本文介绍了一种主动脉环实验的新应用，其中预先标记的间充质细胞与大鼠主动脉来源的内皮网络共培养。该新方法可实现对间充质基质细胞（MSCs）归巢及其与内皮网络整合过程的可视化，对网络特性的定量分析，以及对MSC免疫表型和基因表达的评估。
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本文内容
摘要
摘要
血管生成是一个复杂且高度受调控的过程，负责提供并维持充足的组织灌注。血管系统维持不足或病理性结构异常可导致严重的缺血性疾病，而血管过度增生则与癌症和炎症性疾病相关。一种有前景的促血管生成治疗方法是利用促血管生成的细胞来源，这些细胞可为新生血管提供调控因子以及物理支持。
间充质基质细胞（MSCs）因其旁分泌效应以及对缺血或炎症组织的识别与归巢能力，被广泛研究作为血管再生的候选细胞。特别是孕早期人脐带血管周围细胞（FTM HUCPVCs），由于具有类似周细胞的特性、高增殖能力与多向分化潜能、免疫豁免特性以及显著的旁分泌功能，成为极具前景的候选细胞。为了有效评估潜在的促血管生成再生细胞，必须在可靠且 "可翻译的" 临床前实验。主动脉环实验是一种 离体 一种可轻松量化管状内皮结构、利用宿主提供的辅助支持细胞和细胞外基质（ECM）、排除炎症成分，且建立快速、成本低廉的血管生成模型。与传统方法相比，该模型具有显著优势。 体内 模型（例如角膜检测，Matrigel栓塞检测）；主动脉环检测可追踪施用的细胞并观察细胞间相互作用，同时避免异种免疫排斥。
我们介绍一种主动脉环实验的新应用方案，该方案在发育中的大鼠主动脉内皮网络与人源间充质干细胞（MSCs）共培养体系中进行。该实验可用于分析MSCs通过类似周细胞的物理相互作用对管状结构形成和发育的贡献，评估其主动迁移至血管生成位点的能力，以及检测其执行和介导细胞外基质（ECM）加工处理的功能。本方案还提供了MSCs在共培养后表型变化及基因表达改变的进一步信息。
引言
血管生成是一个复杂的过程，通过促进从已有血管系统中形成新的血管来改善并维持组织灌注1。该过程由促血管生成因子和抗血管生成因子共同进行严密调控，保持动态平衡。此系统中任何缺陷均可能导致血管维持或生长不足，从而引发严重缺血性疾病，包括心肌病、脑卒中和神经退行性疾病。然而，过度的血管发育则是癌症和炎症性疾病等病症的典型特征2。
开发旨在调控血管生成以实现理想组织再生的疗法具有重要意义。尽管已开展大量临床前和临床研究，但利用促血管生成因子和微小RNA刺激血管生成的尝试尚未达到预期效果3,4,5。其效应短暂的可能原因包括：促血管生成蛋白和核酸的存续时间有限，以及靶向生长因子的种类有限6,7。尽管可溶性促血管生成因子对启动血管生成至关重要，但脉管系统的维持及其功能依赖于周细胞和平滑肌细胞等支持性细胞类型8。目前，促血管生成治疗领域正在探索潜在的干细胞和祖细胞来源，这些细胞不仅可局部提供促血管生成因子，还能在物理上支持新生脉管系统，并具备自我更新能....
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方案
所有涉及动物的研究均按照ARRIVE指南进行并予以报告29所有研究均经机构研究伦理委员会批准（REB编号4276）。所有动物实验均经大学健康网络动物护理委员会（多伦多，加拿大）批准，所有动物均按照 实验动物护理和使用指南, 8th （美国国立卫生研究院，2011年版）
1. 主动脉环实验设置
- 分离大鼠主动脉。
- 使用 CO2 窒息法处死 8–10 周龄的 Sprague-Dawley 大鼠：将 CO2 气室设置为 20% 气体置换率（流速 = 0.2 × 气室体积/分钟）。通过捏夹反射消失及触诊胸部无心跳来确认死亡。
- 用含 70% 乙醇的无菌纱布润湿胸部区域的毛发。使用无菌镊子和剪刀沿胸部正中线切开皮肤和肌肉层。
- 暴露肋骨后，在两侧距胸骨约 5 mm 处剪断肋骨并向上翻折。新鲜尸体中肋间动脉可能出现少量出血，属正常现象。
- 将肺组织和心脏推向解剖学右侧，以暴露主动脉。主动脉为紧邻脊柱的一条白色血管。
- 用镊子夹住主动脉弓远端部位，同时用手术剪在镊子夹持处进行首次剪切。一旦切断主动脉，胸腔将迅速充满血液，因此必须迅速操作，以在血液凝固前取出主动脉。
- 用镊子夹住主动脉，轻轻自脊柱方向向下剥离。牵拉动作....
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结果
建立主动脉环/间充质干细胞共培养实验的示意图流程见图1。主要步骤包括：大鼠主动脉的分离、主动脉环的切片与包埋、内皮细胞出芽及网络形成的监测，以及最终对间充质干细胞的标记与添加。内皮网络分析的时间线标明了共培养各阶段（第1、5和7天）可进行分析的时间窗口。附加说明以虚线框标出。
通过明场显微镜在主动脉环内皮细胞培养中识别结构上不同的区域，通常在主动脉环嵌入细胞外基质（ECM）后3-5天进行（图2）。无结构区域（图2A）表现为靠近主动脉组织直接邻近区域的高细胞增殖但低结构有序性。已形成的内皮网络（图2B）指具有高度结构有序性的区域，其中网络已完全建立，并主要由闭合环路构成，即使在添加间充质干细胞（MSCs）之前即已如此。.......
