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高分辨率表层显微成像技术（HREM）——用于有机材料处理与可视化的简易且稳健的实验方案

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DOI：

10.3791/56071

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2017年7月7日

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1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

我们提供了简单且可靠的方案，用于处理多种物种的活检材料、生物医学模式生物的胚胎以及其他有机组织样本，以通过高分辨率显式光学切片显微技术生成数字体积数据。

摘要

我们提供了利用高分辨率表层显微成像技术（HREM）生成数字体数据的简单方案。HREM 能够对体积通常达 5 × 5 × 7 mm3 的有机材料进行成像，典型数值分辨率为 1 × 1 × 1 至 5 × 5 × 5 µm3。样品被包埋于甲基丙烯酸甲酯树脂中，并在切片机上进行连续切片。每次切片后，通过连接在复合显微镜头部光管上的数码摄像机拍摄一次样品块表面的图像。光轴穿过一个绿色荧光蛋白（GFP）滤光立方体，并对准切片后样品块夹持臂静止的位置。通过这种方式，可生成一系列天然对齐的数字图像，依次显示连续的样品块表面。将该图像序列载入三维（3D）可视化软件后，可立即转换为数字体数据，从而实现对多种正交和斜向平面的虚拟切片，并可构建体绘制和表面绘制的计算机模型。本文介绍了三种简单且针对特定组织的处理方案，适用于多种有机样品，包括小鼠、鸡、鹌鹑、蛙类和斑马鱼胚胎、人类活检组织、未涂层纸张以及皮肤替代材料。

引言

有机和无机材料的结构分析是理解其物理性质和功能的第一步。此类分析的基础通常是通过仔细观察组织学切片获得的二维（2D）信息，结合多种简单和复杂的成像方法，提取组织结构、细胞形态与拓扑结构、分子组成以及生物力学特性的细节1,2,3。然而，二维信息并不适用于研究空间上复杂的结构排列。因此，在过去几十年中，越来越多的活体（in vivo）和离体（ex vivo）方法被建立起来，以生成数字三维体积数据4，并且还有更多方法正在开发中。

大多数体数据生成方法的系统性原理是生成虚拟的数字图像堆栈，这些图像显示通过对象的虚拟或物理切片所获得的截面。如果对齐得当，这些截面图像将构成一个三维体数据，可用于在虚拟切面中重新切片，或用于创建三维表面和体积渲染模型。用于可视化人体和较大生物标本的常用技术包括磁共振断层扫描（MRT）、计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描（SPECT）。小型标本通常通过微磁共振成像（µMRI）、光学投影断层扫描（OPT）、光学相干断层扫描（OCT）、光声断层扫描（PAT）、基于组织学切片的方法、共聚焦显微镜以及电子断层扫描5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17进行可视化。

一种相对较新的体数据生成技术——HREM方法，可产生小型标本和组织学组织样本的数字数据，该方法是在与Tim Mohun密切合作下开发的18,19。该技术基于普通显微镜，通过对树脂包埋材料在切片机上进行连续切片，从而生成数字体数据。这些数据可在中等光学显微水平上，实现对组织结构和细胞分布的详细分析，以及对微小结构的定量测量分析。

高分辨率显微成像技术（HREM）可生成一系列天然对齐的数字图像堆栈，其外观如同来自经伊红染色的组织学切片。就视野范围内的组织对比度和数据分辨率而言，HREM优于µCT、µMRI和OPT所产生的数据，但低于共聚焦显微镜、光片显微镜和电子显微镜所能达到的水平20。然而，与后几种技术相比，HREM能够在组织学质量下对相对较大的样本进行成像，样本体积最大可达5 × 5 × 7 mm3。近年来已有许多研究对各种单一成像技术的优缺点进行了详细表征和比较，为保持客观性，我们建议参考这些文献以获取有关其局限性及潜在应用领域的进一步信息4,21,22,23,24。

本研究聚焦于高分辨率电子显微成像（HREM）技术，旨在为获取多种有机材料的HREM数据提供极为简化的实验方案，并展示其应用实例。生成HREM数据的工作流程十分简便，适用于所有可包埋于甲基丙烯酸树脂中的材料（图1）。然而，在样品制备过程中存在因组织类型而异的差异，需予以考虑。因此，我们提供了三种标准方案用于制备不同类型的样品，其包埋与数据生成步骤完全相同。

