用8周龄、体重200–250 g的Sprague-Dawley大鼠（共28只雌性大鼠）。
注意：本研究中还使用了5只妊娠大鼠。 - 为获得妊娠大鼠，将8周龄的雌性大鼠与具有生育能力的雄性大鼠同笼饲养，并在17:00至23:00期间进行交配。若次日早晨观察到阴道栓，则视为交配成功。 将交配后的次日定为妊娠第1天。
- 在妊娠第9、15和18天进行实验。
- 将大鼠以每笼两只的方式饲养，自由摄食饮水，并维持在12小时光照/12小时黑暗的常规光照周期中。
- 在实验环境中适应至少两周后，每日早晨通过阴道细胞学检测评估动情周期的频率与规律性。
注意：选择28只动情周期规律、周期长度为4至5天的大鼠纳入本研究。
2. 成像用大鼠的制备
注意：图像采用高分辨率经腹超声检查获得。动情周期各阶段通过阴道涂片细胞学确定。
- 成像研究前，将母鼠置于诱导室中，使用 2-3% 异氟烷气体进行麻醉。
- 取出动物后，立即将其口鼻部放入与麻醉系统相连的鼻罩中，并在超声检查期间以 1.5-2% 异氟烷维持麻醉状态。
- 使用电动剪刀和脱毛膏去除从肋缘至尾腹部的毛发。
- 将麻醉后的实验大鼠仰卧位固定于加热台上，以确保动物稳定，并在整个成像过程中维持其生理参数处于最佳状态。所有生理参数应通过超声应用实时整合至所采集的图像和数据中。
- 在润滑后轻轻插入直肠探头，以监测体温（37.5 °C ± 0.5 °C）。
- 将换能器（30 Hz）置于固定支架中，并通过手动操纵杆或手工方式沿垂直轴和水平轴（前后及左右方向）移动。
- 在大鼠眼部涂抹石油基眼用软膏，以防止操作过程中眼睛干燥。
3. 检查步骤
注意：大鼠生殖器官的解剖结构：阴道位于尿 bladder 的背侧，分为两个向肾脏方向延伸的子宫角。卵巢通过输卵管与子宫角相连（图1）。子宫位于肾脏后方区域。
- 子宫的识别
- 通过将膀胱作为解剖标志来定位宫颈，沿宫颈追踪至左右子宫角的分支。
- 通过选择切换至二维视图/视频 "B型超声模式"在矢状中线图像上，测量每侧子宫角峡部中间区域的前后直径，使用超声系统软件进行测量。
- 在矢状面中线图像上，测量子宫腔内从一侧强回声边界至对侧强回声边界的子宫内膜厚度 "B型超声模式".
- 选择切换至彩色多普勒模式 "彩色多普勒"使用彩色多普勒识别子宫内膜的血供，并测量子宫内膜的血流。在彩色多普勒模式下选择以下参数：高通滤波器设为4 Hz，脉冲重复频率设为4至48 kHz，脉冲多普勒取样门设为0.2至0.5 mm。
- 子宫动脉血流的识别
- 在子宫颈旁交界处外下缘靠近髂动脉的两侧，获取子宫动脉的多普勒血流波形。
- 在多普勒模式下使用以下参数：高通滤波器设置为 6 Hz，脉冲重复频率设置在 4 至 48 kHz 之间，脉冲多普勒取样门设置在 0.2 至 0.5 mm 之间。
- 注意对齐血流方向与多普勒声束，以尽量减小多普勒角度。记录多普勒声束与血管之间的夹角。当角度超过60°时，所获取的数值不准确，应避免使用。6.
