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检测大鼠创伤性脑损伤后的行为缺陷

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DOI：

10.3791/56044

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2018年1月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所介绍的行为学测试旨在检测大鼠在创伤性脑损伤后的功能缺陷。文中提供了四种特定测试，用于检测行为缺陷，以反映损伤后长达一年时间内特定脑区所受到的损害。

摘要

随着创伤性脑损伤（TBI）在平民和军人人群中发病率的不断上升，TBI 目前已被视为一种慢性疾病；然而，针对 TBI 动物模型中损伤长期影响的研究仍十分有限。本文展示的行为学检测方法在 TBI 研究中已被广泛采用，适用于损伤后早期（如两周至两个月）的评估。其中部分方法虽曾有少数实验室用于损伤后更长时间（长达一年）的检测，但应用极为罕见。本文所演示的方法包括：用于检测反射功能的简短神经功能评估、用于检测平衡能力的平衡木测试（Beam-Balance）、用于检测平衡与运动协调能力的行走木测试（Beam-Walk），以及一种可敏感反映参考记忆缺陷的工作记忆版莫里斯水迷宫实验。雄性大鼠在接受矢状旁路液体冲击损伤（FPI）或假手术处理前，均经过神经功能、平衡及运动协调测试的适应性操作和预训练。简短神经功能评估（神经评分）、平衡木测试和行走木测试可在同一只大鼠上进行多次重复检测，而水迷宫测试则只能进行一次，原因是大鼠会对任务产生记忆，若在同一动物上重复测试将干扰结果的准确性。在损伤后1至3天进行检测时，三项非认知任务均可检测到显著差异；然而，在较晚时间点（3个月后），行走木测试中的差异已无法检出。平衡木测试中的功能缺陷可持续至3个月，神经评分的缺陷则可持续至6个月。工作记忆的缺陷可延续至损伤后12个月，而参考记忆的缺陷首次在12个月时被发现。因此，标准行为学测试可作为评估FPI后持续性行为功能缺陷的有效指标。

引言

本文所述方法旨在检测大鼠创伤性脑损伤（TBI）实验模型所引起的特定脑区功能缺陷。将介绍四种不同的行为学测试。首先，简短的神经功能评估，称为神经评分（neuroscore），无需特殊设备即可实施，但操作者需经过练习；该测试用于检测反射功能的缺陷。其次，平衡木测试（Beam-Balance test）用于检测平衡能力的缺陷。该任务要求操作者根据等级量表对大鼠进行评分，因此操作者需接受一定培训。平衡木测试需使用一根狭窄的横梁，对前庭系统功能缺陷具有敏感性。第三项测试用于评估前庭运动协调能力，称为横梁行走任务（Beam-Walk task）。尽管需要对大鼠进行一定的预训练，但由于该实验以穿越横梁所需时间为客观指标，不依赖主观评分，因此比前两种测试更具客观性。其差异在于，测量的是大鼠穿越狭窄横梁到达安全箱所需的时间。横梁行走测试所需的横梁比平衡木测试更长，并需配备一个逃逸箱。该测试可评估运动协调和平衡能力两方面的缺陷，因此对小脑及与运动相关脑区的损伤具有敏感性。莫里斯水迷宫的工作记忆版本（MWM-WM）主要用于检测海马功能及其与前额叶皮层的整合能力，即执行功能。本文展示的莫里斯水迷宫版本也可用于检测参考记忆功能的缺陷1。

这些方法的选择基于其在文献中已确立的良好应用记录。多年来，不同实验室的研究人员使用多种大鼠品系均证明这些方法具有良好的有效性。然而，过去通常仅将损伤后两周内的损伤后评估指标视为有效 "慢性" 时间点。因此，为了建立用于研究啮齿类动物TBI慢性效应的行为学技术，需要评估这些已知方法在损伤后较长时间点检测TBI诱导功能缺陷的敏感性。尽管目前已有多种啮齿类动物TBI模型，但FPI模型是应用最广泛的模型之一，本研究亦采用该模型。该模型最早于20世纪50年代发表2，此后已有超过1,000篇论文在大鼠中应用了FPI3这种损伤的神经病理学特征已由我们进行了详细描述4 及其他人5,6,7简而言之，通过损伤后短时间内使用Fluoro-Jade染色已证实，海马区的神经元损伤具有剂量依赖性。 即，24-48 小时；而损伤后一年时已报道出现明显的萎缩和空洞化，包括内囊和皮层的变薄6,7.

评估实验性脑损伤后行为学结果指标是衡量脑功能最有意义的方法。然而，绝大多数使用行为学结果指标的FPI实验仅在损伤后相对较早的时间点进行检测，通常为损伤后1至14天。而采用本文所展示的方法，某些行为缺陷可在损伤后长达12个月内被检测到1。神经功能、粗大前庭运动功能和精细运动协调能力分别在术后第1-3天以及术后3、6和12个月时，通过简短神经功能评估（Neuroscore；改良自Schallert8）、平衡木平衡任务（Beam-Balance task）和平衡木行走任务（Beam-Walk task）9,10,11进行评估。参考记忆和工作记忆则采用工作记忆版本的莫里斯水迷宫（Morris water maze）进行评估1,12,13。

方案

所有动物实验均首先由德克萨斯大学医学分部加尔维斯顿分校动物护理与使用委员会批准，遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（第8版，国家研究委员会）的规定。

1. 手术操作与液体冲击性创伤性脑损伤

  1. 从供应商处获取成年雄性300 g Sprague-Dawley大鼠，每笼饲养两只，并提供食物和水 随意摄取 在环境条件恒定的动物房中：光照周期（600 h 至 1,800 h）、温度（21 °C 至 23 °C）、湿度（40–60%）。
  2. 手术前，先对大鼠进行3至5天的抓握适应，然后在基线评估前1至3天内训练大鼠完成神经功能评分（Neuroscore）、横梁平衡（Beam-Balance）和横梁行走（Beam-Walk）实验。基线评估应在手术当天或手术前一日上午进行。
    注意：应始终以与损伤组相同的方式制备对照组大鼠，例如假手术组或未经手术的大鼠，并将大鼠随机或均衡地分入各治疗组。
  3. 在无菌条件下进行手术（使用无菌器械、清洁的手术服、无菌手套、口罩和头罩）。
  4. 使用异氟烷（4%诱导，1.5–2%维持）麻醉大鼠，进行气管插管并实施机械通气（使用空气：氧气（70:30）混合气体输送异氟烷），并按照先前所述方法准备进行旁矢状面液体打击损伤实验。14,15.
  5. 缝合前在伤口部位浸润0.10%布比卡因，并在苏醒前插入直肠对乙酰氨基酚栓剂（120 mg/kg）。 在恢复期间及术后次日至少监测大鼠4小时，观察是否存在感染、严重神经损伤（如瘫痪）或严重不适（如持续蜷缩姿势）的迹象。
    注意：出现上述任何症状的大鼠均应实施安乐死（在麻醉舱中使用4%异氟烷麻醉后断头）。

