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方法文章

蓝细菌中糖原含量的测定

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DOI：

10.3791/56068

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2017年7月17日

 ,  , 
1Carlsberg Research Laboratory, 2Department of Biology, University of Copenhagen, 3Copenhagen Plant Science Center, Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

本文内容

摘要

本文介绍了一种可靠且简便的检测蓝细菌细胞中糖原含量的实验方法。该方法包括沉淀、可选择的解聚以及葡萄糖残基的检测步骤。本方法适用于野生型和基因工程菌株，有助于蓝细菌的代谢工程研究。

摘要

蓝细菌在光合作用过程中将糖原作为主要的细胞内碳源和能量储存物质 。近年来的研究进展揭示了糖原代谢的复杂机制，包括生物合成与分解代谢的昼夜循环、氧化还原调控以及非编码RNA的参与。与此同时，研究人员正致力于在基因工程改造的蓝细菌中将碳流从糖原重新导向目标产物，以提高产物产量。目前已有多种方法用于测定蓝细菌中的糖原含量，但其准确性和技术复杂性各不相同。本文提供了一种可在标准生命科学实验室中实施的、可靠测定蓝细菌糖原含量的详细实验方案。该方案包括从细胞裂解液中选择性沉淀糖原，并通过酶促反应将糖原解聚为葡萄糖单体，随后利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）偶联酶法检测生成的葡萄糖。该方法已成功应用于两种广泛用于代谢工程研究的模式蓝细菌——Synechocystis sp. PCC 6803 和 Synechococcus sp. PCC 7002。此外，该方法还能有效显示野生型菌株与在调控元件或糖原合成相关基因上存在缺陷的突变株之间糖原含量的差异。

引言

蓝细菌在光合作用过程中固定CO2，并将糖原作为主要的碳水化合物碳储存形式。糖原是一种多糖，由线性α-1,4-连接的葡聚糖链构成，其分支由α-1,6-连接的葡萄糖基连接形成。蓝细菌中糖原的生物合成起始于葡萄糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖变位酶和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的连续作用下转化为ADP-葡萄糖。ADP-葡萄糖中的葡萄糖基团由一种或多种糖原合酶（GlgA）转移至糖原α-1,4-葡聚糖主链的非还原端。随后，分支酶引入α-1,6-连接的葡萄糖基连接，并进一步延伸形成糖原颗粒。在黑暗条件下，糖原通过糖原磷酸化酶、糖原去分支酶、α-葡聚糖转移酶和麦芽寡糖磷酸化酶降解为磷酸化葡萄糖和游离葡萄糖。这些产物进入分解代谢途径，包括氧化戊糖磷酸途径、Embden-Meyerhof-Parnas途径（糖酵解）以及Entner-Doudoroff途径1,2,3,4。

近年来，由于蓝细菌具有利用 sunlight 作为能源来生产化学品和燃料的潜力，其糖原代谢过程受到越来越多的关注。通过改造糖原代谢途径可提高目标产物的产量，因为糖原是这些细菌中最大的可调节碳库。Synechococcus sp. PCC 7002 就是一个例子，该蓝细菌经基因工程改造后可生产甘露醇；阻断其糖原合成途径可使甘露醇产量提高3倍5。另一个例子是利用富含糖原的野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 生产生物乙醇6。在氮饥饿条件下，野生型细胞的糖原含量可高达细胞干重的60%6。

近年来，我们对糖原代谢及其调控机制的理解也不断深入。尽管已知糖原在光照条件下积累，并在黑暗中被分解，但其在昼夜周期中代谢的详细动力学特征直到最近才在集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 中得以揭示7。此外，已鉴定出多个影响糖原积累的基因。一个显著的例子是发现假定的组氨酸激酶 PmgA 与非编码 RNA PmgR1 构成一个调控级联，控制糖原的积累。有趣的是，pmgA 和 pmgR1 缺失突变体中积累的糖原量是集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 野生型菌株的两倍8,9。其他调控元件也被证实影响糖原的积累，包括替代σ因子 E 和转录因子 CyAbrB210,11。

