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方法文章

从巨大单层囊泡中拉取膜纳米管

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DOI：

10.3791/56086

⸱

2017年12月7日

 ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR168, 2Department of Genetics and Complex Diseases, T. H. Chan School of Public Health, Harvard Medical School, 3Department of Cell Biology, Harvard Medical School, 4Sorbonne Universités, UPMC University Paris 06, 5Center for Studies in Physics and Biology, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞中有许多蛋白质能够感知并诱导膜曲率。本文介绍一种从脂质囊泡中拉取膜纳米管的方法，用于研究蛋白质或任何具有曲率活性的分子与弯曲膜之间的相互作用 体外.

摘要

细胞膜的重塑是许多细胞现象的重要组成部分，例如内吞作用、囊泡运输以及丝状伪足的形成 等等许多不同的蛋白质由于能够感知或诱导膜曲率而与弯曲的膜结合。通常，这些过程涉及多种蛋白质，使得在细胞内对其进行定量研究过于复杂。本文描述了一种重建弯曲膜的实验方案。 体外模拟弯曲的细胞结构，例如内吞作用颈部。使用 giant unilamellar vesicle（GUV）作为细胞膜模型，通过微管吸吮技术控制其内部压力和表面张力。利用光镊在 GUV 上施加点拉力，可形成一个高曲率的纳米管，连接于平坦的膜结构。该方法传统上用于测量脂质膜的基本力学性质，例如弯曲刚度。近年来，该技术已扩展至研究蛋白质如何与膜曲率相互作用，以及它们如何影响膜的形态与力学特性。结合微操作、显微注射、光镊与共聚焦显微镜的系统，可同时测量膜曲率、膜张力以及膜上蛋白质的表面密度。基于这些测量结果，可推断出蛋白质-膜系统多种重要的力学与形态学特性。此外，我们还提供了在生理盐浓度条件下制备 GUV 的实验方案，以及通过标记的蛋白质和脂质的荧光强度定量膜上蛋白质表面密度的方法。

引言

许多细胞过程，例如内吞作用、转运、丝状伪足的形成、感染等 等等。伴随着细胞膜形态的显著变化1,2在细胞内，多种蛋白质通过与膜结合并改变其自身形状来参与这些过程。其中最典型的例子是 Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) 蛋白家族成员，其含有一个特征性的内在弯曲的 BAR 结构域。3,4,5,6,7通常，它们通过将BAR结构域粘附到膜表面，并在许多情况下将两亲性螺旋浅插入双分子层来与膜相互作用。BAR结构域的形状、大小和电荷，以及两亲性螺旋的数量共同决定了：（1）膜曲率的方向即，无论它们会诱导膜内陷还是外凸）以及（2）膜曲率的大小5,8值得注意的是，此处正曲率定义为弯曲膜的凸面一侧， 即，朝向相互作用粒子的凸起部分为正，否则为负。此外，对BAR蛋白的定量研究表明，其对膜的影响取决于一组物理参数：蛋白质的表面密度、膜张力以及膜的形状（平坦） 与 管状的 与 球形7根据这些参数，BAR 蛋白可以：（1）作为膜曲率的感应器，（2）弯曲膜结构，或（3）诱导膜断裂7.

由于细胞中参与膜重塑的组分数量众多，研究内吞等现象的定量特征 体内 极具挑战性。 体外 重建模拟细胞中弯曲膜的最小组分，为深入理解膜曲率蛋白的作用机制提供了途径。本文介绍了一种重建膜纳米管的实验方案。 体外 使用显微操作、共聚焦显微镜和光镊技术。该方法可用于定量研究蛋白质、脂质或小分子如何与弯曲膜相互作用。脂质大单层囊泡（GUVs）被用作细胞膜模型，其曲率相对于相互作用的膜弯曲分子的尺寸可忽略不计。这些囊泡通过电形成法制备。9 其中囊泡通过在交流电（AC）作用下水合脂质膜并使其溶胀形成GUVs10最常见的用于制备GUV的基底是涂有氧化铟锡（ITO）的半导体板或铂丝（Pt-wires）。11在此项工作中，GUV 在铂丝上生长，因为与替代方法相比，该方法在缓冲液含有盐类时制备 GUV 的效果显著更优。12尽管本文已对电形成法的操作流程进行了足够详细的描述以供重复实验，但我们建议读者参考以往的文献，其中对类似及其他制备GUVs的方法已有详尽描述。13,14在我们实验室的操作中，采用铂丝进行电形成法已成功在含有约100 mM NaCl的缓冲液中，由合成脂质混合物或天然脂质提取物制备出GUVs。此外，在GUVs生长过程中还可实现蛋白质的包封。一种典型的电形成装置如图所示 图1A；它由两根长约10厘米的铂丝组成，插入一个由聚四氟乙烯（PTFE）制成的 holder 中，两侧可用玻璃盖玻片密封，盖玻片间距约为1–2厘米（图1A).

