方法文章

利用视频显微镜评估人体脂肪组织微血管功能

6.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56079

⸱

2017年9月29日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine and Whitaker Cardiovascular Institute, Boston University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

视频显微系统可用于研究分离的脂肪组织小动脉在生理和药理刺激下的功能特性。该技术可用于检测肥胖人群中不同脂肪组织区域的微血管表型。

摘要

尽管肥胖与代谢性疾病及心血管疾病的发生密切相关，但调控这些过程的机制尚不明确。有假说认为，脂肪组织尤其是内脏脂肪所释放的促动脉粥样硬化介质，可能在局部和全身范围内促进病理性血管改变；而心血管疾病可能是脂肪组织功能障碍所致这一观点也正在不断发展。本文介绍一种独特的视频显微镜技术，用于分析从活体人类受试者脂肪组织库中分离出的完整人类小动脉对血管扩张剂和血管收缩剂的反应。该技术利用加压系统模拟体内环境，通过视频显微镜检测分离微血管在药物或生理刺激下的功能特性 体内 条件。该技术有助于深入理解脂肪组织微环境中导致血管功能障碍的病理生理学及分子机制。此外，脂肪组织微血管系统的异常也与全身性疾病相关。我们应用该技术检测了肥胖个体中不同脂肪库的部位特异性血管反应。在减重手术期间，从同一受试者获取两个不同脂肪库的脂肪小动脉（内径50–350 µm，长度2–3 mm），并评估其对血流增加和乙酰胆碱刺激的内皮依赖性舒张反应。我们发现，来自内脏脂肪的小动脉其内皮依赖性舒张功能较皮下脂肪来源的血管显著受损。该结果提示，内脏脂肪微环境与血管内皮功能障碍相关，这可能解释了临床上观察到的内脏脂肪增多与全身性疾病机制之间的关联。视频显微技术可用于分析不同脂肪库的血管表型，并比较不同程度肥胖及代谢功能障碍个体之间的差异。该方法还可用于纵向评估临床干预措施对血管反应性的影响。

引言

视频显微技术是一种有用的方法，可用于在体外（ex vivo）检测从活体人类受试者中分离出的小动脉的血管运动功能。本实验室专注于从不同脂肪组织区室中分离出微小血管，以表征各种脂肪微环境对微血管系统的影响。该技术的主要优势在于，从人体中取出的血管仍保持功能活性，可在活检后数分钟至数小时内迅速进行检测。通过微玻璃套管在管腔内维持稳定的跨壁压力，可模拟生理条件，重现许多体内（in vivo）特征1,2。此外，配备自动边缘检测软件的可靠视频显微系统，可对离体血管的内皮依赖性和非依赖性血管舒张及收缩功能进行实时的定性和定量评估，从而快速测定其对物理和药物刺激的生理反应3。其他微血管研究技术也已存在，例如张力测定法（wire myography），该方法通常耗时较短，通过力传感器测量不同激动剂引起的张力反应。

本实验室采用视频显微技术研究肥胖与血管功能障碍之间的关系，重点关注不同脂肪组织区域对血管系统的影响。中心性肥胖伴随腹腔内脏脂肪的积聚，与脂肪细胞因子的产生、代谢功能障碍以及心脏代谢风险的关联最为密切。已有假说认为，脂肪组织功能障碍导致促动脉粥样硬化性细胞因子过度产生以及脂肪因子调节失衡，在这些过程中起重要作用，但具体的调控分子和治疗靶点仍 largely 未被发现。4 此外，在局部脂肪组织水平，毛细血管稀疏化和灌注受损已被证实与脂肪组织假性缺氧及代谢失调相关。心血管疾病可能是脂肪组织功能障碍所致这一假说正在逐步形成。脂肪组织（尤其是与中心性/内脏性肥胖相关的脂肪）释放的促动脉粥样硬化介质，可能促进内皮功能障碍及致病性血管改变，这些变化可在脂肪组织局部的血管系统中显现，并可通过本文所述的方法进行检测。5