随着人们对糖原调控和代谢的兴趣日益增长，有必要提供一份详细描述糖原含量测定的实验方案。文献中已有多种方法被用于此目的。酸水解后通过高压阴离子交换液相色谱-脉冲安培检测法测定单糖含量，或经酸和苯酚处理后进行分光光度测定，是广泛用于估算糖原含量的方法9,10,12,13。然而，高压阴离子交换液相色谱仪价格昂贵，且无法区分来源于糖原的葡萄糖与来源于其他含葡萄糖的糖缀合物（如蔗糖14、葡萄糖基甘油15和纤维素16,17,18）的葡萄糖，而这些物质已知会在某些蓝细菌物种中积累。酸-苯酚法可使用常规实验室设备完成，但其使用的试剂具有高度毒性，且不能区分来自不同糖缀合物的葡萄糖，也无法将葡萄糖与其他构成细胞物质（如糖脂、脂多糖和胞外基质）的单糖区分开来12。值得注意的是，热酸-苯酚法通常用于测定总碳水化合物含量，而非特异性地测定葡萄糖含量12。通过α-淀粉葡萄糖苷酶将糖原酶解为葡萄糖，再经酶偶联反应检测葡萄糖，可产生比色信号，该方法对来源于糖原的葡萄糖具有高度敏感性和特异性。通过乙醇优先沉淀细胞裂解液中的糖原，可进一步提高该方法的特异性5,8,19。

本文详细描述了一种基于酶法测定两种最常研究的蓝细菌物种——Synechocystis sp. PCC 6803 和 Synechococcus sp. PCC 7002 的野生型及突变株中糖原含量的实验方案。为确保高效的水解反应，采用α-淀粉酶与α-糖苷葡萄糖水解酶的混合酶体系8。内切型α-淀粉酶可水解多种葡聚糖中的α-1,4-糖苷键，生成糊精，随后由外切型α-糖苷葡萄糖水解酶进一步水解为葡萄糖20。这两种酶具有协同作用，已被广泛用于选择性水解淀粉（一种与糖原类似的α-连接葡聚糖），而不会影响植物生物质中的其他糖缀合物（如纤维素）21。释放出的葡萄糖通过酶偶联法进行定量检测：葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸内酯，同时将氧气还原为过氧化氢；过氧化物酶则利用过氧化氢、酚类化合物和4-氨基安替比林生成粉红色的醌亚胺染料22。

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方案

1. 准备

  1. 蓝细菌培养物
    1. 培养 集胞藻属 sp. PCC 6803 在30 °C下于液体BG11培养基中培养8，持续供应含有1%（v/v）CO的空气2持续以50 µmol photon/m²·s的光合光子通量密度光照培养物2/ s.
    2. 培养 集胞藻属 液态A+培养基中的sp. PCC 700223 （也可使用BG11培养基），并持续通入含1%（v/v）CO的空气2温度应保持在 37 °C。以 150 µmol 光子/m²·s 的光合光子通量密度连续光照培养物。2/ s.
    3. 使用光程为1 cm的比色皿，在730 nm处测定培养物的光密度（OD）。若OD值高于0.8，则进行适当稀释，以获得与细胞浓度成比例的OD测量值。
      注意：以下方案适用于液体培养物，细胞密度应达到 OD730 nm 2 或更高时，若需要处于对数生长期的培养物，其通常具有 OD730 nm 低于1时，通过离心并重悬于缓冲液或培养基中来浓缩细胞密度，以达到目标OD值730 nm 2 或更高值。
  2. 缓冲液与试剂
    1. 配制 pH 8 的 50 mM Tris-HCl 缓冲液
    2. 配制 pH 5 的 50 mM 乙酸钠缓冲液
    3. 在50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5）中配制8 U/mL淀粉葡萄糖苷酶的储备液。
    4. 在50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5）中配制2 U/mL的α-淀粉酶储备液。
    5. 使用蒸馏水配制浓度范围为 0 至 100 µg/mL 的葡萄糖标准溶液。
    6. 按照D-葡萄糖检测试剂盒（GODPOD法）的说明书配制GOD-POD试剂。