用于蛋白质分析与分离的电泳装置，配备微量移液器和光谱系统。
图1：实验装置 (A) 带有连接至铂丝的电极接头的GUV电形成腔室。B左侧：实验系统示意图，显示显微镜、物镜上方的实验腔室，以及连接在显微操作器上并插入实验腔室中的两根微玻璃针（左侧和右侧），用于管状结构拉制和蛋白质注射。右侧：安装在物镜上方的实验腔室的近距离视图，显示插入的吸液和注射微玻璃针的尖端。C) 一支注射器，其后端插入微量移液器中，并配备一个细小的分配器。底部为微量移液器内部分配器的特写图，蓝色虚线标示出微量移液器的轮廓。该系统用于向微量移液器中填充酪蛋白，以钝化玻璃表面，必要时也可用于反向填充矿物油。D用于吸取的系统 µL 蛋白溶液的用量。针头连接注射器和导管，导管再连接至注射移液毛细管。将移液毛细管尖端小心浸入蛋白溶液中，并进行抽吸，使溶液充满毛细管尖端。然后使用图C所示系统，用矿物油从后端填充移液毛细管。 请点击此处以查看此图的放大版本。

膜纳米管的半径范围从7 nm到数百nm不等，可通过外力从GUV上拉出。该方法最初设计用于测量细胞膜和囊泡的弹性性质，例如弯曲刚度。15,16在最近的多数研究中，该方法已扩展用于研究蛋白质与弯曲膜的相互作用，通过将蛋白质微量注射至拉出的纳米管附近实现。7,17. 研究膜弯曲蛋白的其他方法也已开发出来。其中一种方法是将蛋白质与固定在钝化表面上的不同尺寸脂质体共同孵育。通过共聚焦显微镜测量蛋白质结合量随脂质体直径的变化，从而反映由曲率诱导的蛋白分选效应18,19在另一种方法中，将蛋白质注射到微吸管吸附的GUV附近，以检测其自发诱导形成管状结构的能力20,21本方案所述方法特别适用于研究参与内吞作用的膜弯曲蛋白，因为在内吞过程中，大多数蛋白质通常会遇到预先形成的膜纳米管，这些纳米管连接着含有货物的膜凹陷区域与下方平坦的质膜。此外，与使用固定小脂质体的检测方法不同，本方法中的膜纳米管持续与膜相连，因此其与GUV处于力学平衡状态，这种情况符合预期 体内因此，基本的膜物理原理适用，我们可以从测量结果中推断出大量的力学性质22,23,24.

要完整实施本方法，所需的设备包括共聚焦显微镜、光镊以及一个或两个连接至水箱的微移液管（图1B）。通过结合这三种技术，可同时测量膜张力、膜曲率、膜蛋白表面密度以及纳米管受力25。微移液管抽吸是必不可少的步骤，可通过将玻璃微移液管插入连接至水箱的持针器中实现，利用静水压来控制抽吸压力26。微移液管及其持针器由显微操作仪控制，理想情况下在单一方向上使用压电驱动器以实现精确移动。为拉出纳米管，先将微抽吸的GUV短暂黏附于一个微米级小球上，然后将其拉离以形成纳米管。在此实施方案中，小球由光镊固定，光镊可依据已发表的方案构建27。也可不使用光镊而采用其他方式拉取纳米管，但会牺牲力的精确测量。若构建光阱存在困难，或无需进行力的测量（例如仅需检测蛋白质对弯曲膜的偏好性），则可使用第二个微移液管尖端抽吸的小球来拉取纳米管28。此外，也可利用重力29或流体剪切力30,31来拉取纳米管。共聚焦显微镜同样并非绝对必需，但因其可用于测量蛋白表面密度而被优先选用。它还可通过检测纳米管中脂质的荧光强度来测定纳米管半径，从而独立于膜受力与张力进行测量。当由于膜结合蛋白的存在导致相关物理量之间的关系偏离已确立的方程时，通过荧光推断纳米管半径尤为重要25。需要特别注意的是，不能同时省略光阱和共聚焦显微镜，否则将无法测量纳米管的曲率。