2. 神经功能评分训练与测试

  1. 神经功能评分训练
    1. 对于已知未经实验处理的大鼠，按以下顺序（步骤 2.2.1–2.2.5）完成全部测试，结束后放回原笼中静置 1 分钟，然后重复该过程，直至获得零分为止。
    2. 在评分表上记录每次训练试验的得分，以保留每只大鼠的训练记录。训练完成后，在同一天或次日进行一次测试（见下文）。
      注意：如果测试未得到基线零分，可重复训练和测试，或考虑将该大鼠转用于非行为学实验。
  2. 神经功能评分测试
    注意：按以下顺序完成各项测试，每次测试后将大鼠放回原笼中静置 1 分钟，然后重复测试两次，共完成三次。
    1. 前肢屈曲测试
      1. 抓住大鼠尾巴将其提起，使其距离桌面约 6–12 英寸（约 15–30 厘米）。
      2. 观察大鼠前肢是否伸展或屈曲。若出现屈曲记为 1 分，无屈曲记为 0 分。
        注意：屈曲为异常表现。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 3 分）。
    2. 后肢屈曲测试
      1. 抓住大鼠尾巴将其提起，使其距离桌面约 6–12 英寸（约 15–30 厘米）。
      2. 观察大鼠后肢是否伸展或屈曲。若出现屈曲记为 1 分，无屈曲记为 0 分。
        注意：屈曲为异常表现。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 6 分）。
    3. 视觉诱发放置测试
      1. 抓住大鼠尾巴将其提起。
      2. 缓慢将大鼠向桌缘下降，直至其鼻部距离桌缘约 10 cm。
      3. 缓慢将大鼠向桌缘移动（注意不要让胡须接触桌缘）。
      4. 观察大鼠是否向前伸出前爪朝向桌面。若未出现前爪伸展记为 1 分，出现记为 0 分。
        注意：对视觉刺激产生朝向桌面的抓取动作为正常反应。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 9 分）。
    4. 触觉诱发放置测试
      1. 用手握住大鼠身体，使其与桌缘平行，前肢自由悬空。
      2. 缓慢将大鼠向桌缘下降，直至其一侧胡须接触桌缘。
      3. 观察大鼠在胡须接触桌缘的瞬间，同侧前肢是否立即朝向桌缘伸展。
        注意：该反应的诱发需要大量练习，研究人员需经过充分培训以确保测试操作的一致性。
      4. 若未出现朝向桌面的抓取动作记为 1 分，出现记为 0 分。
        注意：对触觉刺激产生抓取动作为正常反应。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 12 分）。
      5. 对另一侧重复步骤 2.2.4.1–2.2.4.4。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 15 分）。
    5. 后爪抓握反射测试
      1. 用一只手握住大鼠，拇指和食指置于前肢下方胸部位置。
      2. 用另一只手的食指轻轻触碰一侧后爪掌面。
      3. 观察大鼠是否抓握食指。若未出现抓握记为 1 分，出现记为 0 分。
        注意：抓握反应为正常表现。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 18 分）。
      4. 对另一侧重复步骤 2.2.5.1–2.2.5.3。可能得分为 1 × 3 = 3 分（累计最高得分为 21 分）。
    6. 评分
      1. 将各项得分相加，累计最高得分为 7 × 3 = 21 分。零分为正常表现。

3. 束平衡训练与测试

  1. 设备
    1. 使用一根长 60 cm、宽 1.75 cm、高 4.0 cm 的横梁，将其置于距地面 90 cm 高处，并安装一个高 30 cm、宽 30 cm 的挡板。将横梁固定在桌面上，挡板连接其上，使横梁从挡板向外延伸 50 cm。
    2. 在横梁正下方放置一个带软垫的安全箱，以减轻跌落大鼠的着地冲击。
  2. 横梁平衡训练
    1. 在手术前 24–48 小时，将大鼠置于横梁上进行一次持续 60 秒的试验。
    2. 若大鼠无法自行维持平衡，允许其落入安全箱中。
    3. 当大鼠稳定地放置在横梁上时开始计时。
    4. 在 60 秒内观察大鼠的表现，并根据以下评分标准进行评分：1 = 保持稳定平衡（如理毛、行走、尝试攀爬挡板）；2 = 平衡不稳（抓握横梁两侧和/或动作摇晃）；3 = 试图保持平衡但在横梁上滑动或旋转，仅靠抱紧横梁维持；4 = 试图保持平衡，但在 10 秒后跌落；5 = 身体悬垂于横梁边缘并在 10 秒内跌落；6 = 立即跌落，未表现出任何维持平衡或抓握横梁的努力。
    5. 将评分记录在工作表上。
    6. 让大鼠在笼中休息 15 秒，然后重复步骤 3.2.1–3.2.5，直至大鼠连续三次获得 1 分或 2 分。此时认为该大鼠已完成训练。
    7. 在手术前 24 小时或手术当天进行一次术前评估。
  3. 横梁平衡测试
    1. 从手术后 24 小时开始，持续最多 4 天，每天对大鼠进行测试。
      1. 将大鼠放置在横梁上并启动计时器。在 60 秒内密切观察大鼠表现，并将评分记录在工作表上。
      2. 将大鼠放回笼中短暂休息（1–3 分钟）。
      3. 重复步骤 3.3.1.1–3.3.1.2，共完成三次测试。

