将雪旺细胞移植至聚偏氟乙烯-三氟乙烯导管内以桥接大鼠横断脊髓残端促进轴突再生跨越缺损

摘要

本文介绍了一种技术：在脊髓完全横断后，将一个中空导管插入脊髓残端之间，并填充施万细胞（SCs）和可注射的基底膜基质，以桥接断端并促进轴突跨越缺损区域再生。

摘要

在大鼠脊髓损伤的多种模型中，挫伤模型最为常用，因为它是人类脊髓损伤中最常见的类型。尽管完全横断模型在临床相关性上不如挫伤模型，但它却是评估轴突再生最严格的方法。在挫伤模型中，由于损伤后仍有部分组织残留，难以区分再生的轴突与出芽或幸存的轴突。而在完全横断模型中，必须采用桥接方法填充缺损，以建立从头端到尾端残端之间的连续性，从而评估治疗效果。可靠的桥接手术对于减少手术方法带来的变异性、准确测试结局指标至关重要。本文所述方案用于在移植前准备施万细胞（SCs）和导管，实施胸段第8节（T8）脊髓完全横断，插入导管，并将施万细胞移植入导管内。该方法还使用了 原位 可注射基底膜基质与干细胞移植相结合的凝胶化方法，可促进轴突在宿主组织头端和尾端界面处的生长。

引言

脊髓损伤修复是一个复杂且具有挑战性的问题，需要采用联合治疗策略，例如结合使用细胞与生物材料，以在损伤部位为移植细胞的功能发挥和轴突再生提供有利的微环境。半横断^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}和完全横断^{10,11,12,13,14,15,16,}

方案

雌性成年Fischer大鼠（体重180 - 200 g）的饲养遵循美国国立卫生研究院（NIH）和美国农业部（USDA）的指南。所有动物实验程序均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 移植前准备

1. 导管制备。
   1. 在解剖显微镜下，使用#10刀片将导管切割为5 mm长度。
      注意：导管内径为2.4–2.7 mm；外径为2.5–2.8 mm。
   2. 沿纵向轻轻折叠导管（图1A）。使用直刃Vannas剪刀，在距导管开口至少1 mm处，沿同一侧剪出四个长约0.4 mm、间距约1 mm的小切口（图1B）。
      1. 将导管展开（图1C），然后在同一侧的两个切口之间进行切割，形成两个并列的窗口（图1D）。确保窗口能沿未切割的一侧正常开合。
   3. 将导管置于10 cm培养皿中，用75%乙醇消毒25分钟。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗导管一次，每次4分钟，并用无菌镊子将导管转移至新的10 cm培养皿中。再用1×PBS冲洗导管两次，每次25分钟。

结果

采用该手术技术的目的是评估一种结构化导管与可注射基质在移植至完全横断的脊髓后，对施万细胞（SC）功能最大化的应用效果。移植后三周，用4%多聚甲醛灌注动物，大体解剖脊柱并用相同固定液再固定24小时。随后解剖出脊髓，将用于冰冻切片的样本置于30%蔗糖溶液中进行冷冻保护。另一组解剖脊髓中，从SC桥中间部位分离出1毫米厚的横截面，放入戊二醛固定液中以制备树脂切片。样品按照Bates et al.⁴⁷详细描述的方案进行透射电镜制样。冰冻切片经以下一抗孵育：GFP、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经丝重链（RT97）和神经丝中链（NF），随后使用相应的二抗：羊抗鸡IgG-488、羊抗兔IgG-546、羊抗小鼠IgG-647和羊抗兔IgG-647。GFP标记的施万细胞（GFP-SCs）沿导管内部均匀分布（图3A；导管内壁以黄线标示）。观察到轴突再生现象（图3B），且再生轴突与GFP-SCs的存在密切相关.......

