方法文章

从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

DOI：

10.3791/56086

⸱

2017年12月7日

 ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞中有许多蛋白质能够感知并诱导膜曲率。本文介绍一种从脂质囊泡中拉取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质或任何具有曲率活性的分子与弯曲膜之间的相互作用 体外.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞膜的重塑是许多细胞现象的重要组成部分，例如内吞作用、囊泡运输以及丝状伪足的形成 等等许多不同的蛋白质由于能够感知或诱导膜曲率而与弯曲的膜结合。通常，这些过程涉及多种蛋白质，使得在细胞内对其进行定量研究过于复杂。本文描述了一种重建弯曲膜的实验方案。 体外模拟弯曲的细胞结构，例如内吞作用颈部。使用 giant unilamellar vesicle（GUV）作为细胞膜模型，通过微管吸吮技术控制其内部压力和表面张力。利用光镊在 GUV 上施加点拉力，可形成一个高曲率的纳米管，连接于平坦的膜结构。该方法传统上用于测量脂质膜的基本力学性质，例如弯曲刚度。近年来，该技术已扩展至研究蛋白质如何与膜曲率相互作用，以及它们如何影响膜的形态与力学特性。结合微操作、显微注射、光镊与共聚焦显微镜的系统，可同时测量膜曲率、膜张力以及膜上蛋白质的表面密度。基于这些测量结果，可推断出蛋白质-膜系统多种重要的力学与形态学特性。此外，我们还提供了在生理盐浓度条件下制备 GUV 的实验方案，以及通过标记的蛋白质和脂质的荧光强度定量膜上蛋白质表面密度的方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

许多细胞过程，如内吞作用、转运、丝状伪足的形成、感染等 等等。伴随着细胞膜形态的显著变化1,2在细胞内，多种蛋白质通过与膜结合并改变其自身形状来参与这些过程。其中最典型的例子是 Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) 蛋白家族成员，其含有一个特征性的、具有内在弯曲结构的 BAR 结构域。3,4,5,6,7通常，它们通过将BAR结构域粘附到膜表面，并在许多情况下将两亲性螺旋浅插入双分子层来与膜相互作用。BAR结构域的形状、大小和电荷，以及两亲性螺旋的数量共同决定了：（1）膜曲率的方向即，无论它们会诱导膜内陷还是外凸）以及（2）膜曲率的大小5,8值得注意的是，此处正曲率定义为弯曲膜的凸面一侧， 即，朝向相互作用粒子的凸起部分为正，否则为负。此外，对BAR蛋白的定量研究表明，其对膜的影响取决于一组物理参数：蛋白质的表面密度、膜张力以及膜的形状（平坦） 与 管状的 与 球形7根据这些参数，BAR 蛋白可以：（1）作为膜曲率的感应器，（2）弯曲膜结构，或（3）诱导膜断裂7.

由于细胞内参与膜重塑的组分数量众多，对内吞作用等现象的定量研究在活体（in vivo）条件下极具挑战性。体外（in vitro）重构模拟细胞中弯曲膜的最小组分，为理解膜弯曲蛋白的作用机制提供了有效途径。本文描述了一种利用微操作、共聚焦显微镜和光镊技术在体外重构膜纳米管的实验方案。该方法可用于定量研究蛋白质、脂质或小分子如何与弯曲膜相互作用。脂质大单层囊泡（GUVs）被用作细胞膜的模型，其曲率相对于相互作用的膜弯曲分子的尺寸可忽略不计。GUVs通过电形成法9制备，该方法通过在交流电（AC）条件下水合脂质薄膜并使其溶胀形成GUVs10。目前培养GUVs最常用的基底是涂有氧化铟锡（ITO）的半导体片或铂丝（Pt-wires）11。本研究采用铂丝作为基底，因为已有研究表明，在缓冲液含盐条件下，该方法比其他方法更有利于GUVs的形成12。尽管本文已对电形成方案进行了足够详细的描述以供重复，我们仍建议读者参考此前已发表的关于GUVs制备的类似或其他方法的详细文献13,14。在我们的实验中，采用铂丝电形成法可在含有约100 mM NaCl的缓冲液中，成功从合成脂质混合物或天然脂质提取物中制得GUVs。此外，在GUVs生长过程中还可实现蛋白质的包封。一种典型的电形成装置如图1A所示；其由两根长约10 cm的铂丝插入聚四氟乙烯（PTFE）制成的支架中构成，支架两侧可用玻璃盖玻片密封，盖玻片间距约为1–2 cm（图1A）。