本方案所述方法已用于研究各种外周膜蛋白在纳米管上的曲率诱导分选，主要是BAR家族蛋白25,32,33,34还发现，呈圆锥形的跨膜钾离子通道KvAP与BAR蛋白一样，在弯曲的纳米管上富集。35通过优化将蛋白质包裹在GUVs内的方法，近期也对蛋白质与负曲率之间的相互作用进行了研究36此外，该方法已被用于阐明蛋白质支架的形成机制。25,37 并研究由线张力介导的膜断裂机制38蛋白动力蛋白39，或由 BAR 蛋白40,41除了蛋白质外，小分子或离子也能诱导膜曲率。利用该方法，在无盐条件下证实钙离子可诱导正曲率。42有趣的是，已有研究表明，脂质也能发生曲率分选，但仅限于接近相分离临界点的组分。43,44总之，该方法可供致力于研究整膜组分如何发挥作用的研究人员使用（例如，脂质或跨膜蛋白）或外周结合分子（位于GUV内部或外部）从力学和定量角度与柱面曲率膜的相互作用。也适用于对测量膜本身力学性质感兴趣的研究者22,23,45.

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方案

1. 在铂丝上通过电场形成法制备大单层囊泡

  1. 使用乙醇或丙酮等有机溶剂清洗电形成室（参见引言和图1A）及铂丝，以去除脂质，再用水清洗以去除盐分。
    注意：建议先用浸有乙醇的擦拭纸彻底擦去残留物，然后依次在丙酮、乙醇和水中各超声处理5分钟。
  2. 将所需组成的脂质混合物溶于氯仿中，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。该混合物应包含约0.05%摩尔分数的生物素偶联脂质（例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基（聚乙二醇）-2000]）和约0.5%摩尔分数的荧光染料偶联脂质（例如，BODIPY-TR-C5-神经酰胺）。
    注意：根据我们的经验，当带电脂质含量超过30%时，难以高效制备GUVs。
    警告：氯仿应在通风橱内操作，并佩戴适当的手套。
  3. 将一对铂丝插入电形成室中。将脂质混合液以液滴形式点样在铂丝上，液滴间距约为2–3 mm（总共约4 µL）。
  4. 在室温下将铂丝置于真空环境中干燥30–60分钟。
  5. 用硅脂将盖玻片粘附于电形成室底部以密封。向室内加入含有NaCl、蔗糖和缓冲剂的缓冲溶液（例如，70 mM NaCl、100 mM蔗糖和10 mM Tris，pH 7.4）。该介质将在实验中位于GUVs内部。确保该介质的渗透压与实验介质的渗透压相差不超过约10%。使用蔗糖调节渗透压。若目标是将蛋白质包封入GUVs中，则在此溶液中加入所需浓度的蛋白质。
    警告：缓冲液中的各种盐类和糖类可能影响膜的弯曲刚度和自发曲率24,42,46,47。
  6. 用硅脂将另一盖玻片粘附于电形成室顶部，确保腔室内空气尽可能少。在铂丝上施加频率为500 Hz、电压为280 mV的正弦交流电流。
    注意：生长时间和温度需根据脂质组成和蛋白质的敏感性进行优化。当使用天然脂质提取物或在GUVs中包封蛋白质时，最佳产率通常通过在4 °C下过夜生长获得。若无蛋白质存在且使用合成脂质组成，则在室温下生长约2小时即可。