方案

所有操作均按照维也纳医科大学的伦理准则进行。

1. 样品制备

  1. 准备胚胎及胚胎组织（最大尺寸为 5 × 5 × 5 mm3）
    1. 将胚胎或胚胎部分组织置于 4% 多聚甲醛/PBS 或 Bouin 固定液中，在 4 °C 条件下以恒定振荡固定至少 16–24 小时。
      注意：可使用多种物种及不同发育阶段的胚胎，例如 48 小时斑马鱼胚胎、19 小时鸡和鹌鹑胚胎，以及本实验所用的胎鼠胚胎（参见代表性结果）。标本采集后，先转移至室温 PBS 中进行发育阶段鉴定，再放入固定液。如有必要，可在固定前使用显微剪刀或手术刀修剪标本，以适配包埋模具。
    2. 去除固定液，将胚胎组织在 PBS 中于 4 °C 条件下持续振荡清洗 24 小时（更换溶液 2–3 次）。
    3. 将样品依次在 70%、80%、90%、96% 乙醇中于 4 °C 脱水，每步 2–3 小时。将装有样品的管子置于旋转仪上。
      注意：对于小样品（< 2 × 2 × 2 mm3），每步乙醇处理时间可缩短至 60 分钟；对于大样品（> 5 × 5 × 5 mm3），可延长至 4 小时。
    4. 在通风橱内佩戴防护手套进行以下渗透步骤。
      1. 通过向 100 mL 溶液 A 中加入 1.25 g 过氧化苯甲酰（增塑催化剂）和 0.4 g 伊红配制渗透液（更多细节参见材料表）。将混合物置于烧杯中，在磁力搅拌器上于 4 °C 搅拌，直至伊红和催化剂完全溶解（2–3 小时）。
      2. 将样品置于渗透液中 12–24 小时，保持 4 °C 并持续振荡或旋转。分别在 3 小时和 12 小时后更换为新鲜渗透液。
        注意：对于大胚胎（> 1 cm 顶臀长），渗透时间应延长至 48 小时。
  2. 准备成年组织样本（最大尺寸为 5 × 5 × 7 mm3）
    1. 将组织在含 4% 苯酚的 2% 多聚甲醛/PBS 中于 4 °C 固定至少 3 天。
      注意：来自新生儿及成年个体的皮肤、肝脏、胰腺、肾脏、甲状腺、心脏、横纹肌、脑、神经以及多种肿瘤模型的组织样本（包括人、啮齿类动物、猪、果蝇和斑马鱼）均可使用该溶液固定，随后进行 HREM 成像（本实验展示了样本的固定过程；参见代表性结果）。使用手术刀、剪刀或活检打孔器切除组织样本，并立即转移至固定液中。神经组织固定应使用 4% 多聚甲醛/PBS。
    2. 去除固定液，在流动自来水下冲洗组织 3–6 小时。
    3. 将样品依次置于含 0.4 g 伊红/100 mL 的 70%、80%、90%、96% 乙醇中进行脱水（每步 2–3 小时）。将含样品的溶液置于 4 °C 条件下持续振荡或旋转。
      注意：对于小样品（< 2 × 2 × 2 mm3），每步乙醇处理时间可缩短至 60 分钟；对于大样品（> 5 × 5 × 5 mm3），可延长至 4–8 小时。
    4. 在通风橱内佩戴防护手套进行以下所有渗透步骤。
      1. 通过向 100 mL 溶液 A 中加入 1.25 g 过氧化苯甲酰（增塑催化剂）和 0.4 g 伊红配制渗透液（更多细节参见材料表）。将混合物置于烧杯中，在磁力搅拌器上于 4 °C 搅拌，直至伊红和催化剂完全溶解（2–3 小时）。
      2. 将样品置于渗透液中 24–36 小时，保持 4 °C 并持续振荡或旋转。分别在 3 小时和 12 小时后更换为新鲜渗透液。
        注意：对于大样品（> 5 × 5 × 5 mm3），渗透时间应延长至 48 小时。
  3. 准备其他有机材料
    注意：使用普通剪刀将皮肤替代物和纸张修剪至所需尺寸。无需固定。
    1. 跳过固定、清洗和脱水步骤。
    2. 在通风橱内佩戴防护手套进行以下所有渗透步骤。
      1. 通过向 100 mL 溶液 A 中加入 1.25 g 过氧化苯甲酰（增塑催化剂）和 0.4 g 伊红配制渗透液（更多细节参见材料表）。将混合物置于烧杯中，在磁力搅拌器上于 4 °C 搅拌，直至伊红和催化剂完全溶解（2–3 小时）。
      2. 将样品置于渗透液中 3–12 小时，保持 4 °C 并持续振荡或旋转。分别在 1 小时以及 2–4 小时后更换为新鲜渗透液。