电泳设备和微量移液器装置；配备蛋白质分析工具的显微镜载物台。
图 1：实验装置。（A）GUV 电形成腔室，铂丝已连接至电极接头。（B）左图：实验系统，显示显微镜、物镜上方的实验腔室，以及连接至显微操作器并插入实验腔室的两支微量移液器（左侧和右侧），用于拉管和蛋白质注射。右图：实验腔室安装在物镜上方的特写图，显示吸液和注射用微量移液器的尖端已插入。（C）一支注射器配备细加样器，从后端插入微量移液器。底部为微量移液器内部加样器的特写图，蓝色虚线标示出微量移液器的轮廓。该系统用于向微量移液器中填充酪蛋白以钝化玻璃表面，必要时也可用矿物油进行反向填充。（D）用于吸取微升级别蛋白质溶液的系统。针头连接至注射器和导管，导管再连接至注射用微量移液器。将微量移液器尖端小心浸入蛋白质溶液中并进行抽吸，以填充其尖端。随后使用图 C 所示系统，用矿物油对微量移液器进行反向填充。请点击此处查看该图的放大版本。

通过外力可以从一个GUV上拉出半径范围从7 nm到几百nm的膜纳米管。该方法最初设计用于测量细胞膜和囊泡的弹性性质，例如弯曲刚度15,16。在最近的多数研究中，该方法被扩展用于通过在拉出的纳米管附近显微注射蛋白质来研究蛋白质与弯曲膜的相互作用7,17。其他方法也被开发用于研究膜弯曲蛋白。其中一种方法是将蛋白质与固定在钝化表面上的不同尺寸脂质体共同孵育，利用共聚焦显微镜测量蛋白质结合量随脂质体直径的变化，从而指示曲率诱导的分选效应18,19。另一种方法是将蛋白质注射到微吸的GUV附近，以测量其自发诱导管状结构的能力20,21。本方案中描述的方法特别适用于研究参与内吞作用的膜弯曲蛋白，因为在内吞过程中，大多数蛋白质通常会遇到预先形成的膜纳米管，这些纳米管连接着含有货物的膜凹陷区域与下方平坦的质膜。此外，与使用固定小脂质体的检测方法不同，该方法中的膜纳米管持续与膜相连，因此与GUV处于力学平衡状态，这更接近体内（in vivo）的真实情况。因此，基本的膜物理原理适用，我们能够从测量结果中推断出多种力学性质22,23,24。

要完整实施该方法，所需的设备包括共聚焦显微镜、光镊以及一个或两个连接至水箱的微吸管（图1B）。通过结合这三种技术，可同时测量膜张力、膜曲率、蛋白质表面密度以及纳米管受力25。微吸管抽吸是必不可少的步骤，可通过将玻璃微吸管插入连接至水箱的持针器中实现，利用静水压来控制抽吸压力26。微吸管及其持针器由微操纵器控制，理想情况下在一个方向上使用压电驱动器以实现精确移动。为拉出纳米管，先将微吸管抽吸的GUV短暂黏附到一个微米级小球上，然后将其拉离以形成纳米管。在此实施方案中，小球由光镊固定，光镊可依据已发表的方案构建27。也可不使用光镊而采用其他方式拉取纳米管，但会牺牲力的精确测量。如果构建光阱存在困难，或无需进行力的测量（例如仅需检测蛋白质对弯曲膜的偏好性），则可使用第二个微吸管尖端吸附小球的方式来拉取纳米管28。此外，也可利用重力29或流体剪切力30,31来拉取纳米管。共聚焦显微镜同样并非绝对必需，但因其可用于测量蛋白质的表面密度而被优先选用。它还允许通过纳米管中脂质的荧光强度来测定纳米管半径，从而独立于膜受力和张力进行测量。当由于膜结合蛋白的存在导致相关物理量之间的关系偏离已确立的方程时，通过荧光推断纳米管半径尤为重要25。需要特别注意的是，不能同时省略光阱和共聚焦显微镜，否则将无法测量纳米管的曲率。