对分离的脂肪组织小动脉进行功能评估，是了解人类肥胖相关血管功能障碍的病理生理学及分子机制的有效方法。为了研究导致脂肪库特异性功能障碍的机制，我们已建立了一种方法，用于检测肥胖患者在减重手术期间获取的配对内脏脂肪和皮下（SC）脂肪组织样本中微血管的内皮依赖性和非内皮依赖性舒张反应，并评估多种调控因子的表达水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案及此处描述的示例已获得波士顿大学医学院机构审查委员会（IRB，方案编号 #H-25644）的批准，并依照《赫尔辛基宣言》的规定进行。所有受试者在参与前均签署了书面知情同意书。

1. 溶液与微玻璃毛细管的制备

  1. 配制4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸酸性盐水（HEPES）溶液。配制1 L溶液，将8.059 g NaCl、0.298 g KCl、0.296 g MgSO4•7H2O、0.235 g CaCl2•2H2O、0.16 g KH2PO4、0.01 g EDTA、1.081 g D-葡萄糖和2.383 g HEPES酸溶解于950 mL去离子水中，再用去离子水定容至1 L。用NaOH调节pH至7.4。HEPES缓冲液可在4 °C下保存最多7天。
  2. 配制20倍浓缩盐缓冲液储备液。配制1 L溶液，将143.8 g NaCl、7.0 g KCl、5.9 g MgSO4和7.4 g CaCl2•2H2O加入900 mL蒸馏水中，再用去离子水定容至1 L。将储备液于4 °C保存。
  3. 配制20倍缓冲液储备液。配制1 L溶液，将26.8 g NaHCO3和0.2 g EDTA·2H2O加入900 mL去离子水中，再用去离子水定容至1 L。将储备液于4 °C保存。
  4. 配制生理实验中使用的KREBS溶液。配制1 L溶液，加入900 mL去离子水、50 mL 20倍缓冲液储备液、50 mL 20倍盐缓冲液、0.99 g D-葡萄糖和0.16 g KH2PO4。用HCl调节pH至7.4。为维持缓冲液的pH值，需持续搅拌并用石蜡覆盖，或持续通气。
    1. 每20分钟检查一次pH值。KREBS溶液需每日新鲜配制。
  5. 使用市售的针头/移液器拉制仪制备内径为40–240 µm的微玻璃套管。玻璃套管的尺寸应根据所分离血管的内径（50–350 µm）确定。也可直接购买预定尺寸的微玻璃套管。

2. 试剂的制备

  1. 制备乙酰胆碱（Ach，10-2 M，储备液）。将 18.29 g 溶解于 10 mL 去离子水中。将 1 mL 储备液（10-2 M）分装后于 -80 °C 保存。实验当天进行系列稀释，获得以下工作浓度：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 M。
  2. 制备罂粟碱（2 × 10-2 M，储备液）。将 0.07517 g 溶解于 10 mL 去离子水中。将 10 µL 储备液分装后于 -80 °C 保存。实验当天进行系列稀释，获得 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 M 的工作浓度。
  3. 制备内皮素-1（ET-1，2 × 10-5 M，储备液）。将 50 µg 内皮素-1 溶解于 1 mL 1% BSA/PBS 溶液中。将 1 mL 储备液（2 × 10-5 M）分装后于 -80 °C 保存。实验当天稀释至工作浓度 10-10 M。
  4. 根据可用冷冻设备类型，将试剂储存于 -20 °C 或 -80 °C，但储存时间不得超过 6 个月。