2. 实验室用实验腔室和微移液管的制备

  1. 为制备微移液管，使用移液管拉制仪拉制玻璃毛细管。建议使用内径和外径分别为0.7 mm和1 mm的玻璃毛细管。随后，修整微移液管尖端，使其内径为5–7 µm，使用显微拉针仪制备。若实验中需注射蛋白质或其他分子，则另拉一根微针，并将其尖端修整至内径为8–15 µm.
  2. 通过将两片矩形显微镜盖玻片放置于金属基底上，构建一个实验腔室，如图所示 图1盖玻片之间应相隔约 1 mm。腔室的长边应有开口（参见 图1）。开口的一侧应与微量移液器吸头相匹配，吸头需至少伸入计数室中心位置。
  3. 配制实验缓冲液，其渗透压与用于生长GUVs的缓冲液相比差异不应超过10%。使用葡萄糖调节渗透压。例如，在研究内陷蛋白（endophilin）与纳米管相互作用时所用的一种实验缓冲液成分为100 mM NaCl、40 mM葡萄糖，用Tris缓冲至pH 7.4。采用腔内蔗糖/腔外葡萄糖的组合可实现：（a）提供足够的相位对比度，以便通过明场显微镜观察GUVs；（b）使GUVs内部密度更高，从而沉降到样品腔底部。根据实验需求调整盐浓度。
    注意：除了影响膜的机械性能外，根据我们的经验，高葡萄糖浓度（> 300 mM）会负面影响链霉亲和素-生物素键的形成，而该键是拉动纳米管所必需的。此外，盐浓度过低会抑制链霉亲和素-生物素结合，而过高浓度则会屏蔽蛋白质与膜之间的相互作用。在蛋白质包封的情况下，若在外层缓冲液中使用极高的盐浓度（例如, >200 mM NaCl）可用于作为一种技巧，使蛋白质从外层叶脱离36有必要通过实验测试一系列盐浓度，以确定目标分子的最佳结合条件。
  4. 实验前30–60分钟，在收集GUVs之前，用5 mg/mL的高纯度β-酪蛋白溶液填充实验腔室和吸液微管，以对玻璃表面进行钝化处理例如，溶于实验缓冲液中）。β-酪蛋白可在玻璃表面形成一层保护层，防止GUVs过度黏附，从而避免其破裂。用β-酪蛋白孵育30–60分钟。
    注意：微量移液器内部不应有气泡，以免干扰膜张力的控制。
    1. 用于填充微量移液器的分配器制作方法：将注射器针头在靠近塑料接头处折断，并将一根细硅酸盐毛细管（例如液相色谱所用毛细管）插入并粘接于其中图1C).
  5. 孵育β-酪蛋白期间，将腔室安装到显微镜上，并使其位于物镜正上方中央位置。将吸液微管的尖端从长边的开口插入，并移至显微镜物镜上方。调节水箱液面高度，使吸液压力接近零（在显微镜下观察，微管内应无明显液体流入或流出）。
  6. 如果实验过程中需要注射蛋白质或其他分子，请将目标分子溶解于实验缓冲液中，配制成所需浓度，注入注射用微毛细管内，将微毛细管安装至显微操作仪上，并从实验腔室的对侧插入。
    1. 为使用最少的蛋白用量，仅需通过吸液方式将蛋白吸入微量移液器的尖端。操作时，用塑料管包裹连接注射器的针头末端，并将塑料管插入注射用微量移液器的后端。
    2. 非常小心地将微量移液器的尖端浸入蛋白质溶液中，并吸取溶液以充满移液器尖端。
      注意：此简单装置如图所示 图1D 并且，根据我们的经验，它能够从极少的量（仅几微升）进行吸液 µL 蛋白质溶液
    3. 用矿物油填充注射微量移液管的其余部分，以防止蛋白质溶液与水箱中的水混合（使用该装置中的设置） 图1C).
    4. 注意避免将气泡引入注射移液管中，因为气泡会导致注射压力不稳定。或者，如果蛋白量充足，可按照步骤2.4中填充β-酪蛋白的方法，以相同方式用蛋白溶液填充微量移液管。调节水箱液面高度，以最小化注射移液管中的吸液压力。
      注意：由于稀释作用，注入的分子或离子在纳米管附近的浓度会降低，可通过测量距移液管出口不同距离处荧光强度的减弱程度来估算该浓度变化42然而，了解所注射分子在双分子层中的结合密度更为重要，该密度可被精确测量（见第4节）。
  7. 孵育β-酪蛋白后，移除室内的溶液，并用实验缓冲液冲洗数次。随后加入实验缓冲液。
  8. 停止GUVs的电形成，并直接从Pt丝上收集GUVs。向实验腔中加入数µL的GUVs溶液。仅使用新鲜制备的GUVs。
  9. 添加少量 µL 链霉亲和素包被的微珠加入实验腔室，使腔室中微珠的终浓度约为 0.1 x 10−3 %（w/v）或更低。聚苯乙烯微球 ~3 µm 建议使用直径约为（在水中，聚苯乙烯微球相对于光镊中的散射力而言，能实现梯度力最大化的近似最优折射率对比）。微球浓度可根据具体实验进行调整：浓度过低会导致在样品腔内难以找到微球，而浓度过高则可能使多个微球同时进入光镊区域。