本方案所述方法已用于研究各种外周膜蛋白在纳米管上的曲率诱导分选，主要针对BAR家族的蛋白25,32,33,34还发现，呈圆锥形的穿膜钾离子通道KvAP与BAR蛋白一样，在弯曲的纳米管上富集。35通过优化将蛋白质封装到GUVs内部的方法，近期也对蛋白质与负曲率之间的相互作用进行了研究36此外，该方法已被用于阐明蛋白质支架的形成机制25,37 并研究由线张力介导的膜断裂机制38蛋白dynamin39或由 BAR 蛋白40,41除了蛋白质外，小分子或离子也能诱导膜曲率。利用该方法，在无盐条件下证实钙离子可诱导正曲率。42有趣的是，研究还表明脂质可能发生曲率介导的分选，但仅限于接近相分离临界点的组分。43,44总之，该方法可供致力于研究整膜组分（例如，脂质或跨膜蛋白）或外周结合分子（在GUV内部或外部）从力学和定量角度与柱状曲率膜相互作用。本方法也适用于对膜自身力学性质测量感兴趣的研究者22,23,45.

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方案

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1. 通过铂丝电极形成法制备大单层囊泡（GUVs）

  1. 使用乙醇或丙酮等有机溶剂清洗电泳形成室（参见引言和图1A）及铂丝，以去除脂质，再用水清洗以去除盐分。
    注意：建议先用浸有乙醇的擦拭纸彻底擦去残留物，然后依次在丙酮、乙醇和水中各超声处理5分钟。
  2. 将所需组成的脂质混合物溶于氯仿中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。该混合物应包含约0.05%摩尔分数的生物素标记脂质（例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基（聚乙二醇）-2000]）和约0.5%摩尔分数的荧光染料标记脂质（例如，BODIPY-TR-C5-神经酰胺）。
    注意：根据我们的经验，当带电脂质含量超过30%时，难以高效制备大单层囊泡（GUV）。
    警告：氯仿应在通风橱内操作，并佩戴合适的手套。
  3. 将一对铂丝插入电泳形成室中。将脂质混合液以液滴形式点样于铂丝上，各液滴之间相距约2–3 mm（总共约4 µL）。
  4. 在室温下将铂丝置于真空环境中干燥30–60分钟。
  5. 用硅脂将盖玻片粘附于电泳形成室底部以密封。向室内加入含有NaCl、蔗糖和缓冲剂的缓冲溶液（例如，70 mM NaCl、100 mM蔗糖和10 mM Tris，pH 7.4）。该介质将在实验中位于GUV内部。必须确保该介质的渗透压与实验介质的渗透压相差不超过约10%。使用蔗糖调节渗透压。若目标是将蛋白质包封入GUV中，则在此溶液中加入所需浓度的蛋白质。
    警告：缓冲液中的各种盐类和糖类可能影响膜的弯曲刚度和自发曲率24,42,46,47。
  6. 用硅脂将另一盖玻片粘附于电泳形成室顶部，确保腔室内空气尽可能少。在铂丝之间施加频率为500 Hz、电压为280 mV的正弦交流电。
    注意：生长时间和温度需根据脂质组成和蛋白质的敏感性进行优化。当使用天然脂质提取物或需在GUV中包封蛋白质时，最佳产率通常通过在4 °C下过夜生长实现。若无蛋白质存在且使用合成脂质组成，则在室温下生长约2小时即可。