- 从三个连续周期中测量收缩期峰值流速（PSV）和舒张末期流速（EDV）。然后计算每侧子宫角的收缩期与舒张期流速比值（S/D 比值，PSV/EDV）和阻力指数（RI，[PSV−EDV]/PSV）的数值。
- 在第9天测量5只妊娠大鼠的子宫动脉血流th, 15th, 18th 妊娠天数
- 卵巢及卵巢动脉血流的识别
注意：雌性大鼠的卵巢位于动物体两侧肾脏外侧，处于子宫角末端的脂肪垫内图1).- 成像卵巢时，先将探头置于动物肋骨稍下方的侧面横向位置。与卵巢相比，肾脏和脂肪垫呈高回声。
- 测量卵巢和卵泡的外部边界。每张图像比例尺上的数字单位为毫米，增量为0.1毫米。
注意：彩色多普勒模式和能量多普勒模式成像有助于识别卵巢的血流强度和方向。
4. 研究设计
- 通过阴道涂片细胞学检查动情周期。
- 将所有大鼠分为两组。第一组为生育前期（或围排卵期），包括处于动情前期和动情期的大鼠；第二组为生育后期，包括处于动情间期早期和动情间期晚期的大鼠。
- 监测并比较第1组和第2组在子宫角峡部中段区域的前后直径。
- 监测并比较第1组和第2组的子宫内膜厚度及子宫内膜特征。
- 监测并比较第1组和第2组中两侧卵巢的大小（最大直径）及特征，并定位任一侧卵巢中的排卵前卵泡。
- 监测并比较第1组和第2组的子宫动脉血流。
- 监测并比较不同妊娠阶段（妊娠第9、15和18天）孕鼠子宫动脉的血流情况。
- 执行 使用SPSS进行统计分析。数据以均值±标准差（SD）或中位数与四分位间距表示。采用学生t检验分析不同组间的结果。P值小于0.05被认为具有统计学显著性差异。
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结果
两侧子宫角的前后径以及子宫内膜厚度之间均无显著差异（表1）。与第2组相比，第1组的平均子宫内膜厚度较大，但两组间差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。然而，我们在接近动情周期时发现部分大鼠子宫内存在液体（28只中有8只），并伴有子宫内膜形态的改变（图2）。
多普勒研究还显示，在非妊娠大鼠的子宫角两侧以及动情周期的不同阶段，血流速度波形模式均无显著变化。表1 和 2, 图 4A）。然而，在妊娠大鼠中，随着妊娠进展，收缩期峰值速度和舒张末期速度显著增加，而计算所得的阻力指数显著降低（表3, 图 4B).
卵巢的平均直径无显著差异（表1<...
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讨论
由于本研究中需要进行操作步骤的修改和故障排查，尽管我们的目标是利用超声成像识别大鼠动情周期的所有阶段，但仍未能发现任何显著差异。我们推测，这些困难可能源于大鼠的动情周期仅持续数天，与人类女性的周期不同。我们确信所有测量均在准确的时间点完成，足以检测出可能存在的差异。因此，我们将动情周期的各阶段重新归为两个阶段以评估差异，但仍未观察到显著区别。与预期一致，我们发现两侧子宫角的测量值之间无显著差异，这表明今后可任选一侧子宫角进行测量。关于异氟烷对啮齿类动物影响的研究结果存在矛盾。异氟烷可能具有致畸性，但仅在麻醉浓度下持续使用数小时或数天时才会发生。在本实验中，妊娠大鼠的检查时间少于30分钟，因此我们未在任何妊娠大鼠及其子代中发现不良影响。
我们本希望在大鼠生殖道的超声评估中发现更多与女性相似的特征，例如在女性中，卵泡期、排卵期和分泌期之间存在明显的回声差异，但在大鼠模型中并未观察到此类变化。这一现象可能是因为大鼠动情周期的各个阶段仅持续四到五天。短暂的动情周期和妊娠期使大鼠成为生殖研究的理想动物模型5。然而，这一特点也可能解释了为何在动情...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了穆尔西亚大学动物实验科和穆尔西亚大学妇产科的支持。我们感谢所有在穆尔西亚大学生物医学研究中心（CEIB）动物实验科工作的技术人员，他们为本项目提供了协作与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Vevo3100 高分辨率活体微成像系统* | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| 包含生理监测单元的 Vevo 集成导轨系统 | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| MX400 换能器 | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Lab 软件 | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD：Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | 大鼠品系 | |
| 润滑凝胶 | General Supply | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 麻醉推车系统 | Cibertec S.A | 麻醉机 | |
| Ecogel 100 超声耦合剂 | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| 脱毛乳液（Nair） | General Supply | ||
| 异氟烷 | Esteve Veterinaria | 吸入性麻醉剂 | |
| * 所需软件为 Vevo 软件，包括 B 模式成像模块、脉冲波多普勒模块和血管应变分析工具包。 |
参考文献
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重印与许可
