体外 大鼠结肠传入纤维电生理特性的表征

摘要

异常感觉功能是功能性及炎症性肠病内脏疼痛及其他症状的基础。一种用于结肠传入神经电生理记录的方案 离体 大鼠结肠和直肠的制备方法在此展示。

摘要

结肠感觉神经功能障碍已被认为与多种常见疾病的病理生理过程相关，包括功能性肠病、炎症性肠病以及糖尿病。本文中，我们描述了一种实验方案，用于 体外 大鼠结肠传入神经电生理特性的表征。将带有完整盆腔神经节（PG）的结直肠组织从大鼠体内取出，置于记录 chamber 中并用含碳合气的克雷布斯（Krebs）溶液持续灌流，于口腔端和肛门端进行插管，以实现扩张刺激。自 PG 发出的细小神经束被识别后，使用吸电极记录多单位传入神经放电活动。结肠节段扩张可诱发多单位放电活动逐渐增加。通过主成分分析对低阈值、高阈值及宽动态范围的传入纤维进行区分。可通过浴式或管腔内给予测试化合物，研究结肠传入神经的化学敏感性。该实验方案可经修改后应用于其他物种，如小鼠和豚鼠，并可用于研究正常与病理状态下降结肠胸腰段/腹下神经与腰骶段/盆腔传入神经电生理特性的差异。

引言

胃肠道（GIT）受到丰富的外来传入神经支配，这些神经将来自肠道的感觉信号传递至中枢神经系统，参与肠-脑相互作用。这些外来传入神经的兴奋性改变以及中枢对传入信号处理的异常，是内脏疼痛及多种胃肠道疾病（包括功能性及炎症性肠病）症状的基础¹。来自结肠和直肠的感觉信息主要通过胸腰段/下腹神经以及腰骶段/盆神经（PN）传递²。近年来，研究者日益关注在啮齿类动物疾病模型中研究这些初级传入纤维的电生理特性。然而，对啮齿类动物结肠传入神经进行体内电生理记录是一项技术挑战，需要较高的外科操作技能。此外，血流动力学变化、组织运动以及麻醉药物也可能影响体内神经活动及其对测试刺激的敏感性。因此，近年来越来越多的研究采用体外（离体）制备方法，利用包括小鼠、大鼠、豚鼠以及人类在内的不同物种，来探究结肠传入神经感觉转导的机制以及疾病状态下兴奋性的改变^3,4,5,6,7,8

两种类型 离体 结肠准备方法已有报道：主要的 "平板式" 制备^5,9,10 以及 "管" 制备^3,4. 一种视频实验方案，用于 "平板式" 小鼠结直肠组织制备方法已有文献报道¹¹在本方案中，将附有盆神经（PN）或腰内脏神经（LSN）的小鼠结直肠组织取出，并置于组织浴槽中进行灌流。结直肠沿纵轴切开，神经束被引出并延伸至充满石蜡油的记录室。使用单极铂铱电极记录神经活动。该方案可通过无偏倚的电刺激识别单个传入纤维的感受野，同时可精确定位化学刺激的应用部位，以及实施不同类型的机械刺激范式例如， 局部黏膜探查和环向牵拉）传递至传入神经末梢。由于神经需从组织腔延伸至另一个独立的腔室，因此必须保持所连神经相对较长；对于初次使用该方法的研究人员而言，成功分离神经具有较大挑战性。最近，Nullens 等 发表了一项关于的视频实验方案 体外 记录小鼠空肠和结肠段的肠系膜传入神经活动¹². 在此 "管" 准备过程中，保留附着肠系膜的肠段完整，从而允许对肠腔进行梯度扩张以及腔内和腔外给予不同化学物质。由于肠系膜神经采用吸吮电极记录，该电极可紧贴组织放置，因此即使肠系膜神经相对较短，仍可记录到传入活动。然而，肠系膜神经由混合性的迷走神经和脊髓传入纤维组成，支配空肠或胸腰段下腹神经；而支配结直肠的腰骶段盆神经传入纤维则无法在本方案中被区分。本文中，我们提供了一种利用该方法记录大鼠结肠传入神经电生理活动的详细方案 "管" 保留完整盆神经丛的结直肠制备。该方法可用于表征腰内脏神经（下腹神经）和腰骶盆神经传入纤维的功能特性。