3. 脂肪组织采集与血管制备

  1. 招募在波士顿医疗中心（BMC）减重手术项目中登记的肥胖男性和女性（体重指数（BMI）≥ 35 kg/m²，年龄 ≥18 岁）。共有 40 名受试者参与了这些实验。
  2. 由实施手术的外科医生在计划中的减重手术期间采集皮下和内脏脂肪组织样本。
    1. 分别从下腹壁采集皮下脂肪组织，从大网膜采集内脏脂肪组织。典型的脂肪组织样本大小为 3 - 10 mg。
    2. 立即将组织置于 pH 为 7.4 的冷 HEPES 缓冲液中，并在 4 °C 下保存不超过 24 小时。
      注：此外，也可在其他类型的手术（如疝气修复术或整形手术）期间从瘦个体中获取脂肪小动脉，或通过经皮腹部脂肪垫活检从皮下脂肪库中进行活检6。
  3. 使用组织解剖显微镜、显微剪刀和显微镊子，小心地从小的脂肪小动脉（管腔内径 50 - 350 µm，长度 2 - 3 mm）上去除周围的脂肪和结缔组织。
  4. 在将小动脉套入玻璃毛细移液管之前，使用细小的尼龙线或丝线结扎所有分支。仔细解剖小动脉，因为即使轻微损伤血管壁也会引起显著的功能改变。
    1. 尽量减少血管对光和热的暴露，因为这可能导致血管舒张。由于有时难以区分小动脉和小静脉，可通过轻夹血管末端来识别其大小和平滑肌张力。小动脉通常更小，并表现出比小静脉更强的张力。
  5. 准备器官浴槽。使用 10 mL 注射器缓慢将 KREBS 溶液注入玻璃毛细移液管和橡胶管中。
  6. 当橡胶管充满且玻璃毛细移液管已浸入器官浴槽内的 KREBS 溶液后，将小动脉牢固地套在固定好的移液管上，并用尼龙线或丝线小心地在小动脉两端打结固定。
  7. 向器官浴槽中加入 KREBS 溶液至总体积达 2 mL。
  8. 将器官浴槽固定在倒置显微镜（放大倍数 10X/0.25 物镜）和摄像机的载物台上。
  9. 启动边缘检测软件，以 1 kHz（每秒 1 帧）的采样率实时传输图像。
  10. 将加压管的一端连接至不含微小气泡的 KREBS 溶液压力储液罐，因为气泡可能引入实验误差；将加压管的另一端连接至器官浴槽。
  11. 使用洁净的管道将装有 KREBS 溶液的压力储液罐连接至压力传感器。
  12. 通过调节这两个储液罐的高度来控制管腔内流动；因此，当两个储液罐处于相同高度时，不会发生管腔内流动。
  13. 完成上述所有步骤后，开启加热板和软件程序，将温度维持在 37 °C。在整个实验过程中持续用 KREBS 溶液灌注血管，并以 5% CO2、21% O2 和 74% N2 7,8 的混合气体进行通气。
  14. 为在离体血管内实现目标压力，通过肌张力界面面板中的压力控制单元逐步增加管腔内压力（每 5 分钟增加 5 mmHg），升压速度应缓慢，以避免损伤内皮层。
    注：当压力达到 60 mmHg 时，需进行 20-30 分钟的平衡期以稳定血管状态。所有血管功能研究均在 60 mmHg、37 °C 和 pH 7.4 条件下进行7。