3. 从GUV中拉出膜纳米管

  1. 让GUVs和微珠沉降到腔室底部。通过让少量实验缓冲液蒸发约15分钟，使GUVs去膨胀。去膨胀GUVs对于产生可被微移液管吸入的多余表面积至关重要。GUVs应出现明显的波动（即在光学显微镜下观察呈松软状态）。若细胞仍呈紧张状态，则需延长蒸发时间。
    注意：渗透压变化速率取决于蒸发表面积和温度， 等等。，并应密切监测。原则上，可通过调整蔗糖/葡萄糖浓度从实验开始时设定渗透压差，但需注意避免引起渗透冲击。
  2. 找到一个柔软的GUV，并将其吸入移液管中。吸吮舌长度（膜在移液管内的部分）应等于或大于移液管半径，以便适用于理论分析。15,16,22,23 (图2）。尝试多个GUV。如果无法吸入GUV以形成足够长的舌状突起，则等待数分钟。若GUV足够柔软，继续下一步操作。
  3. 用矿物油密封腔室，以防止缓冲液进一步蒸发。操作时，沿实验腔室的开放边缘小心地用移液器加入矿物油。
  4. 为设定吸液压力的零点位置，首先在样品室中寻找一个微珠，并将吸液移液管的出口置于微珠附近。调节水箱的高度，使微珠既不被吸入移液管，也不被吹离。尽管矿物油可防止蒸发，从而避免样品室内产生进一步的压力变化，但仍需在每次测量GUV之前重新校准吸液压力的零点。
  5. 找到一个GUV并将其吸入。将微移液管向上移动并移出焦平面（以使GUV远离表面，避免在移动腔室时因剪切应力导致GUV被从移液管中拉出）。
  6. 通过缓慢移动观察腔室，寻找脂质体。突然的移动可能导致 giant unilamellar vesicle（GUV）被推出。使用光镊在约一定距离处将其捕获 20 µm 远离腔室底部。确保目标区域干净，视野中无其他微珠或膜结构。除微珠外，任何进入光镊区域的物体都会干扰测量。
  7. 将GUV重新移回焦点，并用微移液管将其从珠子处移开，微移液管需与光镊对齐（图2).
  8. 记录微珠的运动1–2分钟，以测量其平衡位置（用于力的测量）。
  9. 尽可能降低微移液管内的压力，但避免丢失 giant unilamellar vesicle（GUV），以减小膜张力。小心地将 GUV 与微珠接触约一秒钟，形成链霉亲和素-生物素键，然后轻柔回拉以形成纳米管。理想情况下，GUV 向微珠靠近或远离的运动应通过压电驱动器完成，以最大程度减少对光镊中微珠的扰动。
    注意：如果纳米管未形成，可能是由于磁珠上的链霉亲和素包被效果不佳、GUV 中生物素化脂质含量不足、实验缓冲液中盐浓度过低或葡萄糖浓度过高，或 GUV 的膜张力过高所致。48.
  10. 增加吸液压力以重新形成吸液尖端。将导管与吸液移液管的轴线对齐，并尽可能聚焦于导管图2).
  11. 确保 GUV 赤道面与管状结构处于焦平面。使用明场显微镜记录微珠运动数分钟（此处相机采集速率为 30 Hz）。记录高度， h水箱相对于零位的位置。对该系统拍摄几张共聚焦图像（图2).
  12. 在不同的吸液压力（即隐含的膜张力）下重复上一步操作。典型的张力范围为0.015–0.2 mN/m，步长约为0.02 mN/m。
  13. 若在系统附近注射蛋白质或分子，需将注射微移液管移至纳米管附近，确保光镊中的微珠不受干扰。以约1–2 Pa的压力轻轻注射。
  14. 在蛋白质结合达到平衡后（注入的蛋白质在GUV膜上的荧光强度保持恒定），重复对裸膜进行的逐步测量步骤（步骤3.11和3.12）。
    注意：由于在恒定压力下将蛋白质注入GUV附近进行测量，GUV附近的蛋白质本体浓度基本保持不变；因此，在测量过程中蛋白质解吸可忽略不计。
    1. 或者，可以在进行拉管实验之前将GUVs与蛋白质共同孵育，以确保蛋白质在体相中的浓度恒定。由于测量的是蛋白质在膜管与GUV膜上的相对分布比例，因此蛋白质的添加方式不会影响曲率分选的计算结果（见第4节）。