2. 实验室培养皿和微移液管的制备

  1. 制备微移液管时，使用移液管拉制仪拉制玻璃毛细管。建议使用内径和外径分别为 0.7 mm 和 1 mm 的玻璃毛细管。然后使用微加工仪修整微移液管尖端，使其内径为 5–7 µm。如果实验中需要注入蛋白质或其他分子，则另拉制一根微移液管，并将其尖端修整至内径为 8–15 µm。
  2. 通过将两片矩形显微镜盖玻片放置在金属基底上构建实验腔室，如图1所示。盖玻片之间应相距约 1 mm。腔室的长边应留有开口（见图1）。开口的一侧应能容纳微移液管的尖端，且尖端至少应到达腔室中心。
  3. 配制实验缓冲液，其渗透压与用于生长GUVs的缓冲液相比差异不应超过10%。使用葡萄糖调节渗透压。用于研究内吞蛋白（endophilin）与纳米管相互作用的一个实验缓冲液示例为：100 mM NaCl、40 mM 葡萄糖，用Tris缓冲至pH 7.4。腔室内使用蔗糖、腔室外使用葡萄糖的组合可实现：(a) 足够的相位对比度，以便在明场显微镜下观察GUVs；(b) GUVs内部密度更高，使其沉降到腔室底部。根据实验需求调整盐浓度。
    注意：除影响膜的机械性能外，根据我们的经验，高浓度葡萄糖（> 300 mM）会负面影响链霉亲和素-生物素键的形成，而该键是拉制纳米管所必需的。此外，盐浓度过低会抑制链霉亲和素-生物素结合，而过高则会屏蔽蛋白质-膜相互作用。若涉及蛋白质包封，可在外部缓冲液中使用极高盐浓度（例如，>200 mM NaCl）作为技巧，使蛋白质从膜的外小叶解离36。有必要尝试一系列盐浓度，以找到目标分子的最佳结合条件。
  4. 在收集用于实验的GUVs前30–60分钟，用5 mg/mL的高纯度β-酪蛋白溶液（例如，溶于实验缓冲液中）填充实验腔室和吸液微移液管，以钝化玻璃表面。β-酪蛋白在玻璃表面形成保护层，防止GUVs过度黏附，从而避免其破裂。用β-酪蛋白孵育30–60分钟。
    注意：微移液管内部不应有气泡，否则会干扰膜张力的控制。
    1. 为构建用于填充微移液管的分配装置，将注射器针头靠近塑料连接处折断，并将一根细的二氧化硅毛细管（如液相色谱所用毛细管）粘入其中（图1C）。
  5. 在β-酪蛋白孵育期间，将腔室安装在显微镜上，并使其位于物镜正上方居中。将吸液微移液管的尖端从长边的开口插入，并将其移至显微镜物镜上方。调节水箱液位，使吸液压力接近零（在显微镜下观察，移液管内应无明显液体流入或流出）。
  6. 若实验中需注入蛋白质或其他分子，则将所需浓度的目标分子溶于实验缓冲液中，填充至注射用微移液管内，将该微移液管安装至显微操作器上，并从实验腔室的对侧插入。
    1. 为最大限度减少蛋白质用量，仅通过吸液方式将蛋白质溶液填充至微移液管尖端。具体操作为：将连接注射器的针头末端用塑料软管包裹，再将软管插入注射微移液管的后端。
    2. 小心地将微移液管尖端浸入蛋白质溶液中，并通过吸液填充尖端部分。
      注意：该简易装置如图1D所示，根据我们的经验，该方法可从仅几微升的蛋白质溶液中完成吸液。
    3. 使用矿物油从后端填充注射微移液管的其余部分，以防止蛋白质溶液与水箱中的水混合（可使用图1C中的装置）。
    4. 注意避免在注射移液管中引入气泡，否则会导致注射压力不稳定。或者，若蛋白质量充足，可参照步骤2.4中填充β-酪蛋白的方法填充微移液管。调节水箱液位，以最小化注射移液管中的吸液压力。
      注意：由于稀释作用，注入分子或离子在纳米管附近的浓度会较低，可通过测量距移液管出口不同距离处荧光强度的下降来估算42。然而，更重要的是了解注入分子在双分子层上的结合密度，该值可被精确测定（见第4节）。
  7. 完成β-酪蛋白孵育后，从腔室中移除溶液，并用实验缓冲液多次冲洗，随后加入实验缓冲液填充腔室。
  8. 停止GUVs的电形成过程，直接从铂丝上收集GUVs。向实验腔室中加入几微升GUV溶液。仅使用新鲜制备的GUVs。
  9. 向实验腔室中加入几微升链霉亲和素包被的微珠，使腔室中微珠的终浓度约为 0.1 x 10−3 %（w/v）或更低。推荐使用直径约3 µm的聚苯乙烯微珠（聚苯乙烯微珠在水中的折射率对比度接近最优，可在光镊中最大化梯度力相对于散射力的效果）。微珠浓度可根据实验调整：浓度过低会使在腔室中寻找微珠变得困难，而过高则可能导致多个微珠落入光镊中。

