共聚焦成像观察神经肽Y-pHluorin：一种用于完整小鼠和人类胰岛中胰岛素颗粒胞吐可视化技术

摘要

我们描述了一种利用pH敏感性绿色荧光蛋白pHluorin对完整胰岛中胰岛素胞吐作用进行可视化观察的实验方案。分离的胰岛被感染携带编码pHluorin的腺病毒，该pHluorin与囊泡 cargo 神经肽Y相偶联。由此可通过共聚焦显微镜检测胰岛素颗粒的融合事件。

摘要

在正常生理条件和疾病状态下，胰岛素分泌在葡萄糖稳态调节中起着核心作用。目前研究胰岛素颗粒胞吐作用的方法主要依赖于膜片钳电生理技术，或结合荧光报告分子表达的显微成像技术。然而，这些技术大多针对克隆细胞系优化，或需要将胰岛解离成单个细胞。相比之下，本文所介绍的方法能够在完整的胰岛组织中实时观察胰岛素颗粒的胞吐过程。在本实验方案中，我们首先描述了利用编码pH敏感性绿色荧光蛋白（GFP）pHluorin与神经肽Y（NPY）融合蛋白的腺病毒对分离的小鼠或人胰岛进行病毒感染的步骤；其次，描述了病毒感染后第五天进行共聚焦显微成像的方法，以及如何监测胰岛素颗粒的分泌过程。简言之，将感染后的胰岛置于成像腔室的盖玻片上，在直立式激光扫描共聚焦显微镜下，持续灌注含有不同刺激物的细胞外溶液，同时进行实时成像。使用高速共振扫描器对胰岛约50 µm深度范围内的区域进行时间序列图像采集。通过该方法可动态追踪胰岛素颗粒与细胞质膜的融合过程。本方法还可在单次实验中测试多种刺激因素，适用于小鼠和人胰岛，并可与多种功能染料联合使用（例如，膜电位或胞质钙离子染料）。

引言

胰岛素由胰岛β细胞产生，是葡萄糖代谢的关键调节因子¹。β细胞的死亡或功能障碍会破坏葡萄糖稳态，导致糖尿病的发生²。胰岛素被包裹在致密核心颗粒中，并以依赖Ca²⁺的方式释放³。阐明胰岛素颗粒胞吐作用的调控机制，对于全面理解胰岛素分泌的决定因素至关重要，并为发现治疗糖尿病的新治疗靶点提供了新的途径。

胰岛素胞吐作用已通过电生理学方法（如膜电容测量）以及结合荧光分子的显微成像技术得到广泛研究。膜电容测量具有良好的时间分辨率，可实现单细胞记录。然而，电容的变化反映的是细胞膜表面积的净变化，无法捕捉单个融合事件，也不能区分胰岛素颗粒融合与其他非胰岛素分泌囊泡的融合³。显微成像技术，如结合荧光探针和囊泡内容物蛋白的双光子显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜，可提供更详细的观察信息。这些技术能够记录单个胞吐事件以及胞吐前和胞吐后的各个阶段，并可用于研究细胞群体中的胞吐模式³。

荧光报告分子可分为三种类型：1）细胞外报告分子，2）细胞质报告分子，或 3）囊泡内报告分子。1）细胞外报告分子为极性示踪剂（例如，葡聚糖、磺基罗丹明B（SRB）、荧光黄、吡喃宁），可通....

方案

迈阿密大学动物伦理委员会已批准所有实验。

1. 完整分离的人或小鼠胰岛的病毒感染

1. 胰岛培养：配制胰岛培养基：CMRL 1066 培养基，含 10% (v/v) 胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。
   1. 人胰腺胰岛来自美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK, NIH）的整合胰岛分配计划（Integrated Islet Distribution Program）。收到胰岛后，将约 500 个胰岛当量（islet equivalents）转移至 35 mm 非组织培养处理的培养皿中，加入 2 mL CMRL 培养基，在 37 °C、5%/95% CO₂/O₂ 条件下培养 24 小时，之后进行病毒感染。
   2. 小鼠胰腺胰岛可通过先前建立的方案进行分离¹⁶。分离后，将约 200 个胰岛当量置于 35 mm 非组织培养处理的培养皿中，加入 2 mL CMRL 培养基，在 37 °C、5%/95% CO₂/O₂ 条件下培养 24 小时，之后进行病毒感染。
      注意：避免使用在胰岛中表达 GFP 或 YFP 报告基因的转基因小鼠，以防与 NPY-pHluorin 的荧光信号重叠。
2. 病毒制备
   注意：NPY-....