4. 光束行走训练与测试

  1. 设备
    1. 使用一根长100 cm、宽2.5 cm、高4.0 cm的木梁。
    2. 准备一个可调节支架、一个可调节台面、四个高2 cm的插销，以及一个黑色目标箱，尺寸为长28 cm、高18 cm、宽18 cm，其一端设有足够大开口，允许大鼠通过。
    3. 将木梁的目标端连接至放置在可调节台面上的目标箱开口侧。在木梁起始端附近放置强光光源和白噪声发生器。木梁的起始端固定在可调节支架上，使木梁与目标箱处于同一水平高度，距地面约1 m。
  2. 木梁行走训练
    1. 在手术前24–48小时开始训练。
    2. 将大鼠放入目标箱中1分钟。1分钟后取出大鼠，开始试验。
    3. 开始试验时，打开光源和白噪声，将大鼠放置在靠近目标箱一侧的插销孔位置的木梁上，使其自行进入目标箱。
    4. 当大鼠的前肢越过目标箱的入口阈值时，立即关闭光源和噪声源（此为一次试验结束）。
    5. 每次试验之间，让大鼠在目标箱中休息30秒。
    6. 在每个插销孔位置及起始位置重复步骤4.2.3–4.2.5两次。将插销插入孔中，完成一次完整的带插销木梁行走测试。
    7. 进行三次计时木梁行走试验。
      1. 将大鼠从目标箱中取出。打开白噪声和光源，将大鼠放置在木梁上时立即启动秒表。当大鼠的前肢越过目标箱入口阈值时，立即停止计时，并关闭光源和噪声。
      2. 将所用时间记录在记录表上。
      3. 重复步骤4.2.7.1–4.2.7.2，直至大鼠连续三次完成时间达到5秒或更短。此时认为大鼠已完成训练。
  3. 木梁行走基线评估
    1. 在手术当天或手术前一日上午，使用插销进行三次计时试验。
    2. 首先将大鼠放入目标箱中30秒。随后将其从目标箱中取出，打开白噪声和光源，将大鼠放置在木梁的起始端，同时启动秒表。当大鼠的前肢越过目标箱入口阈值时，立即关闭光源和噪声源，并停止计时。
    3. 将所用时间记录在记录表上。让大鼠继续留在目标箱中休息30秒。
    4. 重复步骤4.3.2–4.3.3，直至记录表上获得三次潜伏期数据。完成三次计时试验后，将大鼠放回其饲养笼中。
  4. 木梁行走测试
    1. 从手术后24小时开始，每天对大鼠进行测试，持续最多4天。按照步骤4.3的方法进行三次计时试验。

5. 工作记忆水迷宫

  1. 设备
    1. 使用一个装有水的水箱，水位高度为 28 cm，并维持水温在 26 ± 1 °C。
    2. 使用一个直径为 10 cm 的透明亚克力玻璃平台，放置在高度为 26 cm 的支架上。
      注意：平台的顶面应涂覆硅胶，形成一个带有交叉“X”形状的圆形区域。这有助于大鼠攀爬到平台上，并提供抓地力，防止其滑落。
    3. 准备秒表、加热灯、一次性毛巾、吸水垫、备用笼子以及一个小的长柄水族箱鱼网。使用与摄像机连接的计算机化视频追踪系统记录大鼠游泳过程，并将数据传输至计算机。将视频和数据保存在计算机中以供后续分析。
  2. 工作记忆水迷宫测试
    1. 连续五天，每天对大鼠进行四组试验，将平台依次放置在四个象限中的每一个位置，并从四个起始点（N、S、E、W）分别开始试验，具体操作如下所述。
    2. 首先确定在整个实验过程中使用的起始位置与平台位置的配对方案。
      注意：平台所在象限和起始点的顺序在五天测试中每天应不同，但对每只大鼠而言必须保持一致。
      1. 使用四个起始点（N、S、E 或 W）和四个平台位置（象限 1、2、3 或 4；图 1）。例如，(N, 2；E, 4；S, 1；W, 3；见 图 1)。设计一个平衡的顺序（非随机），避免起始点过于靠近平台位置（即起始点不应与平台位于同一象限）。使用平台象限和四个起始点建立数据记录表。
      2. 编写视频追踪软件的实验方案，用于录制大鼠游泳视频并收集特定数据（例如，游泳持续时间、速度、找到平台前游过的距离）。
        注意：追踪软件将在设定的时间结束后自动停止记录。该方案应允许设定平台位置、每只动物进行的试验次数、每批次测试的动物数量，以及允许的最大持续时间（例如，120 s）。
      3. 每批次测试 4–6 只大鼠。
        注意：超过 6 只大鼠会导致操作时间安排紧张，可能引起操作者误差，同时加热箱也会变得拥挤。
    3. 试验 1
      1. 打开视频追踪软件，加载正确的实验方案，包括水迷宫地图。
      2. 将平台放置在指定位置（例如，2；图 1），并确认其与软件中的地图一致。设置追踪软件，以便在大鼠进入摄像机视野时立即开始记录。
      3. 将大鼠面朝水箱壁放入指定起始位置（例如，N；图 1），并立即启动计时器。
      4. 允许大鼠在 120 s 内寻找平台。当大鼠找到平台时，停止计时，并在记录表上记下所用时间。若大鼠未能在规定时间内找到平台，则手动引导其至平台，并记录时间为 120 s。让大鼠在平台上停留 15 s。
    4. 试验 2
      1. 确认软件已准备就绪进行试验 2。将同一只大鼠以相同起始位置（N）重新放入水箱中。重复步骤 5.2.3.4。
    5. 完成试验 2 后，将大鼠放入加热箱中保温 4 分钟。将平台移至第二个位置（4；图 1），并确认其与软件中的地图一致。
    6. 重复试验 1 和试验 2 的操作步骤（步骤 5.2.3–5.2.4），直至完成全部四个起始位置与平台位置的配对测试。