3. 从GUV中拉出膜纳米管

  1. 让GUVs和微珠沉降到腔室底部。通过让少量实验缓冲液蒸发约15分钟，使GUVs去膨胀。使GUVs去膨胀对于产生可被微移液管吸入的多余表面积至关重要。GUVs应出现明显的波动（即在光学显微镜下观察呈松软状。若其外观紧绷，需延长挥发时间。
    注意：渗透压变化速率取决于蒸发表面积和温度， 等等。，并应密切监测。原则上，可通过调整蔗糖/葡萄糖浓度从实验开始时设定渗透压差，但需注意避免引起渗透冲击。
  2. 找到一个柔软的GUV，并将其吸入移液管中。吸吮舌长度（膜在移液管内的部分）应等于或大于移液管半径，以便理论分析适用。15,16,22,23 (图2）。尝试多个GUV。如果无法吸入GUV以形成足够长的舌状突起，则等待数分钟。若GUV足够柔软，继续下一步操作。
  3. 用矿物油密封腔室，以防止缓冲液进一步蒸发。操作时，沿实验腔室的开放边缘小心地用移液器加入矿物油。
  4. 为设定吸液压力的零点位置，首先在样品室中寻找一个微珠，并将吸液移液管的出口置于微珠附近。调节水箱的高度，使微珠既不被吸入移液管，也不被吹离。尽管矿物油可防止蒸发，从而避免样品室内产生进一步的压力变化，但仍需在每次测量GUV之前重新校准吸液压力至零点。
  5. 找到一个GUV并将其吸入。将微移液管向上移动并移出焦平面（以使GUV远离表面，避免在移动腔室时因剪切应力导致GUV被从移液管中拉出）。
  6. 仔细移动观察腔室以寻找微珠。突然的移动可能导致GUV被弹出。使用光镊将微珠捕获在距离腔室底部约20 µm的位置。确保目标区域干净，视野中无其他微珠或膜结构。除微珠外的任何物质进入光镊区域都会干扰测量。
  7. 将GUV重新移回焦点，并用与光镊对齐的微移液管将其移离小球图2).
  8. 记录微珠的运动1–2分钟，以测量其平衡位置（用于力的测量）。
  9. 尽可能降低微移液管内的压力，但避免丢失巨型脂质体（GUV），以减小膜张力。小心地将GUV与微珠接触约一秒钟，形成链霉亲和素-生物素键，然后轻柔回拉以形成纳米管。理想情况下，GUV向微珠靠近或远离的运动应通过压电驱动器完成，以最小程度干扰光镊中的微珠。
    注意：如果纳米管未形成，可能是由于磁珠上的链霉亲和素包被效果不佳、GUV 中生物素化脂质含量不足、实验缓冲液中盐浓度过低或葡萄糖浓度过高，或 GUV 中膜张力过高所致。48.
  10. 增加吸液压力以重新形成吸液尖端。将导管与吸液移液管的轴线对齐，并尽可能对导管进行聚焦。图2).
  11. 确保 GUV 赤道面与管状结构处于焦平面。使用明场显微镜记录珠子运动数分钟（此处相机采集速度为 30 Hz）。记录高度， h水箱相对于零位的位置。对该系统拍摄几张共聚焦图像（图2).
  12. 在不同的吸液压力（即隐含的膜张力）下重复上一步操作。典型的张力范围为 0.015–0.2 mN/m，步长约为 0.02 mN/m。
  13. 若在系统附近注射蛋白质或分子，需将注射微移液管移至纳米管附近，确保光镊中的微珠不受干扰。以约1–2 Pa的压力轻轻注射。
  14. 在蛋白质结合达到平衡后（即注入的蛋白质在GUV膜上的荧光强度保持恒定），重复对裸膜进行的分步测量（步骤3.11和3.12）。
    注意：由于在恒定压力下于GUV附近注入蛋白质时进行测量，GUV附近的蛋白质本体浓度基本保持不变；因此，在测量过程中蛋白质解吸可忽略不计。
    1. 或者，可以在进行拉管实验之前，先将GUVs与蛋白质共同孵育，以确保蛋白质在体相中的浓度恒定。由于测量的是蛋白质在膜管与GUV膜上的相对分布比例，因此蛋白质的递送方式不会影响曲率分选的计算结果（见第4节）。

