蓝细菌中糖原含量的测定

摘要

本文介绍了一种可靠且简便的检测蓝细菌细胞中糖原含量的实验方法。该方法包括沉淀、可选择的解聚以及葡萄糖残基的检测步骤。本方法适用于野生型和基因工程菌株，有助于蓝细菌的代谢工程研究。

摘要

蓝细菌在光合作用过程中将糖原作为主要的细胞内碳源和能量储存物质 。近年来的研究进展揭示了糖原代谢的复杂机制，包括生物合成与分解代谢的昼夜循环、氧化还原调控以及非编码RNA的参与。与此同时，研究人员正致力于在基因工程改造的蓝细菌中将碳流从糖原重新导向目标产物，以提高产物产量。目前已有多种方法用于测定蓝细菌中的糖原含量，但其准确性和技术复杂性各不相同。本文提供了一种可在标准生命科学实验室中实施的、可靠测定蓝细菌糖原含量的详细实验方案。该方案包括从细胞裂解液中选择性沉淀糖原，并通过酶促反应将糖原解聚为葡萄糖单体，随后利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD）偶联酶法检测生成的葡萄糖。该方法已成功应用于两种广泛用于代谢工程研究的模式蓝细菌——Synechocystis sp. PCC 6803 和 Synechococcus sp. PCC 7002。此外，该方法还能有效显示野生型菌株与在调控元件或糖原合成相关基因上存在缺陷的突变株之间糖原含量的差异。

引言

蓝细菌在光合作用过程中固定CO₂，并将糖原作为主要的碳水化合物碳储存形式。糖原是一种多糖，由线性α-1,4-连接的葡聚糖链构成，其分支由α-1,6-连接的葡萄糖基连接形成。蓝细菌中糖原的生物合成起始于葡萄糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖变位酶和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的连续作用下转化为ADP-葡萄糖。ADP-葡萄糖中的葡萄糖基团由一种或多种糖原合酶（GlgA）转移至糖原α-1,4-葡聚糖主链的非还原端。随后，分支酶引入α-1,6-连接的葡萄糖基连接，并进一步延伸形成糖原颗粒。在黑暗条件下，糖原通过糖原磷酸化酶、糖原去分支酶、α-葡聚糖转移酶和麦芽寡糖磷酸化酶降解为磷酸化葡萄糖和游离葡萄糖。这些产物进入分解代谢途径，包括氧化戊糖磷酸途径、Embden-Meyerhof-Parnas途径（糖酵解）以及Entner-Doudoroff途径^1,2,3,4。

近年来，由于蓝细菌具有利用 sunlight 作为能源来生产化学品和燃料的潜力，其糖原代谢过程受到越来越多的关注。通过改造糖原代谢途径可提高目标产物的产量，因为糖原是这些细菌中最大的可调节碳库。Synechococcus sp. PCC 7002....

方案

1. 准备

1. 蓝细菌培养物
   1. 培养 集胞藻属 sp. PCC 6803 在30 °C下于液体BG11培养基中培养⁸，持续供应含有1%（v/v）CO的空气₂持续以50 µmol photon/m²·s的光合光子通量密度光照培养物²/ s.
   2. 培养 集胞藻属 液态A+培养基中的sp. PCC 7002²³ （也可使用BG11培养基），并持续通入含1%（v/v）CO的空气₂温度应保持在 37 °C。以 150 µmol 光子/m²·s 的光合光子通量密度连续光照培养物。²/ s.
   3. 使用光程为1 cm的比色皿，在730 nm处测定培养物的光密度（OD）。若OD值高于0.8，则进行适当稀释，以获得与细胞浓度成比例的OD测量值。
      注意：以下方案适用于液体培养物，细胞密度应达到 OD_{730 nm} 2 或更高时，若需要处于对数生长期的培养物，其通常具有 OD_{730 nm} 低于1时，通过离心并重悬于缓冲液或培养基中来浓缩细胞密度，以达到目标OD值_{730 nm} 2 或更高值。

结果

将10 mL野生型Synechocystis sp. PCC 6803在光自养条件下培养至OD_730nm值达到约0.8。收集细胞并重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）中，调节OD_730nm值至2-3。按照上述方案分析糖原含量。每单位OD_730nm的糖原含量为13 ± 1.8 µg/mL/OD_730nm（N = 12）。相对于蛋白质含量的糖原含量为0.24 ± 0.03 µg/µg（N = 12），相对于叶绿素a含量的糖原含量为5.7 ± 0.6 µg/µg（N = 12）。由于可用材料量较少，未测定细胞干重。鉴于在相似条件下培养的蓝细菌中蛋白质含量约占细胞干重的50%²⁵，估算糖原含量约占细胞干重的12%，该结果与先前研究一致²⁶。

讨论

实验方案中的关键步骤是糖原沉淀和重悬。乙醇沉淀后离心，糖原会形成半透明的沉淀，松散地附着在微量离心管管壁上。因此，在去除上清液时需格外小心，避免将沉淀一同移除。糖原沉淀具有黏性，若其干燥则难以溶解。需注意，糖原沉淀必须完全溶解，因为溶解不完全将导致酶切效率降低，从而引起技术重复样本之间的显著差异。在涡旋振荡溶解前进行超声处理可能有助于溶解过程。

关于归一化方法的选择，细胞干重是一种广泛使用的参考标准。该方法比测定蛋白质和叶绿素 a 更为耗时，且需要更多的细胞生物量。总蛋白含量可作为细胞生物量的另一种参考指标，并可在小规模样品上进行测定，本实验方案对此进行了描述。每个干重细胞生物量中的总蛋白含量通常在40%至50%之间，尽管其确切数值取决于培养条件^25,28。叶绿素 a 含量易于测定，可作为样品中细胞数量的替代指标。然而，众所周知，每个细胞中叶绿素 a 的含量会因培养条件的不同而发生显著变化，特别是受营养物质浓度和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 微孔板读板仪	Molecular Devices	NA	酶标仪
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	珠磨破碎仪
Ultrospec 3100 pro 紫外/可见光分光光度计	Amersham Biosciences	NA	分光光度计
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	缓冲液
HCl	Merck	1-00317	pH 调节剂
乙酸钠	Sigma-Aldrich	32319	缓冲液
淀粉葡萄糖苷酶（Rhizopus sp.）	Megazyme	E-AMGPU	糖原解聚用酶
α-淀粉酶，耐热型（Bacillus licheniformis）	Sigma-Aldrich	A3176	糖原解聚用酶
D-葡萄糖	Merck	8337	葡萄糖测定标准品
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225	用于蛋白质浓度测定
一次性铝制干燥盘	VWR	611-1362	用于细胞干重测定
D-葡萄糖检测试剂盒（GODPOD 法）	Megazyme	K-GLUC	用于葡萄糖浓度测定
氧化锆珠，0.15 mm	Next Advance	ZrOB015	Bullet Blender Storm 中用于细胞裂解的珠子
RINO 管	Next Advance	NA	Bullet Blender Storm 中用于细胞裂解的管