2. 包埋

注意：所有步骤均需在通风橱内进行，并佩戴防护手套。

  1. 按上述方法（步骤 1.1.4.1）配制新鲜的浸润溶液。向 100 mL 浸润溶液中加入 4 mL 溶液 B（详见材料表），以制备包埋液。
    注意：若需精确控制样品在包埋模具中的方向，或需同时包埋多个样品，可将烧杯置于冰浴中以减缓母液的聚合速度。
  2. 使用包埋杯托盘（详见材料表），其模具常规体积为 6 x 8 x 5 mm3 或 13 x 19 x 5 mm3，也可使用最大体积达 8 x 10 x 15 mm3 的定制模具（图 2）。
  3. 将包埋液注入模具中，并用勺子将样品转移至模具内。转移过程中应确保样品完全被包埋液覆盖，以避免气泡残留。
    注意：若在从冰箱取出样品和包埋液后立即开始操作，可在室温下进行。
    1. 使用细针或镊子在模具内调整样品的方向。
    2. 一旦包埋液开始变黏稠，立即将样品块托（见材料表）置于模具上方，并通过托块中央的孔继续加入包埋液，直至托块底部被 1 - 2 mm 厚的包埋液覆盖。
    3. 通过覆盖液体石蜡密封包埋杯托盘，等待其凝固。或者，将另一个包埋杯托盘倒扣在装有样品的托盘上，并用胶带密封，以达到防气密封效果。
  4. 将密封好的包埋杯托盘在室温下存放 1 - 2 天，使样品块完成聚合。
  5. 进行后聚合处理时，将含有已聚合样品块的包埋杯托盘放入标准实验室烘箱中，在 70 - 80 °C 下烘烤至少 1 - 2 天，直至样品块变为深红色。烘烤结束后从烘箱中取出托盘，并将样品块从模具中取出。
    注意：烘烤可在常规环境条件下进行。用于包埋后初期防气密封的上层包埋杯托盘可在此阶段移除，以便在烘烤约 10 小时后检查树脂颜色。刚烘烤完毕时树脂较软，样品块可轻松取出；2 - 3 小时后树脂变硬，样品块可在室温下长期保存数月。

3. 数据生成

注意：此处使用的HREM原型机18,25包含以下组件：（i）旋转式切片机，配备一个切片后可停在其上行转折点的样品块夹持器；（ii）标准非一次性切片刀，硬质金属材质，D型刀刃（具体信息见材料表）；（iii）荧光复合显微镜的镜体，带有物镜转盘，光路中安装有GFP滤光立方体（激发光滤片470/40，发射光滤片525/50）。光轴垂直于安装在切片机上的样品块的新鲜切面，并由一个可上下移动的装置固定；（iv）带有电动十字移动平台的切片机，该平台可在光轴方向及侧向移动；（v）连接在荧光复合显微镜上的数字视频相机；（vi）单色光源（470 nm）；（vii）与相机连接的计算机，配备数据采集软件（具体信息见材料表）。