光镊示意图与荧光图像；对囊泡施加力；生物物理学研究方法。
图 2：膜管拉伸实验。（A）实验示意图。（B）按照本方案所述拉出的膜管的共聚焦图像。比例尺 = 2 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 测量与数据分析

  1. 测量膜张力
    1. 在恒定抽吸压力下，计算每一步的静水压力：
      ΔP = pgh
      其中 p 是水的密度， g 重力加速度，以及 h 步骤3.11中水箱的高度
    2. 从共聚焦图像中测量GUV的半径， rGUV以及吸液毛细管的半径， r移液管 (图2).
    3. 使用拉普拉斯方程计算膜张力 σ49:
      Equation showing tension calculation using ΔP and radius ratios; related to membrane dynamics.
  2. 测量膜张力
    1. 测定光镊的刚度 k，通过使用多种校准方法之一27在此设置中，测量 k 使用黏性阻力法27.
    2. 计算小球的平衡位置， a0，取拉动导管前测量值的平均值（步骤 3.8）。
    3. 对于每次恒定张力测量，计算平衡膜力， F，来自胡克定律：
      F = k(a - a0)
      其中 a 是该测量过程中小球的平均位置。
  3. 测量管半径
    1. 对于裸膜（未添加膜弯曲分子）的情况，计算膜管半径。 R，由力可得：
      R = F/(4πσ)
      （参考文献22,23).
    2. 为了在存在膜弯曲分子的情况下测量管径，并独立于步骤 4.3.1，首先沿管状结构的长度记录脂质荧光强度， I管，以及沿GUV轮廓， 我GUV沿管状结构或GUV轮廓最亮线条，测量膜内或膜结合荧光团的平均荧光强度。选择一个包含GUV轮廓或管状结构水平截面的矩形框，计算框内每条水平线荧光强度的总和。
      1. 将每个总和除以水平线的像素数量（即，方框的宽度）。注意在选定的方框区域内不应存在其他膜结构。获取沿选定方框长度方向的荧光强度分布曲线。
      2. 扣除背景强度后，取最亮线条的平均像素荧光强度。管状结构的半径与沿管轮廓和GUV的荧光强度比值呈线性关系，公式如下：
        R = K管我管/我GUV
        其中 K管 是一个校准因子25.
        注意：该方法可用于测量10–80 nm范围内的管径（当管径足够细，可完全位于一个共聚焦体素宽度内时），而在80 nm及以上范围的测量不确定性相对较大。测量灵敏度取决于实验装置。
    3. 确定 K管 通过在步骤4.3.1和4.3.2中使用不带电荷的脂质构建简单的膜体系并进行独立的半径测量。此类简单的膜组成可确保半径与作用力之间具有步骤4.3.1中给出的简单关系。重复实验多次，并绘制 R，根据力（步骤 4.3.1）与 我管/我GUV （步骤 4.3.2）。计算 K管 来自拟合结果。在此设置中， K管 使用卵磷脂L-α-磷脂酰胆碱（egg-PC）膜和一种荧光几乎不受偏振影响的荧光脂质，粒径为200 ± 50 nm25.
      注意： K管 由于不同物镜的共焦体素体积不同，必须针对不同物镜进行测量。所用脂质荧光探针不应与注射的蛋白质/分子发生相互作用。本文推荐使用的荧光脂质BODIPY TR ceramide预期不会与蛋白质发生相互作用，此前关于BAR和I-BAR结构域的研究已证实了这一假设。25,36,37，这表明在蛋白质表面覆盖率较高时，管状结构的半径由蛋白质决定，而与GUV中的张力无关。如果蛋白质与脂质荧光标记物发生相互作用，则在不同的高蛋白质表面分数下，可在管状结构中观察到荧光标记物的耗尽或富集现象。