方案

本实验方案已获得上海交通大学医学院动物伦理委员会批准（# SYXK2013-0050）。 对于熟练掌握该技术的操作者而言，完整分离结肠直肠并保留神经节和神经干至少需要15分钟。因此，在解剖过程中必须保持动物存活但处于深度麻醉状态，以确保组织在后续电生理记录中的活性。

1. 灌注液和测试化合物的制备

1. 配制 5 L 克雷布斯（Krebs）溶液：113 mM NaCl、5.9 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO₄、1.2 mM MgSO₄、25 mM NaHCO₃、1.2 mM CaCl₂ 和 11.5 mM 葡萄糖。用 95% O₂ + 5% CO₂ 混合气体饱和该溶液。将约 500 mL 氧合克雷布斯溶液预先在冰箱中冷却。
2. 根据需要配制储备测试化合物分装液（1 mM 辣椒素溶于乙醇，10 mM 5-羟色胺（5-HT）溶于生理盐水）。在使用前，将储备液用克雷布斯溶液稀释至终浓度（用于浴槽给药），或用生理盐水稀释（用于管腔内给药）。

2. 记录电极的制备

1. 使用常规电极拉制仪从无内丝的标准玻璃管（外径1.5 mm）中拉制记录电极。调整拉制仪的加热和拉伸参数，使拉制后电极的电极杆长度在20至25 mm之间。

3. 组织采集

1. 使用戊巴比妥钠（80 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行深度麻醉。 
2. 在保证无菌条件下，使用手术刀沿腹壁正中线做切口，打开腹腔。将肠系膜及其他组织拨开，暴露结肠和直肠。
3. 将动物置于解剖显微镜下。通过精细解剖，找到左侧颈上神经节（PG），并辨认出与其相连的颈神经（PN）和外侧脊神经（LSN）。在距离左侧颈上神经节几毫米处切断这些神经。
   注意：前列腺神经节（PG）位于结肠直肠交界处附近。通常有3 - 4条来自腰骶部脊髓的盆神经（PN）以及一条腹下神经（LSN）投射至PG。图1).
4. 切开耻骨联合以暴露直肠。清除周围组织（即， 膀胱 等等。在直肠上方操作时需小心，保留前列腺神经丛（PG）的完整性。
5. 通过静脉注射过量戊巴比妥处死大鼠。在距肛管约3 cm处横断结肠，使用镊子将直肠结肠组织从动物体内取出。
6. 将结直肠转移至盛有预冷克雷布斯液的培养皿中。用预冷的克雷布斯液轻轻冲洗结肠，去除粪便。仔细去除残留的膀胱及其他组织，注意不要损伤盆神经节（PG）。

4. 结肠传入神经的解剖分离

1. 将结肠放入记录室（20 mL）中，并持续用含碳合气的克雷布斯（Krebs）溶液灌流组织，灌流速度设定为 15 mL/min。
2. 在口腔端和肛门端对结肠直肠进行插管。以 10 mL/h 的流速从口腔向肛门方向开始结肠的腔内灌注生理盐水。
3. 在解剖显微镜下定位主要的盆神经节（PG）。使用昆虫针暴露神经节。通过精细解剖，寻找从神经节发出并延伸至结肠的一条细小神经分支（图1），并在靠近神经节处切断该神经。
   注意：图1 展示的是位于盆神经节（PG）远端的一条神经分支的记录结果。该神经可能包含盆神经和腰交感神经内脏传入纤维的混合成分。此外，也可选择在盆神经（PN）和/或腰交感神经（LSN）位于盆神经节（PG）近端的位置进行记录。
4. 开启加热浴装置，加热克雷布斯溶液，使记录室温度维持在 34 ± 0.5 °C。

5. 吸附电极的制备

1. 取一支预先拉制好的玻璃移液管（步骤2），在解剖显微镜下进行检查。用一对镊子折断电极尖端，使其尺寸与待记录神经的直径相匹配。
2. 将尖端靠近打火机火焰进行斜面处理。