  1. 实验步骤
    1. 标定感兴趣区域。
      1. 使用标准实验室光源（参见材料表），将白光以倾斜角度照射到包埋块表面。
      2. 识别包埋材料在包埋块表面的投影轮廓，并使用记号笔或刀片在包埋块表面标出感兴趣区域及后续的视野范围。
        注意：此步骤为切片前定义视野范围所必需。
    2. 定义视野范围。
      1. 将含有样品的树脂包埋块安装至切片机上。
      2. 移动样品夹至其停止位置（样品夹行程的上转折点）。
      3. 启动数码相机及数据采集软件，获取实时图像。
      4. 选择适当的物镜，其放大倍数应能覆盖包埋块表面所标示的感兴趣区域。
        注意：通常使用的物镜放大倍数为2.5X、5X、10X、20X，数值孔径介于0.07至0.40之间。
      5. 通过电动十字移动台调节光学系统上下移动以及切片机横向移动，直至包埋块上的感兴趣区域与计算机屏幕上显示的视野范围对齐。
    3. 聚焦。
      1. 逐步进行手动切片，直至样品的初步结构可见。
      2. 沿光轴方向移动切片机，使包埋块表面位于物镜的焦平面上。
      3. 设定切片厚度；推荐切片厚度为0.5至5 µm。
  2. 数据采集与处理
    1. 启动协调切片与图像采集的软件程序，并遵循图像采集软件所提供的操作说明。
    2. 当样品完全切片后，立即停止软件程序，并将标定尺片置于包埋块表面前方。
    3. 交互式采集一张图像，用于后续校准。
      注意：每次在新配置的系统中使用物镜时，均需执行此步骤。
    4. 将图像序列转换为8位灰度图像，保存为.jpg格式。
    5. 将图像序列载入三维可视化软件，并调整对比度。
      注意：图像转换与三维可视化可使用多种商业或免费的标准软件包完成，具体操作请遵循相应软件的说明文档。

结果

HREM 可生成一系列天然对齐的数字图像，其对比度与苏木精/伊红染色组织学切片的图像相似。与二维切片图像不同，HREM 图像堆栈可实现对多种有机材料的组织结构、形态学及拓扑结构进行三维可视化与分析。高对比度通常有助于快速简便地进行容积渲染计算机模型的三维可视化，以及半自动轮廓识别以生成表面渲染模型。

HREM 数据的大小取决于相机靶面尺寸、图像采集模式（8、12、16 位，灰度，彩色）以及单个块面图像的数量。由 1,000 张 8 位灰度 jpg 图像（2,048 像素 × 2,048 像素）组成的小型数据集大小约为 900 MB。由 3,000 张 8 位灰度 jpg 图像（4,096 像素 × 4,096 像素）组成的大数据集体积约为 20 GB。

所提供的方案简单且可靠，在过去十年中已被用于生成多种不同样本的高分辨率电镜（HREM）数据。第1.1节的方案针对长度不超过1 cm的生物医学模式生物整体胚胎，以及尺寸不超过5 × 5 × 5 mm的胚胎组织样本的处理进行了优化。3；我们采用该方法获取了以下物种胚胎的高分辨率表型成像数据：小鼠（小家鼠，鸡（Gallus gallus），斑马鱼（斑马鱼），鹌鹑（Coturnix coturnix，非洲爪蟾（Xenopus laevis），马（Equus ferus caballus），马利筋虫（Oncopeltus fasciatus）、鳄鱼（鳄目)，以及章鱼（octopus）Octopus vulgaris）。所有物种的数据质量均 excellent（优异）例如, 图3)

第1.2节实验方案已优化，适用于处理尺寸最大为5 x 5 x 7 mm的幼年和成年组织样本3 并用于可视化来自人类的皮肤、肝脏、胰腺、肾脏、甲状腺、心脏、骨骼肌、脑、神经及肿瘤模型的组织样本Homo sapiens），小鼠（Mus musculus），大鼠（Rattus norvegicus），猪（Sus scrofa domestica雪貂Mustela furo），果蝇（黑腹果蝇），以及斑马鱼（Danio rerio）。尽管大多数样本的结果非常理想（例如, 图4, 动画 1），皮肤（含表皮）和脑组织标本中大于 3 x 3 x 3 mm 的最中心部分3 常因伊红无法充分渗透这些组织而未着色。

第1.3节的实验方案经过优化，适用于处理纤维状有机材料，并已用于可视化分析涂布纸、未涂布纸、天然真皮替代材料以及接种干细胞的真皮替代材料的纤维结构。这些样品处理起来简便快捷。未涂布纸及大多数皮肤替代物的数据质量良好（图5，动画2）。但在处理涂布纸时出现了问题，由于无机材料阻碍了伊红的渗透。另一个问题出现在以琼脂为基础的皮肤替代物处理过程中，因为浸润溶液会部分消化这些样品。