6. 数据分析

  1. Neuroscore
    1. 将手写结果手动录入计算机电子表格中。
    2. 将每次试验的结果相加，得到每只大鼠每天的三个评分。
    3. 根据软件要求，将数据格式化为适用于统计分析的长格式或宽格式。
      注意：长格式中有一个单独的处理列（在本例中，该列包含 "初始的", "假手术组"，或 "创伤性脑损伤"），一天一列（本例中 "0", "1", "2" 或 "3"），以及一个用于试验的单列（either "1", "2" 或 "3"）。宽格式中，每个因子水平的组合对应单独一列（因此，“Naïve、第0天、第1次试验”对应一列，“Naïve、第0天、第2次试验”对应另一列， 等等。)
    4. 计算每只动物每天的平均得分。由于每天进行了三次试验，因此每只动物每天会有三个数值。
    5. 评估数据是否呈正态分布。采用非参数统计方法（例如，采用Kruskal-Wallis检验分析各组在每天评分上是否存在差异。由于这些数据并非连续变量，且不服从正态分布。
    6. 为了确定差异所在，进行以下操作 事后 检验，例如 Tukey's 事后 分析。
      注意：此处使用 R 统计软件包16Kruskal.test() 函数以及成对多重比较均值秩包（PMCMR）中的 posthoc.kruskal.nemenyi.test 函数17 被使用。
    7. 此外，检验各组内不同时间点之间是否存在差异。
      注意：例如，要查看假手术动物在第0天与第1天、第2天或第3天的行为是否存在差异。为此，应进行单因素重复测量方差分析（one-way repeated measures ANOVA）。在R语言中，可通过ez包中的ezANOVA函数实现该分析。
    8. 进行重复测量方差分析前，首先应检验球形假设。
      注意：此处数据显示，NAÏVE组和SHAM组的组内因子（Day）满足球形假设，但TBI组不满足。因此，NAÏVE组和SHAM组无需进行校正；对于TBI组的数据，应采用Greenhouse-Geisser校正。
    9. 如果发现显著差异，则运行一个 事后 用于确定差异所在位置的检验。在R中可通过成对比较实现 t-测试功能。将结果绘制成箱线图，如代表性结果所示（图2).
  2. 梁式天平
    1. 手动将手写记录的分数录入计算机电子表格中。根据所用软件的偏好，将数据格式化为长格式或宽格式，以进行统计分析。参见步骤6.1.3中的注释。
    2. 将每只大鼠每天的各项评分取平均值，使每只大鼠每天获得一个综合评分。为检验NAÏVE、SHAM和TBI组在每一天的评分是否存在差异，需首先评估数据是否呈正态分布。
      注意：本例中，由于数据不连续，因此不符合正态分布。应采用非参数统计检验方法例如，Kruskal-Wallis 检验）。
    3. 要确定差异所在，请执行以下操作 事后 检测 例如，Tukey法 事后 分析。为了检验每个处理组内不同时间点之间的差异，进行单因素重复测量方差分析（见步骤 6.1.7）。检验球对称性假设。
      注意：本研究数据显示，组内因子（Day）在所有组中均不满足球形假设，因此采用连续性校正。使用Greenhouse-Geisser连续性校正。
    4. 在箱线图中绘制结果，如代表性结果所示（图3).
  3. 光束漂移
    1. 手动将手写记录的结果转录至计算机电子表格中。计算每只动物每天三次平衡木行走潜伏期的平均值。将数据整理成适合统计分析的格式（参见步骤 6.1.3）。
    2. 评估数据是否呈正态分布。
      注意：本案例中，数据为连续性数据且呈正态分布。因此，应采用单因素方差分析（one-way ANOVA）来判断Naïve、SHAM和TBI组在每一天的潜伏期是否存在差异。
    3. 为了观察同一处理组内不同时间点之间是否存在差异，进行单因素重复测量方差分析（one-way repeated measures ANOVA）。首先检验球形假设。
      注意：本研究数据显示，组内因子（Day）在所有组中均不满足球形假设，因此需采用连续性校正。使用 Greenhouse-Geisser 校正。
    4. 在箱线图中绘制结果，如代表性结果所示（图4).
  4. 工作记忆水迷宫
    1. 将数据从工作表或计算机追踪程序中导入电子表格。选择需分析的结果指标。
      注意：计算机追踪程序可提供多种可用于分析的结果。可选择用于分析的结果示例包括潜伏期、路径长度、趋壁性以及游泳速度。其中最常报告的结果是潜伏期，如本示例中所采用的。
    2. 根据软件偏好，将数据格式化为长格式或宽格式以进行统计分析。
      注意：长格式在处理列中仅有一个单列（本例中，该列包含 "初始的", "假手术组"，或 "创伤性脑损伤"），一天一列（本例中 "1", "2", "3", "4"，或 "5"）以及一个用于试验的单列（ Either "1", "2", "3", "4", "5", "6", "7"，或 "8"）。我们还需要一列额外的列来标识尝试次数（无论是 "1" 或 "2"）。宽格式为每个因子水平的组合设置单独的一列（例如，针对“Naïve、第1天、试验1、尝试1”设一列，针对“Naïve、第1天、试验2、尝试2”设另一列）。此外，可针对每次会话计算试验1与试验2之间的差异，并将该差值作为差异分数进行分析。
    3. 为了确定损伤组之间是否存在总体差异，请执行以下步骤。
      1. 首先，计算每只动物在第1天的水迷宫潜伏期的平均值。
        注意：每天有四个阶段，因此对每次试验（试验1和试验2）中每只动物的四个数值取平均值。对后续各天也进行相同的计算。
      2. 为整体评估损伤差异，进行双因素重复测量方差分析（ANOVA）。包含两个因素：损伤和时间点。其中，损伤为组间因素，时间点为组内因素。注：此处使用 R 软件进行分析。
      3. 如果结果表明损伤导致了显著差异，则进行 Tukey 检验 事后 检验差异所在位置。
    4. 要了解不同损伤组在特定日期之间是否存在差异，请执行以下步骤。
      注意：以第1天为例进行说明，后续每一天均需进行相同的分析。此外，该分析需以多种方式进行：首先仅针对试验1，其次仅针对试验2，最后分析试验1与试验2之间的差异。此处以试验1为例进行说明；其他分析需采用相同的步骤。
      1. 首先，计算每只动物在第1天的水迷宫潜伏期的平均值。由于该天进行了四次重复实验， "试验1" 每天对每只动物的四个数值取平均值。
      2. 评估数据是否呈正态分布。
        注意：本例中数据为连续性数据，且呈正态分布。因此，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验NAÏVE、SHAM和TBI三组在第1天水迷宫潜伏期是否存在差异。分析使用R统计软件包中的aov()函数进行。
      3. 使用5%的显著性水平。如果得到的结果 p若 p 值小于 0.05，则组间存在显著差异。
      4. 为了确定这些差异的具体位置，使用Tukey法 事后 检验。这是 R 中的 TukeyHSD() 函数。
    5. 要查明处理组内各天之间是否存在差异，请遵循以下步骤。
      1. 首先，进行单因素重复测量方差分析。在 R 中可使用 ez 包中的 ezANOVA 函数实现该分析。
      2. 在进行重复测量方差分析之前，首先应检验球形假设。
        注意：各组内的因素（Day）均满足球形假设，因此无需使用连续性校正。
      3. 若发现不同天数之间存在差异（p- 值小于 0.05 时，进行后续分析 事后 用于确定差异具体位置的检验。此步骤在 R 中通过使用 pairwise.t.test 函数实现。
    6. 使用折线图绘制结果（图5）。此外，还可以绘制试验1与试验2的对比图。