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讨论
建立成功的主动脉环与间充质干细胞（MSC）共培养实验包含几个关键阶段。首先，分离和切片主动脉时最重要的步骤包括：1）仅获取主动脉的胸段部分；2）仔细去除分支血管、结缔组织和脂肪组织；3）将主动脉切成厚度均匀的节段（约1 mm），以减少各次实验之间的变异性。其次，将主动脉环成功包埋于基底膜提取物（BME）中对该实验至关重要。如果BME未完全聚合或聚合不均匀，则包埋在其中的主动脉环将无法启动内皮出芽，或可能形成不连续的内皮网络。若BME聚合不充分，则实验结果不可靠，无法用于定量分析。第三，必须使用含有完整生长因子的内皮细胞培养基，以为主动脉环启动出芽提供必要的营养支持。一旦主动脉环开始血管出芽，接下来的关键步骤涉及待测细胞类型的处理。为此，需要成功预先标记MSC并将其加入正在出芽的主动脉环中。该环节有两个关键操作步骤：1）选择合适的接种时间：此时血管网络应处于发育阶段，尚未达到培养孔内过高的覆盖面积。若MSC未能及时加入，将难以准确量化其对血管网络发育的净效应；2）在加入前对MSC进行预标记：若MSC染色过强或长时间保留在沉淀中，会导致细胞聚集，从而影响其向内皮网络的归巢与整合。最后，只要设置了适当的对照组，血管网络的定量分析便可顺利实现。.......
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披露
Clifford L. Librach 博士是以下专利的共同持有人：从妊娠早期脐带组织中分离和使用细胞的方法。该专利于加拿大和澳大利亚获得授权。
致谢
作者感谢以下工作人员和研究人员：Andrée Gauthier-Fisher、Matthew Librach、Tanya Barretto、Tharsan Velauthapillai 和 Sarah Laronde。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | 用于FTM HUCPVC和BMSC培养基。 |
| APC标记的抗人TRA-1-85抗体 | R&D Systems | FAB3195A | 用于流式细胞术和细胞分选的人源特异性细胞标志物 |
| 基底膜提取物（BME）（Matrigel） | Corning | 354234 | 用于主动脉包埋 |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | 包含：庆大霉素/两性霉素-B （GA）、人表皮 生长因子（hEGF）、血管 内皮生长因子（VEGF）、R3- 胰岛素样生长因子-1（R3-IGF-1）、 抗坏血酸、氢化可的松、 人成纤维细胞生长因子-β（hFGF-β）、肝素、胎牛血清 （FBS）。用于制备EGM |
| CellTracker Green CMFDA染料 | Thermo-fisher | C2925 | 用于MSCs染色，MSCs对绿色染料摄取效果最佳 |
| CKX53培养显微镜 | Olympus | 用于内皮网络发育的明场成像 | |
| Countess全自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 | 用于MSC培养、流式细胞术和qPCR的细胞计数 |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | 用于解离主动脉环-MSC共培养物（使用前于37 °C预热） |
| 一次性无菌手术刀 | VWR | 21909-654 | 用于主动脉切片 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS，1×，不含氯化钙和氯化镁 |
| 内皮基础培养基（EBM） | Lonza | CC-3156 | 培养主动脉环实验-MSC共培养物所需的基础培养基（使用前于37 °C预热）。用于EGM和EBM-FBS的配制 |
| 70%乙醇，生物技术级 | VWR | 97064-768 | 用于表面消毒 |
| EVOS | Life Technologies | 实验室自用荧光显微镜，用于追踪MSC迁移与整合 | |
| 胎牛血清（FBS）（Hyclone） | GE Healthcare | SH3039603 | 细胞培养基中的血清组分 |
| FITC标记的抗CD31抗体 | BD | 558068 | 用于流式细胞术的人源内皮细胞标志物 |
| FITC标记的抗CD146抗体 | BD | 560846 | 用于流式细胞术的人源周细胞标志物 |
| 镊子 | Almedic | 7727-A10-704 | 用于处理大鼠组织。可使用任何类似的镊子 |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Life Technologies | 14175-094 | 1×，不含氯化钙和氯化镁 |
| HERAcell 150i CO2培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | 用于细胞培养 |
| 人血管生成RT2分析PCR阵列 | Qiagen | PAHS-024Z | 人源特异性，包含84个参与血管生成基因的引物。每个孔对应一个引物反应 |
| ImageJ | 开源图像处理软件。需安装血管生成分析插件 | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC实验平台。用于流式细胞术。 | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC实验平台。用于细胞分选。 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | 缓冲液和细胞培养基中的抗生素组分 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | 用于RNA纯化。包含细胞裂解缓冲液 |
| RT2Easy第一链合成试剂盒 | Qiagen | 330421 | 用于qPCR的cDNA制备 |
| RT2PreAMP cDNA合成试剂盒 | Qiagen | 330451 | 当RNA得率较低时用于cDNA预扩增 |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 14059-11 | 用于剪开皮肤、肌肉和主动脉 |
| 无菌纱布 | VWR | 3084 | 用于湿润和消毒胸部毛发 |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC解离酶，使用前于37 °C预热 |
| 0.2 μm孔径滤器 | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | 用于组织培养基的灭菌 |
| 0.25%胰蛋白酶/EDTA | Gibco | 25200056 | 用于细胞解离，使用前于37 °C预热 |
| 10 cm组织培养皿 | Corning | 25382-428 | 用于主动脉清洗与切片以及MSC细胞培养 |
| 12孔细胞培养板 | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | 用于建立主动脉环实验-MSC共培养体系 |
| 15 mL离心管 | BD Falcon | 352096 | 用于常规组织培养操作 |
| 70 μm细胞筛 | Fisherbrand | 22363548 | 确保在流式细胞术或分选前获得单细胞悬液 |
参考文献
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J.
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