光镊实验示意图及结果；展示光谱装置中脂质囊泡所受的力 F。
图 2：膜管拉伸实验。（A）实验示意图。（B）按照本方案描述所拉出的膜管的共聚焦图像。比例尺 = 2 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 测量与数据分析

  1. 测量膜张力
    1. 在恒定抽吸压力下，计算每一步的静水压力：
      ΔP = pgh
      其中 p 是水的密度， g 重力加速度，以及 h 步骤3.11中水箱的高度
    2. 从共聚焦图像中测量GUV的半径， rGUV以及吸液管的半径， r移液器 (图2).
    3. 使用拉普拉斯方程计算膜张力 σ49:
      表面张力公式：σ = ΔP (rpip/2(1-rpip/rGUV))，用于描述压力差的方程。
  2. 测量膜张力
    1. 测定光镊的刚度 k，通过使用多种校准方法之一27在此装置中，测量 k 使用黏性阻力法27.
    2. 计算微珠的平衡位置， a0，取拉动导管前测量值的平均值（步骤 3.8）。
    3. 对于每次恒定张力测量，计算平衡膜力， F，来自胡克定律：
      F = k(a - a0)
      其中 a 是该测量过程中珠子的平均位置。
  3. 测量管半径
    1. 对于裸膜（未添加膜弯曲分子）的情况，计算膜管半径， R，由力可得：
      R = F/(4πσ)
      （参考文献22,23).
    2. 为了在存在膜弯曲分子的情况下测量管径，并独立于步骤 4.3.1，首先沿管状结构的长度记录脂质荧光强度， I管，以及沿GUV轮廓， IGUV测量膜内或膜结合荧光团的平均荧光强度，方法是沿管状结构或GUV轮廓最亮线条的平均强度进行测定。选择一个包含GUV轮廓或管状结构水平截面的矩形框，计算框内每条水平线荧光强度的总和。
      1. 将每个总和除以水平线的像素数量（即，方框的宽度）。注意所选方框内不应存在其他膜结构。获取沿所选方框长度方向的荧光强度分布曲线。
      2. 扣除背景强度后，取最亮线条的平均像素荧光强度。管状结构的半径与沿管轮廓和GUV的荧光强度比值呈线性关系，公式如下：
        R = K管I管/IGUV
        其中 K管 是一个校准因子25.
        注意：该方法可用于测量10–80 nm范围内的管径（当管径足够窄，可完全位于一个共聚焦体素宽度内时），在80 nm及以上范围内测量不确定性略大。测量灵敏度取决于实验装置。
    3. 确定 K管 通过在仅含不带电荷脂质的简单膜组分上，按照步骤4.3.1和4.3.2进行独立的半径测量。此类简单的膜组分可确保半径与力之间具有步骤4.3.1中给出的简单关系。重复实验多次，并绘制图表 R，根据力（步骤 4.3.1）与 I管/IGUV （步骤 4.3.2）。计算 K管 来自拟合结果。在此设置中， K管 使用卵磷脂L-α-磷脂酰胆碱（egg-PC）膜和一种荧光几乎不受偏振影响的荧光脂质，粒径为200 ± 50 nm25.
      注意： K管 由于不同物镜的共焦体素体积不同，必须针对不同物镜进行测量。所用脂质荧光探针不应与注射的蛋白质/分子发生相互作用。本文推荐使用的荧光脂质BODIPY TR ceramide预期不会与蛋白质发生相互作用，此前关于BAR和I-BAR结构域的研究已证实了这一假设。25,36,37，这表明在蛋白质表面覆盖率较高时，管状结构的半径由蛋白质决定，而与GUV中的张力无关。如果蛋白质与脂质荧光染料发生相互作用，则在不同的高蛋白质表面分数下，会在管状结构中观察到荧光染料的耗尽或富集现象。