2. 细胞干重的测定（可选）

  1. 取2 mL培养物或细胞重悬液（见步骤1.1），转移至2.0 mL离心管中，在6,000 × g、4 °C条件下离心5 min，弃去上清液。
  2. 将沉淀用1 mL水重悬，在6,000 × g、4 °C条件下离心5 min，弃去上清液，再将细胞沉淀用0.5 mL水重悬。
  3. 将悬液转移至已预先称重的铝盘中，将铝盘置于105 °C烘箱中过夜干燥（约18 h）。
    关键步骤：操作铝盘时必须使用镊子，以避免手指上的物质污染。在相同条件下对一个空的、已预先称重的铝盘进行干燥，以确定干燥过程中铝盘自身的重量损失。
  4. 干燥后，将铝盘从烘箱中取出，在室温条件下平衡5 min，然后以0.0001 g的精度进行称重。
    注意：该数值可用于将糖原含量归一化为细胞干重基础。

3. 裂解蓝细菌细胞

  1. 将1 mL培养物或细胞重悬液（见步骤1.1）转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、6,000 × g条件下离心10分钟，弃去上清液。
  2. 将沉淀用1 mL 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）重悬，在4 °C、6,000 × g条件下离心10分钟，弃去上清液后，将细胞沉淀重新悬浮于1 mL Tris-HCl缓冲液中，重复该过程一次。
  3. 将沉淀充分重悬于500 µL 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）中。
    关键步骤：为实现高效细胞裂解，必须充分重悬沉淀。操作过程中保持样品置于冰上。
  4. 在4 °C条件下进行超声破碎裂解细胞，共进行30个循环，每个循环包括30秒、20 kHz频率、最大振幅的超声处理，随后间隔90秒不处理。
    注意：该方法可高效裂解 Synechococcus sp. PCC 7002。
    1. 可选方案：将细胞重悬液转移至带螺帽的离心管中，按制造商说明加入氧化锆珠。将管子放入组织匀浆器中，在4 °C条件下进行2个循环的机械破碎，每个循环持续5分钟，频率设定为5。
      注意：该方法可高效裂解 Synechocystis sp. PCC 6803 和 Synechococcus sp. PCC 7002。
  5. 将含有裂解液的离心管在4 °C、6,000 × g条件下离心10分钟。
    注意：沉淀主要为较大的细胞碎片。若存在大量未破裂的细胞，应重复步骤3.4。保留上清液并置于冰上。
  6. 使用商用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
    注意：该数值可用于基于蛋白含量对糖原含量进行归一化处理。

4. 糖原沉淀

  1. 通过在1.5 mL螺旋盖管中混合900 µL 96% (v/v) 乙醇和步骤3.5中获得的100 µL上清液，从细胞裂解液中去除叶绿素a。盖紧管盖后，使用标准实验室加热块在90 °C下加热10分钟。
  2. 将管子置于冰上孵育30分钟。
  3. 在20,000 × g和4 °C条件下离心30分钟，并小心移除上清液；沉淀物中含有糖原。在空气中轻轻干燥沉淀以去除过量乙醇。
    CRITICAL：必须避免沉淀过度干燥，否则在步骤5.1中难以溶解。
  4. OPTIONAL：在664 nm处测定步骤4.3中获得的上清液的吸光度，以确定叶绿素a含量。使用84.6 L/g/cm24的吸收系数。
    NOTE：该值可用于标准化糖原含量。

5. 酶法水解与糖原测定

  1. 将步骤 4.3 中获得的沉淀物溶于 100 µL 的 50 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5）中，加入 50 µL 的 8 U/mL 淀粉葡萄糖苷酶和 50 µL 的 2 U/mL α-淀粉酶。使用涡旋振荡器充分混匀。
    注意：不建议通过移液操作进行混匀，因为糖原沉淀具有黏性。
  2. 将混合物置于 60 °C 的加热块中孵育 2 小时，以使糖原消化为葡萄糖分子。
  3. 在 10,000 x g 离心 5 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。