细胞样品制备示意图：固定、脱水、渗透、包埋、高分辨率表型成像数据生成过程。
图1：实验流程。 红框中所示步骤需根据样品特性进行相应调整。绿框中的步骤在所有样品中均相似。请点击此处查看该图的放大版本。

用于浇铸工艺的硅胶模具装置，具有圆形和穹顶形型腔，材料制备。
图 2：定制模具。 可通过在原始模具中切割出一个孔，插入巴斯德移液管的吸头，并用塑形材料密封来改造模具。 请点击此处查看此图的放大版本。

胚胎发育阶段、光学显微镜图像、切面视图、解剖结构研究。
图3：典型可视化胚胎示例。 (A, B) 在胚胎第9.5天（E=9.5）获取的小鼠胚胎。(A) 显示为高分辨率表型成像（HREM）切片图像。(B) 显示表面的体积渲染三维模型。(C) 通过E15.5小鼠胚胎颈部体积渲染模型的虚拟矢状切面。(D) 发育至Hamburger-Hamilton（HH）18期的鸡胚胎。心血管系统管腔的表面模型与所有胚胎组织的体积渲染相结合。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学评估；电子显微镜图像；细胞结构；组织分析；研究。
图 4：成体组织样本的代表性可视化。(A) 穿过人神经的HREM切片图像的一部分。插图显示了该图像更详细的区域。(B) 穿过猪肝脏的HREM切片图像的一部分。注意细胞核。(C) 人淋巴组织的HREM切片图像的一部分。(D, E) 人拇指指腹的厚皮肤。整个活检样本的体渲染三维模型。(D) 基于HREM数据虚拟切片前方的动脉、静脉和神经的表面渲染模型(E)。(F) 成年小鼠组织中的实验性肿瘤。位于通过HREM数据获得的三个虚拟切片前方的体渲染三维模型。注意坏死区域（箭头）。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

天然纤维的显微分析；包括纤维素结构和表面纹理研究。
图 5：纤维材料的典型可视化结果。 (A, B) 未涂层棕色纸张的高分辨率电子显微镜切片图像。(B) 为 (A) 的局部放大区域。注意观察纤维及其管腔结构。(C) 涂层纸张的高分辨率电子显微镜切片图像。注意纤维未被染色。(D) 天然真皮替代材料的体渲染模型。注意纤维的不同直径和形态。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

显示水母内部解剖结构的CT扫描图像，以三维可视化形式用于生物学研究。
动画 1：人类拇指指腹厚皮肤的体绘制模型。 组织块大小约为 4.2 x 2.7 x 2.7 mm3。体素尺寸为 1.07 x 1.07 x 2 µm3。请点击此处观看视频。（右键可下载。）

用于神经科学研究的脑组织中神经网络结构的三维渲染显微图像。
动画 2：天然真皮替代材料的体渲染模型。样品尺寸约为 1.2 x 0.85 x 0.4 mm3。体素尺寸为 0.54 x 0.54 x 2 µm3。请点击此处观看视频。（右键单击可下载。）

讨论

高分辨率电镜成像（HREM）是一种高度稳健的显微技术，非常适合用于可视化生物医学和工业中广泛使用的各类有机材料18,21,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40。该技术既可作为独立的成像方式使用，例如目前发育障碍机制（DMDD）项目所采用的方式41,42,43,44，也可作为多模态成像流程中的整合组成部分45。

一个功能完整的HREM数据生成装置可由常规实验室组件组装而成，包括一台电动切片机、显微镜、电动十字载物台，以及配备适当软件的计算机25。关键是要使用配备有块状样品夹持器的切片机，该夹持器可在每次切片后重复地停在预定位置，同时在光路中配备GFP滤光镜组。然而，也可从Indigo Scientific等公司购买功能完整的一体化解决方案。