6. 电生理记录

1. 将斜面电极连接到电极夹持器上。将一个10 mL注射器连接到夹持器的侧端口，以向电极施加负压或正压。
2. 将夹持器连接到生物放大器的前置放大头级，并将头级安装到操纵器上。
3. 移动电极至组织浴槽，通过施加轻柔的负压，用Krebs溶液填充电极，直至溶液接触夹持器中的银丝。将电极尖端靠近神经的切断端，并施加负压，将神经吸入电极内。继续施加更强的负压，使约1 mm长的神经被拉入电极并形成紧密封接。
4. 打开生物放大器，将滤波器设置为300 - 3,000 Hz。在示波器上监测信号，并使用配备峰电位数据处理软件的计算机记录神经信号（采样率为20 kHz）和管腔内压力信号（采样率为100 Hz）。

7. 测试结肠传入神经敏感性

1. 通过关闭引流套管上的三通阀，同时持续进行管腔内灌注，对结肠施加梯度性扩张。监测管腔内压力，直至达到 60 mmHg，此时打开引流套管上的三通阀。
2. 每隔 15 分钟重复此操作。通过管腔外或管腔内给予药物，以检测传入神经的化学敏感性。

结果

图1 实验装置示意图 离体 “管状”结肠制备，附迷走神经背核（PG）远端神经的代表性记录。该神经可能包含盆腔和腰交感内脏传入纤维的混合成分。在正常大鼠的制备中，结肠传入神经通常表现出低水平的不规则自发性放电活动。结肠的斜坡式扩张可诱导放电频率逐渐增加图1B). 每条神经的机械感受特性通过绘制管腔内压力-传入神经反应曲线来表示（图1C）。可比较各组之间的平均压力-反应曲线（即， 对照组与处理组）以揭示处理是否改变结肠传入神经的机械感觉特性（参见 Rong 等¹³ 有关压力-传入反应曲线的详细信息）。

或者，也可从邻近颈下神经节（PG）的颈神经（PN）或腰交感神经（LSN）进行记...

讨论

本文介绍的方案是一种相对简单的实验方法，用于评估大鼠结肠传入神经的电生理特性。该方案（从组织解剖到建立神经记录）通常需要约2小时完成。组织采集（步骤3）和制备吸附电极（步骤5）是关键步骤。在组织解剖过程中，必须能够准确定位盆神经节（PG）、下肠神经（LSN）和阴部神经（PN），并注意避免损伤神经节和神经。玻璃移液管的尖端必须折断并磨成与神经束相匹配的大小。

该制备通常可维持数小时的活性，可用于研究结直肠传入神经的机械敏感性、化学敏感性及药理学特性。与 "平板式" 制备¹¹，其中通过黏膜刷拭或环向拉伸施加机械刺激，这种 "管" 制备方法可实现梯度或分级扩张，类似于在麻醉或清醒动物中应用结直肠扩张（CRD）来评估内脏痛。采用类似方案，Wynn 等³ 研究了嘌呤能受体在大鼠结肠传入神经机械感受转导中的作用，发现结肠传入神经可被浴施ATP（P2X和P2Y受体激动剂）及α,β-meATP（P2X受体激动剂）激活，且P2受体拮抗剂可减弱扩张诱导的盆腔...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
戊巴比妥钠	上海西唐生物科技有限公司	B558
辣椒素	Sigma	M2028
电极拉制仪	MicroData Instrument 公司	PMP107
神经记录系统（生物放大器）	Digitimer 公司	Neurolog System
A/D 转换器	剑桥电子设计公司	Micro1401
数据处理软件	剑桥电子设计公司	Spike2 版本 6
银丝	世界精密仪器公司	EP12
玻璃管	世界精密仪器公司	1B150-4
电极夹持器	世界精密仪器公司	MEH3SBW
加热浴槽	Grant	GR150
解剖显微镜	徕卡	Zoom2000
解剖显微镜	世界精密仪器公司	PZMIII-BS
打火机	任意	NA
手术器械	世界精密仪器公司	NA
昆虫针	自制，使用 0.1 mm 不锈钢丝	NA
三维操纵器	世界精密仪器公司	KITF-R
大鼠	任意	NA	可使用任意品系/性别。