结果

神经评分程序的结果（图2) 既展示了假阳性结果的可能性（第0天的假手术组和TBI组），也体现了该检测方法在识别微小差异方面的敏感性。当大鼠对实验操作未充分适应时，可能无法完全放松，从而导致假阳性结果。第0天为手术前，因此理想情况下，所有大鼠在进入研究前均应达到评分为0的标准。第1至3天的结果则反映了该检测方法对评分微小变化的敏感性。尽管评分最高可达21分，但在本模型中，评分超过3分的情况较为罕见。在此示例中，重复测量方差分析（ANOVA）显示，NAÏVE组在各时间点之间无显著差异p = 0.78）或 SHAM（p = 0.09）；然而，对于TBI组而言，各天之间存在差异（p < 0.05). 事后 成对比较表明，第0天与第1、2、3天之间存在显著差异。该结果表明，损伤在神经学评估中引起了虽小但显著的变化。

进一步采用 Kruskal-Wallis 检验对每一天的 NAÏVE、SHAM 和 TBI 组进行比较，随后进行 Tukey's post-hoc 检验以确定差异的具体来源。在第 0 天，检验统计量为 13.37，p = 0.001，SHAM 组与 NAÏVE 组之间存在显著差异（p = 0.008）。理想情况下，第 0 天各组之间应无任何差异，因为尚未实施任何处理或操作。在此情况下，应进一步使大鼠适应实验操作，或将其转入非行为学研究。在第 1 天，检验统计量为 32.39，p = 9.75e-8，post-hoc 检验显示 SHAM 组和 TBI 组均显著不同于 NAÏVE 组（p = 0.002，p = 5.9e-7）。在第 2 天，检验统计量为 23.39，p = 8.34e-6，SHAM 组和 TBI 组均与 NAÏVE 组存在显著差异（p = 0.002，p = 6.8e-5）。在第 3 天，检验统计量为 38.4，p = 4.59e-9，SHAM 组和 TBI 组再次显著不同于 NAÏVE 组（p = 0.001，p = 2.1e-8）。这些结果表明，SHAM 手术本身在损伤后早期也可能导致一定程度的神经功能评估缺陷。

典型的平衡木实验结果（图3）显示，平衡木测试在损伤后不久（图3，左）以及损伤后较长时间（图3，右）均能敏感地检测出功能缺陷。然而，随着未损伤大鼠的年龄增长和体重增加，它们在平衡木上保持平衡的难度加大，导致平衡木测试对脑损伤效应的敏感性随时间推移而降低。在较晚的时间点，需将平衡木翻转，使大鼠在较宽的一侧保持平衡。尽管如此，在损伤后6个月，该测试已不再对损伤效应敏感，因为年龄和/或体重因素干扰了任务执行能力（图3，右）。另一种可能是前庭系统已发生修复，这些数据准确反映了大鼠的平衡能力已恢复至对照组水平。

在比较每天空白对照组、假手术组和TBI组时，我们采用了Kruskal-Wallis检验。损伤后早期时间点的结果如图所示 图3，左侧。在第0天，Kruskal-Wallis检验得到的检验统计量值为6.81， p = 0.033。各组之间存在显著差异，经Tukey法检验 事后 检测结果显示，Naïve 组与 SHAM 组存在差异（p = 0.038）；然而，所有三组的均值均远低于2.0，表明所有大鼠均符合继续实验的标准。尽管在第0天各组之间 ideally 无差异更为理想，但由于所有组别均值均低于2，因此均可继续进入研究。在PID 1时，Kruskal-Wallis检验统计量为69.72， p = 7.25e-16。Tukey's 事后 检验结果显示，TBI组与Naïve组和Sham组均有显著差异（p = 4.9e-14 p = 9.1e-08）。第2天，Kruskal-Wallis检验统计量为62.84，且 p = 2.26e-14，且 事后 测试显示TBI与NAÏVE和SHAM不同（p = 1.0e-10 p 分别为 2.1e-10）。第3天，Kruskal-Wallis 检验统计量为 62.69，且 p = 2.44e-14。该 事后检验 检测显示TBI与Naïve和SHAM不同，（p = 9.6e-12 p = 1.7e-08）。我们进一步分析了各组内不同时间点之间是否存在差异。采用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）发现，NAÏVE 组各时间点之间无显著差异（p = 0.367）。SHAM组与TBI组在不同时间点之间存在差异（p = 0.002, p = 3.90e-29）。 事后 成对比较显示，假手术组第1天与第2天及第3天相比具有显著差异（p = 0.001, p = 0.01），而对于TBI，第0天与第1、2、3天相比具有显著差异（p < 2e-16 p = 5.5e-16，且 p = 2.7e-13）。第1天与第3天之间也存在显著差异（p = 0.036).