讨论

建立有效横断模型最关键的步骤是通过一到两次切割完全切断脊髓。在横断部位，头端与尾端脊髓残端之间应形成2-2.5 mm的间隙。若该间隙未出现，最可能的三个原因是：（1）背侧或腹侧神经根未被充分切除，（2）腹侧硬脊膜未被充分去除，和/或（3）动物在下方所垫卷轴上的体位未摆放正确。

为了在残端之间有效插入导管：（1）导管的直径应根据实验所用动物的物种和年龄进行适当选择；（2）必须充分向外侧去除椎板，直至能够观察到横突之间的间隙；（3）必须清除神经根；（4）导管插入残端之间应一次完成。若需多次尝试，可能导致残端水肿，进一步增加导管插入的难度，并造成额外损伤。

为了将GFP-SC/DMEM/F12/可注射基质有效引入导管中，请确保：（1）在将导管插入残端之间前，脊髓无出血。若导管插入残端之间后内部有液体，应使用一小块吸水尖头材料通过预切开的窗口将其吸除。（2）确保导管已良好套接在两端脊髓残端上，且（3）背侧预切开的窗口处于开放状态。注射20 µl的SC/可注射基质混合物应足以完全填充导管。预切开窗口处出现溢出是判断移植是否有效的良好指标.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冻存管	ThermoFisher Scientific	5000-0020
10 cm 培养皿	VWR	25382-428
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基：F-12 营养混合物）	ThermoFisher Scientific	11039-021	"DMEM/F12" 在方案中。
青霉素-链霉素	ThermoFisher Scientific	15140-122	"Pen/Strep" 在方案中。
胎牛血清	Hyclone	SH300-70-03	"FBS" 在方案中。
垂体提取物	Biomedical Technologies	BT-215
佛司可林	Sigma-Aldrich	F6886
Heregulin	R&D Systems	396-HB/CF
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P2636	"PLL" 在方案中。
Dulbecco 改良 Eagle 培养基	ThermoFisher Scientific	11965-092	"DMEM" 在方案中。
Hank's 平衡盐溶液	ThermoFisher Scientific	14170-112	"HBSS" 在方案中。
胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher Scientific	15400-054
雌性 Fischer 大鼠（160–180 g）	Envigo
直头 Vannas 剪刀	FST	15018-10
氯胺酮	Vedco Inc	5098976106	100 mg/ml
赛拉嗪	Lloyd Inc	AnaSed	20 mg/ml
庆大霉素	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-010-02	可选用任意品牌。
微型刮铲	FST	10089-11	可选用任意品牌。
钝头弯剪	FST	14017-18	可选用任意品牌。
钝头镊子	FST	11006-12	可选用任意品牌。
咬骨钳	FST	16121-14	可选用任意品牌。
弯头弹簧剪	FST	15006-09	可选用任意品牌。
吸水棉片	FST	18105-03	可选用任意品牌。
Gelfoam	Henry Schein	9083300	"压缩泡沫" 在方案中。
#10 刀片	Sklar	06-3010	可选用任意品牌。
Matrigel	Corning	354234	"可注射基质" 在方案中。
鸡抗绿色荧光蛋白抗体	Millipore	AB16901
小鼠 RT97 杂交瘤抗体	DSHB	RT97
兔抗神经丝蛋白抗体	Encor Biotechnology, Inc	PRCA-NF-H
多克隆兔抗胶质纤维酸性蛋白抗体	Dako	Z033401
Alexa Fluor 488 标记山羊抗鸡 IgG（H+L）	ThermoFisher Scientific	A-11039
Alexa Fluor 546 标记山羊抗兔 IgG（H+L）	ThermoFisher Scientific	A-11035
Alexa Fluor 647 标记山羊抗兔 IgG（H+L）	ThermoFisher Scientific	A-21244
Alexa Fluor 647 标记山羊抗小鼠 IgG（H+L）	ThermoFisher Scientific	A-21236
共聚焦显微镜	Nikon	clsi