  4. 测量蛋白质的表面密度
    1. 使用一种简单的非带电脂质制备脂质混合物例如，添加了约五种不同摩尔分数的荧光脂质（其发射波长与标记蛋白所用染料相同）的蛋磷脂酰胆碱（egg-PC） 例如，BODIPY-FL C5-十六酰基-磷脂酰胆碱（HPC*）用于 例如，Alexa488标记的蛋白质）在以下范围内：XHPC* = 0.01–1%。通过在ITO板上进行电形成法，在100 mM蔗糖溶液中制备GUVs（参照先前发表文献的步骤1）13).
    2. 收集GUVs并转移至经β-酪蛋白钝化的实验腔室中。使用 例如，实验溶液中含100 mM葡萄糖。等待数分钟，使GUVs沉降。
    3. 拍摄GUVs的共聚焦荧光图像，并记录GUVs轮廓上平均荧光强度随荧光脂质摩尔分数的变化（见步骤4.3.2）。针对每种组分，计算荧光脂质的面积密度φHPC*例如，假设每个脂质分子所占面积为0.7 nm²2，φHPC* = 1.43 × 106 XHPC* 每片小叶。绘制GUV中HPC*的荧光强度I高产率胆固醇囊泡*，巨型脂质体, 与 φHPC*拟合得到校准常数， A，由 φ 给出HPC* = 人工智能高产率胆固醇囊泡*，巨型单层囊泡. A 取决于显微镜设置，例如激光功率和探测器灵敏度（即，增益），因此记录 A 适用于各种常用的显微镜设置（参见示例） 图3).
    4. 配制多种将HPC*溶解于去垢剂中的溶液， 例如十二烷基硫酸钠（SDS），在约1至10-50 µM的不同浓度下。记录每种溶液的整体荧光强度，并计算强度的斜率 与 浓度（图3）。用将要与蛋白质偶联的荧光染料，在相似的浓度范围内重复测量（参见Alexa488的示例 图3）。该测量用于关联蛋白质标记物和脂质标记物的荧光强度， 我A488，大量 / 我HPC*，大量因为它们在相同的总体浓度下未必会以相同的方式发光。
    5. 使用荧光分光光度计测量每个蛋白质分子上的荧光团数量。例如，对于Alexa488，测定每个蛋白质分子所结合的Alexa488分子数量， nA488，可使用以下关系式计算：
      nA488 = (A494/εA488)/((A280 - 0.11A494) / ε蛋白)
      其中 A494 和 A280 分别为在 494 nm 和 280 nm 处单位长度的吸光度值，εA488 和 ε蛋白 分别为 Alexa488 和蛋白质的分子吸收系数。
    6. 计算GUV上蛋白质的表面密度φ蛋白，GUV，根据以下公式：
      Static equilibrium equation: GUV protein absorption ratio, formula in spectroscopy analysis.
      注意蛋白质的聚合状态。例如，BAR 蛋白会形成二聚体，因此若使用单体形式的消光系数，所计算出的密度将表示每单位面积上 BAR 单体的数量。

浓度（HPC*，Alexa488）与荧光强度的线性关系图，数据分析结果。
图3：蛋白质表面密度校准示例。 测量了体相溶液中（左）和GUVs中（中）的HPC*脂质荧光强度，以及与BAR结构域结合的Alexa488在体相中的荧光强度（右）。荧光强度与浓度呈线性关系。所示测量结果基于特定的检测增益和激光输出功率。图基于参考文献37的数据生成。请点击此处查看此图的高清版本。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