高分辨率显微成像技术（HREM）与其他所有组织学技术一样存在类似的局限性，只是在切片和贴片过程中不会引入人为假象。然而，该技术仍存在一些局限性，这些局限性源于切片前对样本的染色需求以及包埋材料本身的特性。为了获得足够的组织对比度，需要伊红能够完全渗透整个样本；而致密的组织、脂肪组织以及无机物质会显著阻碍伊红的渗透，导致样本中心区域的组织无法着色。使用特殊固定剂有助于皮肤样本的染色，但目前仍缺乏能够彻底解决该问题的有效方法。另一个局限是，尺寸超过2 cm的树脂包埋块在切片过程中容易发生断裂。这一问题可通过将样本切割成若干部分并分别处理在一定程度上加以避免。

在包埋过程中，小样本或表面不规则样本在模具中的准确定位常常存在问题。通过琼脂糖覆盖样本，并按照本方案所述方法处理琼脂糖块，通常可解决此问题19。另一种替代方法是在切片过程中出现块状物破裂时尤为有效，即从持样器中取出已固化的块状物，然后按照所述包埋程序重新进行包埋。

一个典型的HREM数据集包含500到3,000张单幅图像。其数值分辨率由连续图像之间的间距决定。即，通过切片厚度）、相机靶面的特性以及所用光学系统的性质。我们使用的切片厚度范围为1 µm至5 µm，并获得了良好的结果，尽管所展示的方案并不能完全消除来自伪影的发光现象20,46这些伪影是由位于组织块深部的 intensely stained 组织引起的，导致组织块表面的组织信息出现模糊。

相机的目标尺寸分别为 2,560 x 1,920 像素2、2,048 x 2,048 像素2 和 4,096 x 4,096 像素2，并结合使用了 1.25X、2.5X、5X、10X 和 20X 的物镜。由此得到的像素尺寸范围为 0.18 x 0.18 µm2 至 5.92 x 5.92 µm2，该分辨率足以进行组织结构和细胞形态的三维分析，甚至可用于观察细胞核。鉴于较高的数值分辨率，其他细胞器也应可见。然而，由于仅使用了简单的伊红染色，且物镜的光学特性限制，显著降低了分辨不同结构的可能性。HREM 数据的最大真实空间分辨率为约 1 x 1 x 1 µm3（已考虑数值孔径），因此仅能有效区分大于约 3 x 3 x 3 µm3 的结构。

所有数字成像技术普遍存在的问题是视场大小与图像数字分辨率之间的权衡关系，其中视场大小决定了能够在相机靶面上显示的样本区域。视场越大，可能达到的最大数字分辨率就越低46。本研究中使用的高分辨率电镜（HREM）装置能够生成视场范围在0.74 × 0.74 mm2（20X物镜）至12.12 × 12.12 mm2（1.25X物镜）之间的HREM数据，对应的数字分辨率分别为0.18 × 0.18 µm2和2.96 × 2.96 µm2。其他已商业化的替代装置可提供更大的视场，但会牺牲真实分辨率。尽管如此，这些装置仍能获得优异的结果，这一点从DMDD项目主页上展示的数据中可以明显看出47。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Tim Mohun 在开发 HREM 方面做出的宝贵贡献，以及 Petra Heffeter 提供的样品。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
JB-4 Plus 包埋试剂盒Polysciences Europe GmbH18570-1包含过氧化苯甲酰（催化剂）及溶液 A+B
聚乙烯模具杯托盘，6 × 8 × 5 mm 六边形（9 孔）Polysciences Europe GmbH17177A-3
聚乙烯模具杯托盘，13 × 19 × 5 mm（9 孔）Polysciences Europe GmbH17177C-3
JB-4 塑料块夹持器Polysciences Europe GmbH15899-50
伊红Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma1A-196
Microtec CUT 4060E旋转式切片机
Leica DM LM 荧光复合显微镜Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP 滤光片组Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H11090937180000
电动十字移动台Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KGKT5-LSMA
SPOT-FLEX 数字摄像机Visitron Systems GmbH.
precisExcite 高功率 LEDVisitron Systems GmbH.光源
VisiView 2.1.4Visitron Systems GmbH.图像采集软件
硬质合金刀片（碳化钨），剖面 D 型Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCDSchott AG光源

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高分辨率表层显微成像技术（HREM）——用于有机材料处理与可视化的简易且稳健的实验方案
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