伤后6个月时，采用Kruskal-Wallis检验在每一天对NAÏVE、SHAM和TBI组进行比较（图3，右侧）。在第0天，检验统计量的值为3.36，且 p = 0.187，因此第0天各组间无差异。所有均值均低于2，表明所有大鼠及各组均符合继续参与研究的标准。在PID 1时，检验统计量为6.11， p = 0.047；然而， 事后 使用Tukey法进行分析 事后 检验结果显示，在校正多重假设检验后，各组之间无显著差异。第2天的检验统计量为4.09， p = 0.13，无显著性差异；在第3天，检验统计量为2.91， p = 0.23，无显著性差异。因此，在任何指定时间点，各损伤组之间均无差异。

此外，通过观察各治疗组内不同时间点之间的差异，重复测量方差分析显示，NAÏVE、SHAM和TBI组在不同天数之间均存在显著差异（p = 0.0003，p = 2.61e-5，p = 5.59e-7，分别对应；图3，右侧）。事后检验（post-hoc）揭示了以下差异：在NAÏVE组中，第0天与第1、2、3天之间差异显著（p = 0.002，p = 0.044，p = 0.004，分别对应）；在SHAM组中，所有时间点之间均存在显著差异：第0天与第1、2、3天差异显著（p = 0.0006，p = 0.001，p = 0.0006，分别对应）；第1天与第2、3天差异显著（p = 0.031，p = 0.0006，分别对应）；第2天与第3天差异显著（p = 0.044）；在TBI组中，第0天与第1、2、3天之间差异显著（p = 0.0005，p = 0.0008，p = 0.0005，分别对应）。

横梁行走实验的结果显示在两个时间点（图4）。与横梁平衡实验相似，该实验可在损伤后早期检测到功能缺陷（图4，左图）。然而，在损伤后6个月时，各组之间无显著差异（图4，右图），提示损伤组已发生恢复。此结果可能反映了年龄较大和体重增加的影响。

为了比较损伤后早期各天 NAÏVE、SHAM 和 TBI 组之间的差异，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。第 0 天无显著差异（F = 0.859，p = 0.426），所有潜伏期均低于 5 秒，表明所有大鼠均符合继续参与研究的标准。在损伤后第 1 天（PID 1），检验统计量显著，为 15.36，p = 1.18e-6。Tukey 事后检验（post hoc test）显示，TBI 组与 NAÏVE 组之间（p = 0.000004）以及 TBI 组与 SHAM 组之间（p = 0.0001）存在显著差异。第 2 天，各组间存在显著差异（F = 9.49，p = 0.0002）。事后检验（post-hoc testing）结果显示，TBI 组与 NAÏVE 组（p = 0.0002）以及 TBI 组与 SHAM 组（p = 0.005）之间存在差异。第 3 天，总体检验统计量为 6.27，p = 0.0025，表明各组之间存在差异。Tukey 事后检验（post-hoc test）显示，TBI 组再次与 NAÏVE 组和 SHAM 组存在显著差异（p = 0.003，p = 0.035，分别对应）。

采用单因素重复测量方差分析（one-way repeated measure ANOVA）探索各治疗组内不同时间点之间的差异。首先检验每个组的球形假设。NAÏVE组和SHAM组的组内因子（Day）均不满足球形假设，因此对这两个组应用Greenhouse-Geisser连续性校正。对于SHAM组，各时间点之间无显著差异（p = 0.066），对于NAÏVE和TBI组则存在（p = 0.006, p = 2.89×10⁻⁷，分别）。 事后 比较显示，对于NAÏVE，差异存在于第0天与第1天之间（p = 0.003）。对于创伤性脑损伤（TBI），差异存在于第0天与第1、2、3天之间（p = 9.2e-6, p = 0.0005, p = 0.002），且第1天与第3天之间存在差异（p = 0.018).

伤后6个月时，NAÏVE、SHAM和TBI组在任何一天均无显著差异（第0天，F = 0.315，p = 0.732；第1天，F = 0.336，p = 0.717；第2天，F = 0.5，p = 0.61；第3天，F = 1.17，p = 0.322；图4，右侧）。当比较各组内不同时间点之间的差异时，TBI组存在显著差异（p = 0.026），其中第0天与第1、2、3天均不同（p = 0.026，p = 0.002，p = 0.002）。NAÏVE组和SHAM组在任意时间点之间均无显著差异（p = 0.104，p = 0.063， respectively）。

Morris水迷宫工作记忆版本的数据可以通过多种方式绘图。此处我们展示了损伤后3个月（图5，左）和12个月（图5，右）的结果，采用线图表示时间进程，箱形图提供数据的总体汇总（图5，底部）。我们还可以分别可视化每天的第1次试验与第2次试验的比较结果，以及损伤导致的总体差异。第1次试验的潜伏期反映参考记忆，第2次试验的潜伏期反映工作记忆。

损伤后3个月大鼠的数据如图所示 图5，左侧。对于试验1（图5，左上）中，在比较NAÏVE、SHAM和TBI组时，仅第4天显示出组间显著差异F = 4.12, p = 0.025），且 事后 Tukey 检验显示，TBI 与 NAÏVE 存在差异（p = 0.019）。对于试验 2（图5，中左），第1天存在显著差异（F = 5.93, p = 0.006），且 事后 分析表明，TBI 与 SHAM 不同（p = 0.005）。重复测量方差分析在3个月时未发现损伤组间存在总体差异（p = 0.56）。这些结果表明，这些大鼠在损伤后3个月时，参考记忆和工作记忆均存在轻微但显著的缺陷。

伤后12个月，比较试验1的NAÏVE、SHAM和TBI组图5，右侧），重复测量方差分析显示损伤具有显著的整体效应（F = 3.94, p = 0.03）。成对比较显示，TBI 与 NAÏVE 和 SHAM 均存在显著差异（p = 0.043 和 p = 0.006，分别）（图5，右下角）。此外，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）对每天的损伤组进行比较，在第3天检测到显著差异（F = 7.28, p = 0.003). 事后 比较显示，TBI 与 SHAM 不同（p = 0.0018) (图5，右上角）。对于试验2，重复测量方差分析发现损伤导致的差异具有统计学意义（F = 3.97, p = 0.029），且 事后 成对比较检测 TBI 与 SHAM 之间的差异（p = 0.017) (图5，右下角）。对每一天进行单因素方差分析，结果显示第2天和第4天存在显著差异。第2天（F = 4.02, p = 0.028），Tukey's 事后 检验发现，TBI 与 SHAM 存在差异（p = 0.023）。第4天（F = 4.12, p = 0.026), 事后 分析发现TBI与SHAM之间存在差异（p = 0.025) (图5，中右。

显示四个编号点指示方向 N、E、S、W 的罗盘图。
图 1. 水迷宫示意图。 本图展示了工作记忆型莫里斯水迷宫中可能的平台位置（1、2、3、4）和起始点（N、S、E、W）。每对起始位置与平台位置组合允许大鼠进行两次试验。每次试验之间有 15 秒的间隔，每对试验之间在加热舱内休息 4 分钟，每个日间实验共进行四对试验。请点击此处查看此图的放大版本。