拉管实验可提供关于膜的重要力学信息。在不存在与膜曲率耦合的蛋白质或其他分子的情况下，可通过将Canham-Helfrich哈密顿方程应用于从GUV中拉出的管状结构，建立膜力、管半径与膜张力之间的关系50,51

用于计算生物力学系统中力的数学公式，包含弹性常数。 （公式 1）

其中

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过从GUVs中拉出膜管的方法，可以获取关于膜-蛋白系统的丰富信息，因为该方法不仅能用于测量膜的基本力学特性，还有助于揭示蛋白质与膜曲率之间的耦合作用。如引言中所述，已有其他技术可用于测量膜弯曲蛋白的影响，例如将蛋白质与固定在钝化表面上的亚微米脂质体共同孵育18,19，或通过向微管吸吮的GUVs中注入蛋白质后观察膜管的自发形成20,21。本文所述方法不仅与内吞作用具有直接的几何关联，而且独特之处在于可同时提供系统的重要物理参数测量结果，例如蛋白质密度、膜张力和膜作用力。

该方法的一个重要局限性在于，构建和校准实验所涉及的所有组件并非易事。然而，尽管共聚焦显微镜、光镊和微操作系统的组合能够提供最丰富的信息，但根据所需获取的系统信息，某些组件可如引言中所述进行替代。成功探测一种蛋白质或任何其他潜在的曲率耦合分子的曲率耦合特性所需的最低限度组件包括一个微吸...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Benoit Sorre、Damien Cuvelier、Pierre Nassoy、François Quemeneur 和 Gil Toombes 为在本课题组建立纳米管方法所做出的重要贡献。P.B. 课题组隶属于法国国家科学研究中心（CNRS）的 CellTiss 联盟、CelTisPhyBio 实验室卓越计划（ANR-11-LABX0038）以及巴黎科学与文学大学（Paris Sciences et Lettres，ANR-10-IDEX-0001-02）。F.-C. Tsai 的研究得到了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（ALTF 1527-2014）和玛丽·居里行动计划（Marie Curie actions，H2020-MSCA-IF-2014，项目 membrane-ezrin-actin）的资助。M.S. 是西蒙斯研究员学会（Simons Society of Fellows）的青年研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti850375图3数据中使用的示例脂质
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基-聚乙二醇-2000] [DSPE-PEG(2000)-生物素]Avanti880129生物素化脂质
BODIPY-TR-C5-神经酰胺Molecular Probes (ThermoFisher)D7540荧光脂质
BODIPY-FL C5-十六酰基磷脂酰胆碱（HPC*）Molecular Probes (ThermoFisher)用于蛋白质密度校准的荧光脂质
鸡蛋L-α-磷脂酰胆碱（eggPC）Avanti840051用于校准管半径常数
牛乳β-酪蛋白（>99%）Sigma AldrichC6905用于钝化微移液管和实验腔室
蔗糖Sigma AldrichS7903
D(+)葡萄糖Sigma AldrichG7021
NaClSigma AldrichS7653
TrisSigma Aldrich10708976001
渗透压计Losern/a
铂丝，直径0.5 mm，纯度99.99%Goodfellow USAPT005139用于GUV电形成
函数发生器n/a用于产生GUV电形成所需的电流
密封腻子Vitrex (来自CML France)CRIT 140013用于密封电形成腔室
水浴超声仪n/a有助于清洁电形成腔室，但非关键
Nikon TE2000倒置显微镜，eC1共聚焦系统（Nikon），配备两条激光线（λ = 488 nm 和 543 nm）；由5 W镱光纤连续波激光器（λ > 1070 nm；IPG GmBH Germany）诱导的光镊系统一种配备光镊的共聚焦显微系统的示例
微操纵器n/a
硼硅酸盐毛细管（内径和外径分别为0.78 mm和1 mm）Harvard Apparatus30-0036
微移液管拉制仪Sutter InstrumentP-2100
微加工仪NarishigeMF-800
压电驱动器Physik Instrumenten/a
聚苯乙烯链霉亲和素包被微球（直径3.2 µm）SpherotechSVP-30-5

参考文献

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