6. 使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂测定总葡萄糖含量

  1. 使用GOD-POD试剂测定步骤5.3中获得的上清液中的葡萄糖浓度。取步骤5.3中的上清液100 µL加入96孔板的孔中。以100 µL 50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）作为阴性对照。为绘制标准曲线，同时测定葡萄糖标准溶液的吸光度。
  2. 向每个样品中加入150 µL GOD-POD试剂，并用移液器快速混匀。
  3. 将96孔板在25 °C下静置孵育30分钟，使用酶标仪在510 nm波长处记录吸光度值。
  4. 根据葡萄糖标准品绘制的标准曲线计算葡萄糖浓度。
    注意：细胞裂解液中的糖原浓度以葡萄糖浓度（µg/mL）表示。

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结果

在OD730nm值达到约0.8时，取10 mL野生型Synechocystis sp. PCC 6803在光自养条件下培养。收集细胞并重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）中，调节OD730nm值至2-3。按照上述方案分析糖原含量。每单位OD730nm的糖原含量为13 ± 1.8 µg/mL/OD730nm（N = 12）。相对于蛋白质含量的糖原含量为0.24 ± 0.03 µg/µg（N = 12），相对于叶绿素a含量的糖原含量为5.7 ± 0.6 µg/µg（N = 12）。由于可用材料量较少，未测定细胞干重。鉴于在相似条件下培养的蓝细菌中蛋白质含量约占细胞干重的50%25，估计糖原含量约占细胞干重的12%，该结果与先前的研究一致26。

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讨论

实验方案中的关键步骤是糖原沉淀和重悬。乙醇沉淀后离心，糖原会形成半透明的沉淀，松散地附着在微量离心管管壁上。因此，在去除上清液时需格外小心，避免将沉淀一同移除。糖原沉淀具有黏性，若其干燥则难以溶解。需注意，糖原沉淀必须完全溶解，因为溶解不完全将导致酶切效率降低，从而引起技术重复样本之间的显著差异。在涡旋振荡溶解前进行超声处理可能有助于溶解过程。

关于归一化方法的选择，细胞干重是一种广泛使用的参考标准。该方法比测定蛋白质和叶绿素 a 更为耗时，且需要更多的细胞生物量。总蛋白含量可作为细胞生物量的另一种参考指标，并可在小规模样品上进行测定，本实验方案对此进行了描述。每个干重细胞生物量中的总蛋白含量通常在40%至50%之间，尽管其确切数值取决于培养条件25,28。叶绿素 a 含量易于测定，可作为样品中细胞数量的替代指标。然而，众所周知，每个细胞中叶绿素 a 的含量会因培养条件的不同而发生显著变化，特别是受营养物质浓度和...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢北欧能源研究基金会（AquaFEED，项目编号 24）、丹麦创新基金会（Pant Power，项目编号 12-131844）以及维尔勒姆基金会（项目编号 13363）的支持

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QSonica Sonicators Q700Qsonica, LLCNAQSonica
SpectraMax 190 微孔板读板仪 Molecular DevicesNA酶标仪
Bullet Blender StormNext AdvanceBBY24M-CE珠磨破碎仪
Ultrospec 3100 pro 紫外/可见光分光光度计Amersham BiosciencesNA分光光度计
Tris Sigma-AldrichT1503缓冲液
HClMerck1-00317pH 调节剂
乙酸钠Sigma-Aldrich32319缓冲液
淀粉葡萄糖苷酶（Rhizopus sp.）MegazymeE-AMGPU糖原解聚用酶
α-淀粉酶，耐热型（Bacillus licheniformis）Sigma-AldrichA3176糖原解聚用酶
D-葡萄糖Merck8337葡萄糖测定标准品
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 Thermo Fisher Scientific23225用于蛋白质浓度测定
一次性铝制干燥盘VWR611-1362用于细胞干重测定
D-葡萄糖检测试剂盒（GODPOD 法）MegazymeK-GLUC用于葡萄糖浓度测定
氧化锆珠，0.15 mmNext AdvanceZrOB015Bullet Blender Storm 中用于细胞裂解的珠子
RINO 管Next AdvanceNABullet Blender Storm 中用于细胞裂解的管

参考文献

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