4. 脂肪微血管功能的评估

注意：通常情况下，脂肪组织小动脉内皮依赖性血管舒张可由生理刺激（血流诱导）和药理学刺激（乙酰胆碱诱导）引发。

  1. 血流介导的内皮依赖性血管舒张
    1. 加压后，记录脂肪小动脉在静息状态下的直径（Di），此值称为静息基线直径。
    2. 通过添加 1 µL 内皮素-1（ET-1，10）使血管收缩至静息基线管径（Dp）的约 55%−10 M）直接加入灌流液中，作用5分钟后观察效果。重复该步骤，直至达到约55%的预收缩状态。
    3. 在预收缩后，向脂肪组织小动脉的管腔内以相等且相反的方向诱导持续流动，以便在不改变60 mmHg平均管腔内压力的情况下，在血管两端形成压力差。
      注意：例如，若一个储液槽升高10 cm，则另一个储液槽需相应降低10 cm，以改变压力梯度，从而调节管腔内流速。若需更精确的流速测量，可在实验装置中接入定量流量计系统。
    4. 在血流诱导开始后3-5分钟内测量血流介导的舒张功能。管腔内血流水平（压力梯度）可在0-100 cmH₂O范围内。2O. 每次将压力梯度增量增加 Δ10 cmH₂O2每5-6分钟一次，最多至100 cmH₂O2O.
      注意：为了在管腔内诱导稳定的层流，两个微玻璃套管尖端的尺寸都必须非常接近小动脉的内径；否则，将导致管腔内产生湍流，进而引发不必要的测量误差。
    5. 在完成血流介导的血管舒张评估后，将压力储液器调回相同高度（60 mmHg）。
    6. 然后，立即从 chamber 中移除溶液，并更换为新鲜的 KREBS 溶液，以清洗 arteriole 和 chamber。操作时需小心，避免扰动 chamber 内悬浮的 arteriole。
    7. 重复此过程 3 - 4 次，持续 20 - 30 分钟，或直至分离的血管恢复至静息状态下的基础管径。
  2. 乙酰胆碱介导的内皮依赖性血管舒张
    1. 当脂肪组织小动脉恢复至静息基线管径后，通过给予内皮素-1（ET-1, 10−10 M）直接加入浴液中，具体操作如上文第4.1.2节所述。
    2. 预收缩后，依次给予递增剂量（2 µL）的乙酰胆碱，该物质是一种受体介导的一氧化氮激动剂（Ach, 10-9 至 10-5 将药物直接加入灌流液中。每次给药后5分钟记录小动脉直径的变化。
    3. 在给予最后一次乙酰胆碱剂量后，待血管张力达到平台期，用KREBS溶液冲洗血管3至4次。让血管恢复20至30分钟，使其回到静息状态下的基础直径。为帮助维持器官浴槽中的pH值，每15分钟更换一次KREBS溶液。
  3. 将小动脉与 N 孵育w-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME，10-4 M），即一氧化氮合酶抑制剂，孵育30分钟，然后重复步骤4.2.1和4.2.2，以表征一氧化氮在乙酰胆碱介导的血管舒张中的相对作用。
  4. 通过依次给予浓度递增的罂粟碱（10-8 至 10-4 M) 直接加入灌流液中。如果血管直径未恢复或未超过罂粟碱诱导的静息基线（Di）直径，则即 适当的血管舒张），则视为血管不可行，并舍弃该数据点。

5. 数据分析与计算

  1. 计算血管反应性。为消除血管初始直径差异的影响，数据以血管舒张百分比表示，并按以下公式计算：
    % 血管舒张率 = (DT - Dp / Di - Dp) × 100
    其中，DT 为在给定时间点记录的直径（最大直径），Dp 为加入血管收缩剂后记录的直径即ET-1 引起的收缩直径），Di 为加入血管收缩剂前立即记录的直径（静息基线直径）。9
  2. 定义血管舒张和血管收缩敏感性（剂量-反应）为激动剂乙酰胆碱（Ach）、罂粟碱（papaverine）或内皮素-1（ET-1）引起最大反应50%时的浓度（EC₅₀）。50可用一个S型参数来定义，并进行绘图，具体方法如前所述。10
    注意：在我们实验室中，脂肪微血管舒张的观察者间可重复性研究具有高度相关性，相关系数（CC）为0.99（n = 10 条血管实验）。

6. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准误（SEM）表示连续性测量数据。这些数据通常呈正态分布。采用重复测量的双因素方差分析法（two-way ANOVA）分析脂肪组织小动脉的血管反应性。
  2. 或者，比较不同处理组在累积性血管舒张剂量反应曲线下的面积（AUC）。所有情况下，以 P < 0.05 为差异具有统计学意义。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本实验室采用录像显微技术，检测肥胖人群皮下和内脏脂肪组织分离出的微动脉中依赖内皮和非依赖内皮的血管舒张功能，以及血管收缩功能。典型的实验装置如图1A所示。脂肪组织微动脉被悬置于两根玻璃毛细移液管之间，并用缝线固定于器官浴槽中，如图1B所示。如上文5.1节所述，可依次观察血管在基础状态下的管径（图2A），随后用ET-1预收缩至基础管径的约55%（图2B），再观察激动剂诱导的血管舒张及血管腔的松弛反应（图2C）。

我们及其他研究者观察到，在人类肥胖个体中，内脏脂肪微动脉对血流增加（剪切应力）11 和乙酰胆碱（Ach...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

从周围组织中分离和获取脂肪组织小动脉的过程可能耗时且劳动强度大，需要细致入微的操作和严格遵守技术规程。显微解剖操作需要精细的技巧以及专用的解剖器械，以避免对微血管的平滑肌层或内皮细胞层造成潜在损伤。即使小动脉壁发生微小的意外穿孔，也可能导致无法进行管腔内加压，从而使实验失败。此外，使用缝线对小动脉进行插管至关重要，以确保将血管两端牢固地固定在玻璃毛细移液管尖端之间。

人类分离的微血管在60 mmHg压力下灌注30至40分钟后可自发产生肌源性张力。然而，我们发现，人脂肪组织小动脉的内径通常为50至350 µm，相对较小，血管平滑肌层数较少，与骨骼肌小动脉相比，通常难以形成显著的肌源性张力。因此，在暴露于血管舒张剂之前，我们使用内皮素-1（ET-1）诱导这些小动脉产生预收缩。我们发现，ET-1引起的血管收缩反应更为可预测，而在某些情况下，α受体激动剂（如去氧肾上腺素）的反应可能存在变异性。选择合适的激动剂以诱导约55%的预收缩至关重要；但同样关键的是，需选择适量的预收缩剂，以避免过量导致血管毒性损伤。我们通过从较低剂量范围开始，并按照4.1.2节所述逐步滴定至目标效应来实现这一目的。<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何披露或利益冲突需要报告。

致谢

作者感谢志愿者参与本研究，以及波士顿医疗中心的外科工作人员提供脂肪组织活检样本。Gokce 博士的研究得到美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 HL081587、HL114675 和 HL126141 的资助。Farb 博士的研究得到 NIH 基金项目 K23 HL135394 的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学名称
乙酰胆碱Sigma AldrichA6625
氯化钙（CaCl2)Sigma Aldrich223506
D-(+)-葡萄糖Sigma AldrichG5767
内皮素-1Sigma AldrichE7764
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N’，N’四乙酸（EGTA）Sigma AldrichE3889
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma AldrichE9884
HEPESSigma AldrichH3784
NwN-硝基-L-arginine 甲酯盐酸盐Sigma AldrichN5751
硫酸镁（MgSO₄）4)Sigma AldrichM7506
氯化钾（KCL）Sigma AldrichP3911
磷酸氢二钾（KH₂PO₄）2PO4)Sigma AldrichP5655
罂粟碱Sigma AldrichP3510
碳酸氢钠（NaHCO₃）3 )Sigma AldrichS6014
氯化钠（NaCl）Sigma AldrichS7653
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4）Sigma AldrichS9638
名称公司目录编号评论
设备
镊子精细科学工具15000-08
倒置显微镜蔡司消色差物镜
实验室管路Euro-Pharm250100306F999
针/移液管拉制仪David Kopf Instruments720
眼科单丝尼龙缝线外科专业A7756N
剪刀精细科学工具150000-08
血管腔室DMTVAS v.2.1

参考文献

  1. Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
  2. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  3. Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
  4. Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
  5. Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
  6. Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
  7. Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
  8. Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
  9. Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
  10. Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
  11. Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
  12. Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
  13. Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
  14. Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
  15. Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
  16. Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
  17. Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
  18. Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章