  4. 测量蛋白质的表面密度
    1. 使用一种简单的非带电脂质制备脂质混合物例如，卵磷脂）并添加约五种不同摩尔分数的荧光脂质（其发射波长与用于标记蛋白质的染料相同， 例如，BODIPY-FL C5-十六酰基磷脂酰胆碱（HPC*）用于 例如，Alexa488 标记的蛋白质）在以下范围内：XHPC* = 0.01–1%。通过在ITO板上进行电形成法，在100 mM蔗糖溶液中制备GUVs（参照先前发表文献的步骤1）13).
    2. 收集GUVs并转移至经β-酪蛋白钝化的实验腔室中。使用 例如，实验溶液中含100 mM葡萄糖。等待数分钟，使GUVs沉降。
    3. 拍摄GUVs的共聚焦荧光图像，并记录GUVs轮廓上平均荧光强度随荧光脂质摩尔分数的变化（见步骤4.3.2）。针对每种组分，计算荧光脂质的面积密度φHPC*例如，假设每个脂质分子所占面积为0.7 nm²2，φHPC* = 1.43 × 106 XHPC* 每片小叶。在GUV中绘制HPC*荧光强度I高通量筛选*, 巨型脂质体, 与 φHPC*拟合得到校准常数， A，由 φ 给出HPC* = 人工智能高通量筛选*, 巨型脂质体. A 取决于显微镜设置，例如激光功率和探测器灵敏度（即，增益），因此记录 A 针对各种常用的显微镜设置（参见示例） 图3).
    4. 配制多种将HPC*溶解于去垢剂中的溶液， 例如十二烷基硫酸钠（SDS），在约1至10的浓度范围内不同浓度下50 µM记录每种溶液的整体荧光强度，并计算强度的斜率 与 浓度（图3）。以将要与蛋白质偶联的荧光染料在相似的浓度范围内重复测量（参见Alexa488的示例 图3）。该测量用于关联蛋白质标记物和脂质标记物的荧光强度， IA488，大量 / IHPC*，大量因为它们在相同的总体浓度下未必会以相同的方式发光。
    5. 使用荧光分光光度计测量每个蛋白质分子上的荧光团数量。例如，对于Alexa488，测定每个蛋白质分子所结合的Alexa488分子数量， nA488，可使用以下关系式计算：
      nA488 = (A494/εA488)/((A280 - 0.11A494) / ε蛋白)
      其中 A494 和 A280 分别为在 494 nm 和 280 nm 处单位长度的吸光度值，εA488 和 ε蛋白 分别为 Alexa488 和蛋白质的分子吸收系数。
    6. 计算GUV上蛋白质的表面密度φ蛋白，巨型脂质体，根据以下公式：
      Φprot,GUV 的平衡方程；荧光强度分析
      请注意蛋白质的聚合状态。例如，BAR 蛋白会形成二聚体，因此若使用单体形式的消光系数，所计算出的密度将表示每单位面积内 BAR 单体的数量。

线性相关图；荧光强度与浓度；蛋白质测定中的数据分析。
图3：蛋白质表面密度校准示例。测量了体相中（左）和GUVs中（中）的HPC*脂质荧光强度，以及与BAR结构域结合的Alexa488的体相荧光强度（右）。荧光强度与浓度呈线性关系。所示测量值基于特定的检测增益和激光输出功率。图表根据参考文献37的数据生成。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