损伤后三天内对 naive、sham 和 TBI 评分的柱状图比较；统计分析结果。
图2. 神经评分测试结果。 所有大鼠在第0天前均接受了简单反射测试任务的训练（训练、测试和评分的详细信息见正文）。结果以中位数（黑线）、第一和第三四分位数（方框边界）以及第10百分位数表示。th 和 90th 百分位数（误差线）。均值由红线表示，离群点以黑点表示。数据展示了伤后第0天（基线）以及伤后第1至第3天的情况。结果的 事后 t 检验每个时间点的检验结果均显示在图中：* p < 0.001 对比 TBI 第0天；^ p < 0.001 对比同日初始型（NAÏVE）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

TBI 恢复评分的箱线图分析；显示伤后 0-3 天和 6 个月的数据。
图3. 木梁平衡测试结果。 所有大鼠均接受平衡训练，直至能够连续三次在横梁上保持平衡达60秒（训练、测试及评分细节见正文）。在后续测试中，大鼠的评分采用1–6分制，1分表示平衡正常，6分表示完全未尝试停留在横梁上。结果以中位数（黑线）、第一和第三四分位数（方框边界）及10th 和 90th 百分位数（误差线）。均值以红线表示，离群点以黑点表示。数据展示了伤后第0天基线评分、伤后第1-3天（左）和伤后6个月（右）的结果。 事后 t 检验每个时间点的检验结果均显示在图中。对于第 0-3 天：* p < 0.001与TBI第0天相比；^ p < 0.001 与同日初始型（NAÏVE）相比；@ p < 0.001 与同日假手术组比较。6 个月时：* p < 0.001与TBI第0天相比；# p < 0.001 对比 初始状态 第0天； & p < 0.001 对比假手术组 第0天 请点击此处查看此图的放大版本。

不同时间点比较幼稚组、假手术组和TBI组损伤后评分的箱线图；实验数据。
图4. 穿杆实验结果。 所有大鼠均经过训练，使其在杆上行进时穿梭于柱子之间，以逃入安全箱。训练持续至大鼠连续三次试验的成绩达到 ≤ 5 秒的标准（训练、测试及评分的详细信息见正文）。基线测试于损伤后第 0 天完成，随后在损伤后第 1 至 3 天进行测试（左图）。部分大鼠还在损伤后 6 个月时重新进行了测试（右图）。结果以中位数（黑线）、第一和第三四分位数（方框边界）以及第 10 百分位数表示th 和 90th 百分位数（误差线）。均值由红线表示，离群点以黑点表示。结果的 事后 每个时间点的检测结果均显示在图中。对于第 0-3 天：* p < 0.001与TBI第0天相比；^ p < 0.001 对比同日初始型；@ p <0.001 与同日假手术组比较；持续 6 个月：* p < 0.001与TBI第0天相比 请点击此处以查看此图的放大版本。

认知功能表现图；TBI后潜伏期与试验次数的关系，涉及未处理组、假手术组和TBI组。
图5. 工作记忆型莫里斯水迷宫实验结果。 结果显示了3个月（左列）和12个月（右列）时各组大鼠的独立数据。 上图 显示五个测试日中，每天双试验配对第一次试验的平均潜伏期（大鼠找到隐藏平台所需的时间）。 中间的图面板 显示每天第二次试验的平均潜伏期。结果的 事后 分析结果在图中显示（* p < 0.05 对比同日假手术组；^ p < 0.05 对比同一天的初始状态（NAÏVE）。 下层面板 总结展示结果 中位数（黑线）, 25th 和 75th 百分位数（箱线图的边界）以及 10th 和 90th 百分位数（误差线）。均值由红线表示，离群点以黑点表示。结果的 事后 分析结果如图所示（*p < 0.05 与相同试验的假手术组相比，^ p < 0.05 对比相同试验的NAÏVE组。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在进行任何类型的行为学测试时，保持一致性至关重要。这一细节包含许多看似微不足道但对动物反应具有重大影响的考虑因素。一个不可忽视的重要步骤是在实验开始前使动物适应其笼舍/饲养环境。这一准备可降低动物生理应激反应的影响，而应激反应可能改变行为学结果18。同样，必须尽一切努力以相同的方式对待所有动物。这种一致性包括前文提到的对饲养环境的适应，以及在训练或测试前对抓取和在不同房间之间转运的适应。这一原则的重要性再怎么强调也不为过。粗暴的动物操作会对任何行为学测试造成灾难性影响19。同样，应尽一切努力在每天相同的时间段进行动物测试，无论是在其黑暗期还是光照期。对于本文讨论的测试，在光照期或黑暗期进行测试均可接受，前提是测试时间保持一致。已有研究表明，在昼夜节律周期的不同时间点进行测试会改变行为学结果18,20。此外，操作人员和动物本身都必须处于无应激、平静的状态，以最大限度地提高实验结果的准确性。

在进行Neuroscore评估时，假阳性与假阴性结果较为常见。假阳性通常发生在动物尚未充分适应抓取和测试操作的情况下。实验动物必须完全放松，以确保所观察到的反应为反射性反应，而非因应激或恐惧导致肌肉紧张所引发的反应。操作者若处于紧张状态，可能会将应激传递给动物，从而影响实验结果。因此，抓握大鼠过紧或过松均可能带来问题。此外，若操作者表现出紧张情绪，也可能干扰大鼠的行为反应。同时，缺乏经验的观察者还存在误判大鼠反应的风险。良好的培训和大量实践对于确保Neuroscore评估的成功性和结果一致性至关重要。

通常，这些实验的主要问题是处理组之间差异较小，有时甚至没有差异。由于动物可能对不同的操作人员、噪音、一天中的不同时段以及可能的季节变化产生不同反应21，因此必须尽一切努力减少所有可能的混杂因素。

此处展示的平衡木行走和平衡梁任务结果表明，这些测试在损伤后早期可用于检测前庭运动功能的缺陷。这类缺陷通常会随着时间推移而逐渐恢复1,14。在本模型中，损伤后6个月时，由损伤引起的功能缺陷已完全恢复。6个月时间点的结果显示，NAIVE、SHAM和损伤大鼠之间无显著差异；然而，所有大鼠在此期间均在各自的饲养笼中静养了6个月，经历了自然衰老和体重增加。因此，当它们在术后6个月（或NAÏVE组相应时间点）重新接受测试时，实际上已处于年老肥胖状态，故各组的表现均不如其基线第0天的结果。

