DNA纳米管作为研究半柔性聚合物的多功能工具

摘要

半柔性聚合物展现出独特的力学特性，这些特性在生命系统中被广泛应用。然而，由于聚合物刚性等性质难以测量，目前对生物聚合物的系统性研究仍然有限。本文描述了如何利用可编程的DNA纳米管克服这一限制，从而实现对丝状结构刚性影响的实验研究。

摘要

诸如细胞或生物聚合物网络等复杂的聚合物基软物质的力学特性，无法用柔性聚合物或刚性杆的经典理论框架来解释。其内部的纤维由于具有不可忽略的骨架刚度而保持伸展状态，这种刚度通过持久长度（l_p）进行量化，但同时也会受到强烈的热涨落影响。有限的弯曲刚度导致了体相网络独特且非平凡的集体力学行为，使其能够在低体积分数下形成稳定的支架结构，同时具备较大的网孔尺寸。这一基本原理在自然界中广泛存在（例如，在细胞或组织中），可最小化高分子含量，从而促进扩散性或主动运输过程。由于其在生物学上的重要意义以及在生物相容性水凝胶中的潜在技术应用，半柔性聚合物已成为大量研究的对象。然而，以往的可理解性研究一直面临挑战，因其依赖于如肌动蛋白纤维等天然聚合物，而这些天然聚合物无法自由调节。尽管存在这些局限性，且由于缺乏可机械调控的合成型半柔性聚合物，肌动蛋白纤维仍被确立为通用的模型体系。一个主要限制在于，核心参数 l_p 无法自由调节，因而难以研究其对宏观体相结构的影响。这一限制已通过使用结构可编程的DNA纳米管得以解决，实现了对纤维刚度的可控调节。这些纳米管通过基于“瓦片”（tile）的设计形成，其中一组部分互补的短链在特定周长的环状结构中杂交。这些环具有黏性末端，能够有效聚合成长达数微米的纤维，并表现出与天然生物聚合物相似的聚合动力学。由于其力学性能可编程，这些纳米管成为研究 l_p 在单分子尺度和体相尺度上影响的多功能新型工具。与肌动蛋白纤维相比，它们可稳定保持数周而不发生明显降解，且操作相对简便。

引言

由于其独特的机械性能所赋予的复杂行为，半柔性聚合物是生命物质的基本组成单元。与柔性聚合物不同，半柔性聚合物因其不可忽略的骨架刚性而倾向于伸展构型，但仍受到强烈的热涨落影响。¹因此，不能将纯粹的随机模型应用于它们的行为研究，就像完全柔韧或刚性聚合物的极端情况一样。所谓的蠕虫状链模型^2,3,4 通过该方法可量化这种刚度 l_p，即沿纤维的切线-切线相关性的衰减常数⁴。如果 l_p 与轮廓长度相当（l_c丝状物的聚合物被视为半柔性聚合物¹类似于帐篷的支撑杆，它们在低体积分数下以网络或束状排列，能够稳定整个集体系统，从而产生异常的黏弹性特性^5,6,7,8,9这些结构在大网孔尺寸下....

方案

1. 制备 n HTs

注意：此处 n 表示参与形成特定尺寸螺旋管的不同单链DNA的数量。当 n=8 时，由八种不同的单链DNA组成一个单元环。

1. 从合适的DNA合成服务提供商处购买DNA序列（HPLC纯度等级或更高），或自行进行高质量的合成与纯化（示例序列见于 表1).
2. 将冻干的寡核苷酸溶于纯化水中，并按照公司提供的相应说明书进行后续重悬步骤。调节加水量，使终浓度为 200 µM。
3. 测定单链DNA的浓度，以验证供应商提供的数值例如， 通过在260 nm处进行紫外-可见光谱分析（UV-Vis spectroscopy）测定浓度，因为精确的化学计量比对于组装过程至关重要。根据每条单链DNA寡核苷酸的特定摩尔质量及其消光系数，计算寡核苷酸的浓度。
   注意：不同序列的消光系数值 inherently 存在差异，具体数值可参见商业购买的 DNA 产品说明文件。也可通过多种免费的在线工具，依据最近邻模型（nearest-neighbor model）进行计算。为符合分光光度计的线性检测范围，建议对用于浓度测定的样品进行稀释。
4. 使用微量移液器将浓度相同的DNA链在适用于PCR仪的容器中混合例如， 一个200 µL的PCR管）以形成所需的 nHTs（最终缓冲....