拉管实验可提供关于膜的重要力学信息。在不存在与膜曲率耦合的蛋白质或其他分子的情况下，可通过将Canham-Helfrich哈密顿方程应用于从GUV中拉出的管状结构，建立膜力、管半径与膜张力之间的关系50,51

力平衡方程，\( \mathscr{F} = \frac{\kappa}{2} \left( \frac{1}{r} - \frac{1}{R_0} \right)^2 A + \sigma A - f L \) 公式。 （方程 1）

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讨论

通过从GUVs中拉出膜管的方法，可以获取关于膜-蛋白系统的丰富信息，因为该方法不仅能用于测量膜的基本力学特性，还有助于揭示蛋白质与膜曲率之间的耦合作用。如引言中所述，已有其他技术可用于测量膜弯曲蛋白的影响，例如将蛋白质与固定在钝化表面上的亚微米脂质体共同孵育18,19，或通过向微管吸吮的GUVs中注入蛋白质后观察膜管的自发形成20,21。本文所述方法不仅与内吞作用具有直接的几何关联，而且独特之处在于可同时提供系统的重要物理参数测量结果，例如蛋白质密度、膜张力和膜作用力。

该方法的一个重要局限性在于，构建和校准实验所涉及的所有组件并非易事。然而，尽管共聚焦显微镜、光镊和微操作系统的组合能够提供最丰富的信息，但根据所需获取的系统信息，某些组件可如引言中所述进行替代。成功探测一种蛋白质或任何其他潜在的曲率耦合分子的曲率耦合特性所需的最低限度组件包括一个微吸...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Benoit Sorre、Damien Cuvelier、Pierre Nassoy、François Quemeneur 和 Gil Toombes 为在本课题组建立纳米管方法所做出的重要贡献。P.B. 课题组隶属于法国国家科学研究中心（CNRS）的 CellTiss 联盟、CelTisPhyBio 实验室卓越计划（ANR-11-LABX0038）以及巴黎科学与文学大学（Paris Sciences et Lettres，ANR-10-IDEX-0001-02）。F.-C. Tsai 的研究得到了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（ALTF 1527-2014）和玛丽·居里行动计划（Marie Curie actions，H2020-MSCA-IF-2014，项目 membrane-ezrin-actin）的资助。M.S. 是西蒙斯研究员学会（Simons Society of Fellows）的青年研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti850375图3数据中使用的示例脂质
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基-聚乙二醇-2000] [DSPE-PEG(2000)-生物素]Avanti880129生物素化脂质
BODIPY-TR-C5-神经酰胺Molecular Probes (ThermoFisher)D7540荧光脂质
BODIPY-FL C5-十六酰基磷脂酰胆碱（HPC*）Molecular Probes (ThermoFisher)用于蛋白质密度校准的荧光脂质
鸡蛋L-α-磷脂酰胆碱（eggPC）Avanti840051用于校准管半径常数
牛乳β-酪蛋白（>99%）Sigma AldrichC6905用于钝化微移液管和实验腔室
蔗糖Sigma AldrichS7903
D(+)葡萄糖Sigma AldrichG7021
NaClSigma AldrichS7653
TrisSigma Aldrich10708976001
渗透压计Losern/a
铂丝，直径0.5 mm，纯度99.99%Goodfellow USAPT005139用于GUV电形成
函数发生器n/a用于产生GUV电形成所需的电流
密封腻子Vitrex (来自CML France)CRIT 140013用于密封电形成腔室
水浴超声仪n/a有助于清洁电形成腔室，但非关键
Nikon TE2000倒置显微镜，eC1共聚焦系统（Nikon），配备两条激光线（λ = 488 nm 和 543 nm）；由5 W镱光纤连续波激光器（λ > 1070 nm；IPG GmBH Germany）诱导的光镊系统一种配备光镊的共聚焦显微系统的示例
微操纵器n/a
硼硅酸盐毛细管（内径和外径分别为0.78 mm和1 mm）Harvard Apparatus30-0036
微移液管拉制仪Sutter InstrumentP-2100
微加工仪NarishigeMF-800
压电驱动器Physik Instrumenten/a
聚苯乙烯链霉亲和素包被微球（直径3.2 µm）SpherotechSVP-30-5

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