另一个重要的考虑因素是所使用的行为学测试是否恰当。例如，本文所采用的测试被认为能够反映特定脑区的功能。一个例子是前庭系统，它对维持平衡至关重要。参与感觉运动功能的脑区，如包括感觉运动皮层在内的大脑皮层、丘脑、皮质脊髓神经元、基底神经节、黑质-纹状体等，均参与前庭运动协调。因此，平衡木测试（Beam-Balance）或行走木测试（Beam-Walk）中的表现缺陷提示这些脑区可能存在功能异常。此外，海马和前额叶皮层参与工作记忆水迷宫所检测的学习与记忆功能。即使选择了正确的测试方法，也必须牢记所用测试的局限性。例如，本文介绍的这些测试均无法敏感地检测情绪方面的缺陷，如抑郁、焦虑，或社交互动行为中的攻击性、决策能力或冲动性等。重申一点，必须根据待评估的行为和脑区选择合适的测试方法。

对行为学数据的解释与分析必须谨慎进行。强烈建议对每种类型的测试分别进行功效分析，因为将行为学结果作为神经功能缺损的衡量指标，本质上是对微小效应的一种粗略测量。此外，不同测试需要采用不同类型的统计分析方法。例如，本文所述的神经功能评分（Neuroscore）和横梁平衡（Beam-Balance）测试依赖于经过培训的观察者使用有序量表对行为进行评分。这类数据不属于连续型数据，也不符合正态分布，因此应采用非参数统计方法，如Kruskal-Wallis检验，如第6.1和6.2节所示。相比之下，横梁行走（Beam-Walk）测试和工作记忆水迷宫测试所产生的数据为连续型且符合正态分布，因此可采用参数统计方法，如单因素方差分析（one-way ANOVA）或重复测量双因素方差分析（repeated-measures two-way ANOVA），如第6.3和6.4节所示。

本文所介绍的行为学任务经受了时间的检验，能够产生可重复的结果，尤其在与大鼠FPI模型联用时效果显著，尽管目前还存在许多其他用于脑损伤的行为学检测方法。神经评分是一种简短的评估方法，仅需最少的设备即可完成。其他可用于神经功能评估的反射和力量测试也可纳入，例如侧向推力任务、运动不能试验、斜面试验和抓力测试（参见Fujimoto et al.22 和 Gold et al.23）。文中描述的平衡木行走（Beam-Balance）和平衡木通过（Beam-Walk）任务用于评估损伤后的前庭运动功能缺陷。前庭运动协调性可视为粗大运动行为的一种指标，而其他评估粗大运动功能障碍的方法还包括转棒试验（Rotarod）、旋转杆试验和开放场地活动测试。在水迷宫实验中测得的游泳能力（以游泳速度表示）也是粗大运动协调性的指标之一22,23。工作记忆水迷宫任务通过检测参考记忆缺陷（由第1次试验反映）和工作记忆缺陷（由第2次试验或第1次与第2次试验之间的差异反映），完善了这一整套测试体系。其他认知功能评估方法还包括八臂放射迷宫、巴恩斯迷宫、新物体识别试验以及多种水迷宫变体，后者包括原始的莫里斯水迷宫（Morris water maze）和Lashley III迷宫（同样参见Fujimoto et al.22 和 Gold et al.23）。该系列测试已被证实可在损伤后早期有效使用，并在不同程度上适用于损伤后长达12个月的评估1。

此外，本文展示的任务可适用于不同品系、性别和年龄的大鼠；但可能需要根据体型差异以及更脆弱的情况作出相应调整。例如，年龄较大、体重较重的大鼠在进行平衡木任务时需要更宽的横梁，而年老体弱的大鼠在进行水迷宫实验时可能需要缩短游泳时间。因此，这些测试具有一定的灵活性，也有潜力开发新的测试方法，以适应不同的实验条件和研究假设。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Ian Bolding 在受试者手术准备方面的协助，以及 Elizabeth Sumner 的细致编辑。这些研究是作为摩迪创伤性脑损伤转化研究项目资助团队的一部分完成的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sprague-Dawley 大鼠Charles Rivers Laboratories
251 Ballardvale St
马萨诸塞州威尔明顿，01887-1096
电话：800-522-7287		CD-IGS 大鼠，品系编号 001雄性，白化，到达时体重300-350克
名称公司货号评论
平衡木测试
平衡木自制木头，25" l x 1" h × 3/4" 用聚氨酯清漆密封
C形夹家得宝1422-C2 1/2"
屏障家得宝泡沫塑料，18" x 17 1/2"
（适用于 BB 的表格） &和 BW）通用办公用品37" h × 30" w x 60" l
名称公司目录编号评论
平衡木行走
平衡木自制木料 38-1/2" l × 1-3/4" h x 1" w 用聚氨酯清漆密封（约 37" 离地
逃生箱自制木制，涂黑，12 1/2 " l x 9" h × 7-1/4" w
钉子（插销）2"
铰链
夹子
白噪声发生器San Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8, San Diego, CA 92121
电话：(858)530-2600		http://www.sandiegoinstruments.com/libraries/misc/datasheets/whitenoise.pdf
光家得宝
姓名公司目录编号评论
莫里斯水迷宫
玻璃钢泳池制造商未知
（类似于 SDI 生产的设备）圣迭戈仪器公司7000-072372" 直径 × 30" 深（约 500 加仑）
有机玻璃平台由Maggie Parsley手工制作10 cm 直径，26" 平台表面涂有硅胶以提供防滑抓握面
（类似于 SDI 生产的设备）SDI7500-0272
带盖的聚甲基丙烯酸甲酯动物箱UTMB 机械加工车间2 个盒子，10" w x 16" L x 9" h
聚光灯/加热灯家得宝3 个围绕水池，2 个置于箱子上方用于干燥动物
AnyMazeSan Diego Instruments
9155 Brown Deer Rd, Suite 8, San Diego, CA 92121
电话：(858)530-2600		/9001http://www.sandiegoinstruments.com/any-maze-video-tracking/

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