结果

通过温度梯度组装DNA纳米管（图2）是一种非常可靠的制备此类人工半柔性聚合物的方法。这些聚合物具有与天然存在的类似物（如肌动蛋白丝）相当的特性，但由于其力学性能可被可控调节，因而提供了更广泛的实验研究框架^9,27。与生物大分子类似，它们可被构建成网络结构（图3），并特别适用于研究丝状物刚度对整体结构和性质的影响。如图4所示，这些网络在应变高达10%时表现出线性应变区域，其特性与肌动蛋白丝网络的特性非常相似。在此区域内，可方便地应用线性剪切流变学方法，例如，在不同频率下测定DNA纳米管网络的弹性与黏性响应⁹。这些测试表明，这些网络主要表现为弹性行为（图5）。与蛋白质的测量不同.......

讨论

为了获得结构良好的网络，组装DNA纳米管是一个关键步骤。合成过程中的错误会对纳米管的质量产生负面影响；因此，建议使用高效液相色谱（HPLC）或更严格的纯化方法来纯化寡核苷酸。由于离散而非聚集的DNA纳米管的形成及其长度分布依赖于该组中n种组成寡核苷酸的等摩尔化学计量比，因此有必要重新测定所购入DNA链的浓度，因为供应商提供的数值可能与实际浓度存在显著差异。这可以通过在260 nm波长下进行紫外-可见光谱（UV-Vis）分析来实现。需要指出的是，不同序列的分子量和消光系数各不相同；因此，应针对每种DNA寡核苷酸分别确定将吸光度转换为浓度所用的参数。当使用适用于小样品体积的设备（如NanoDrop）时，每次测量应重复多次并取平均值。操作时应确保在分光光度计的线性检测范围内进行。如有必要，可对用于浓度测定的样品部分进行稀释。微小的浓度偏差可能对正确的化学计量比及纳米管的形成质量产生显著影响；因此，单链的移液操作必须尽可能精确。随后，在将样品放入热循环仪之前，应通过缓慢地反复吹打使最终样品溶液充分混匀。如果DNA链已标记荧光染料用于可视化观察，则所有操作均应在避光环境中进行，并建议后续添加已知的抗漂白剂（即，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFM 悬臂 ACTA	AppNano
AFM - NanoWizard 3	JPK Instruments
CCD 相机	Andor	iXon DV887
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DNA 寡核苷酸	Biomers.net		序列见表1
Cy3 标记的 DNA 寡核苷酸	Biomers.net		序列见表1
EDTA	Sigma-Aldrich	E-9884
落射荧光显微镜	Leica	DM-IRB
MgCl2	Sigma-Aldrich	M-8266
云母 "V1"，直径 12 mm 圆形	Plano GmbH	50-12
MicroAmp® 快速光学 96 孔反应板	Thermo Fisher Scientific Inc.	4346907
MicroAmp® 光学密封膜	Thermo Fisher Scientific Inc.	4306311
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific Inc.
100 倍物镜	Leica5	506168
纯化水	Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR 管	Greiner Bio-One	683271
TProfessional Standard PCR 扩增仪	Core Life Sciences Inc.	070- Standard
7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	4351405
流变仪	TA Instruments	ARES
SYBR® Green I 核酸凝胶染料	Thermo Fisher Scientific Inc.	S7567
Tris	Sigma-Aldrich	T4661
Triton X-100	Sigma-Aldrich Co.	X-100	抑制样品在气-液界面的蒸发