结果

该技术的完整工作流程如图1所示。简言之，可将小鼠或人胰岛用编码NPY-pHluorin的腺病毒进行感染，并在培养数天后，通过共聚焦显微镜进行成像观察。当分泌颗粒与细胞膜融合并打开时，可观察到荧光信号增强，并可对其进行定量分析（图1）。为了验证NPY-pHluorin是否确实是监测胰岛素颗粒动态的合适工具，对感染后的胰岛使用抗GFP抗体以及针对不同胰岛激素（胰岛素、生长抑素或胰高血糖素）的抗体进行免疫染色。大多数表达NPY-pHluorin（GFP阳性）的细胞为β细胞，因其同时表达胰岛素（约90%；图2A、2B）。仅有少数胰高血糖素阳性的α细胞或生长抑素阳性的δ细胞呈GFP标记阳性（图2B）。重要的是，在感染细胞中，NPY融合蛋白与胰岛素共定位（GFP与胰岛素的Pearson相关系数为0.61 ± 0.0.......

讨论

本文描述了一种利用共聚焦显微镜在完整的胰岛内可视化β细胞中胰岛素颗粒胞吐作用的技术。该技术采用NPY-pHluorin作为荧光报告分子，并将其克隆至腺病毒中，以确保高效的转染效率。

尽管该方法在我们手中效率很高，但可能需要进行一些修改，这些修改主要取决于两个参数：1）胰岛制备的质量，以及2）病毒原液的滴度及感染条件的优化。在对胰岛进行病毒感染之前，应将胰岛制备物在37 °C下过夜恢复，以缓解分离和运输过程带来的应激。在整个感染/表达期间，需在光学显微镜下观察胰岛形态，并检查细胞活力下降的迹象，例如细胞从胰岛表面突出，或胰岛中心出现缺氧细胞（颜色较深的细胞）¹⁸。每批病毒原液的滴度和感染效率可能有所不同。务必根据病毒滴度以及显微检测前的培养时间调整所用病毒的体积。最关键的步骤是优化感染条件（例如，病毒颗粒数量、检测前的培养时间），以确保报告基因充分表达，同时维持胰岛的完整性和功能响应性。在优化感染方案以及每次使用新的病毒批次时，应在不同时间点收集少量胰岛，检测是否可通过KCl（30 mM）和/或高浓度葡萄糖（16 mM.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直立式激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS-SP5	包含图像采集软件 LAS AF
成像腔室	Warner instruments	RC-26
成像腔室平台	Warner instruments	PH-1
22 × 40 玻璃盖玻片	Daiggerbrand	G15972H
真空硅脂	Sigma	Z273554-1EA
多通道灌流系统	Warner instruments	VC-8
单通道串联溶液加热器	Warner instruments	SH-27B
温度控制器	Warner instruments	TC-324C
蠕动式吸液泵	Pharmacia	P-1
35 mm 培养皿，非组织培养处理	VWR	10861-586
CMRL 培养基，不含谷氨酰胺	ThermoFisher	11530037
FBS，热灭活	ThermoFisher	16140071
L-谷氨酰胺 200 mM	ThermoFisher	25030081
5 M NaCl 溶液	Sigma	S5150
3 M KCl 溶液	Sigma	60135
1 M CaCl2 溶液	Sigma	21115
1 M MgCl2 溶液	Sigma	M1028
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
1 M HEPES 溶液	Sigma	H0887
真空滤器	VWR	431098
D-葡萄糖	Sigma	G8270
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-aldrich	P6407
Di-8-ANNEP	ThermoFisher	D3167
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）	Sigma	I5879
佛司可林	Sigma	F3917