此处描述的AWESAM方案是快速、简便且经济地从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的最佳方法。AWESAM星形胶质细胞表现出自发性Ca2+ 与星形胶质细胞相似的信号传导、形态及基因表达谱 体内.
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摘要
摘要
AWESAM（a low-成本 e简单 s星状 a星形胶质细胞 m方法）方案提供了一种快速、简单且经济的方式，用于大量制备 体内类似的小鼠和大鼠星形胶质细胞单培养：可从不同脑区分离脑细胞，经过一周的细胞培养后，将培养皿置于摇床中，在培养箱内振荡6小时，以去除非星形胶质细胞。剩余的星形胶质细胞随后用星形胶质细胞特异性培养基（称为NB+H）传代至新培养板中。NB+H含有低浓度的肝素结合性表皮生长因子样生长因子（HBEGF），用于替代培养基中的血清。在NB+H中培养后，AWESAM星形胶质细胞呈现星状形态，并具有细长的突起。此外，这些星形胶质细胞具有更强的 体内-样基因表达，优于以往已发表方法生成的星形胶质细胞。Ca2+ 因此，可以对靠近膜的成像、囊泡动力学及其他事件在精细的星形胶质细胞突起中进行研究 体外, 例如，使用活细胞共聚焦显微镜或全内反射荧光显微镜进行观察。值得注意的是，AWESAM 星形胶质细胞也表现出自发的 Ca2+ 与星形胶质细胞类似的信号传导 体内.
引言
星形胶质细胞通过营养支持、血流调节、突触信号传递与可塑性以及细胞间通讯影响脑功能——这些机制均围绕星形胶质细胞的细小突起展开。本文所述的AWESAM方案可在无神经元及其他胶质细胞干扰的情况下研究这些突起，具有重要应用价值 例如，因为许多蛋白质的表达甚至Ca2+ 不同脑细胞类型间信号传导的重叠问题。此外，该方法克服了以往可用技术的局限性。特别是，本方案提供 体内-样形态（具有细长突起的星形星形胶质细胞）及基因表达，方法快速、简便且经济。
细胞形态、基因表达以及许多其他调控过程直接受到环境的影响。在培养皿中，这包括周围细胞释放的因子，也包括细胞生长的培养基。对于星形胶质细胞，既往已有报道指出，HBEGF 可诱导其形成星状形态。1 但还被发现可使星形胶质细胞去分化2然而，后续使用了较低浓度的HBEGF以生成更多的 体内通过两种不同方案的RNA测序鉴定出的类星形胶质细胞3,4此外，无论采用何种实验方案，星形胶质细胞的形态均会随培养基成分的变化而改变。4神经基础培养基中添加低浓度HBEGF是培养星形星形胶质细胞的最佳选择，而其他培养基成分（例如，含血清的DMEM）会产生多边形细胞（即使通过免疫贴壁法 freshly isolated 的星形胶质细胞也是如此）。
AWESAM 方案克服了先前培养星形胶质细胞单层培养物技术的缺点4. 以往培养星形胶质细胞单层培养物的技术存在以下缺点：细胞呈现多边形形态，这与星形胶质细胞典型的星状形态不符 体内 （分子动力学方法）5；方案的耗时和成本（从诱导性多能干细胞制备星形胶质细胞需要三个月时间，并需要多种试剂，包括昂贵的生长因子）6；材料用量较少（免疫淘选法）3；星形胶质细胞的去分化以及对三维基质的需求（Puschmann 等.)1,2相比之下，AWESAM 方案提供了： 体内-样形态（具有细长突起的星形星形胶质细胞）；一种快速、简便且经济的方法；大量材料；以及最主要的 体内样基因表达相比经免疫筛选和MD培养的星形胶质细胞更为相似。此外，二维培养便于研究Ca2+ 信号传导和囊泡回收在细小突起中以及膜附近事件中的作用例如，三维培养中无法进行全内反射荧光显微镜观察）。
自1980年发表以来，MD方法已被广泛使用5，提供了一种简单快速的多边形星形胶质细胞单培养技术。简而言之，MD方法包括在含胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中培养混合脑细胞，随后通过振荡步骤富集星形胶质细胞（因为其他所有脑细胞类型均从培养皿上脱落），并在相同培养基中继续培养。添加FCS的DMEM培养基已被广泛用于多种其他细胞类型，包括成纤维细胞、脂肪细胞以及多种癌细胞系，这些细胞在培养中均表现出与MD法培养的星形胶质细胞相似的多边形形态。直至21世纪初7，人们很少考虑针对星形胶质细胞特异性优化培养基，以促进其典型的星状形态形成 体内. 2011年发表的一项方案确实能够获得此类星状形态：该方法称为免疫贴壁法，采用专为培养星形胶质细胞优化的无血清培养基3. 采用该方法，将新分离的脑细胞依次暴露于一系列包被有特异性靶向细胞表面蛋白抗体的培养皿中，以富集星形胶质细胞。尽管该方法存在一些局限性 体内-样形态和免疫筛选星形胶质细胞的表达谱，大多数 体外 研究仍依赖于MD星形胶质细胞方法。MD方法简单快速，而免疫粘附法在培养的第一天包含更多复杂且耗时的步骤（例如更长的酶消化时间、仔细分层不同密度的溶液、免疫粘附过程本身以及多次离心步骤——这些均在接种前完成）。然而，通过使用更特化的培养基，AWESAM方法兼具MD方法的快速性以及 体内免疫筛选方案中类似形态的特征
总体而言，AWESAM 方案对于深入研究具有重要价值 体内-样星形胶质细胞，在二维单培养体系中分离自神经元及其他胶质细胞（如先前所表征）4 通过免疫染色、免疫印迹和RNA测序）可实现对星形胶质细胞细小突起的研究，并便于观察自发性Ca²⁺2+ 靠近细胞膜的信号传导与事件例如，通过全内反射荧光显微镜成像。
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方案
此处描述的所有动物实验均按照德国动物福利指南进行。
注意：本方案的时间线和主要步骤如图1所示。
1. 准备工作
- 配制以下溶液。
- 配制用于培养多角形MD星形胶质细胞的DMEM+：含10%胎牛血清（FCS）、100 U青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基。
- 配制用于培养星状星形胶质细胞的NB+H：Neurobasal培养基，添加 5 ng/mL HBEGF、1× B-27补充剂、1×谷氨酰胺补充剂、100 U青霉素和100 µg/mL链霉素。
注意：可预先配制高浓度的HBEGF分装液，于-20 °C保存，使用时再加入培养基中。 - 配制解剖用培养基（含10 mM HEPES的HBSS溶液）。
- 在15 mL离心管中分装6–7 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液和6–7 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。分装后可于-20 °C保存，使用前在37 °C水浴中解冻。
- 在开始实验前一天，用5 mL 0.04%聚乙烯亚胺（PEI）溶液分别包被10 cm组织培养处理过的培养皿。
- 次日，吸除PEI溶液，用去离子蒸馏水清洗培养皿两次。每皿加入12 mL DMEM+，并在37 °C、5% CO2的培养箱中预平衡至少30分钟，之后方可接种细胞。
- 准备解剖区域：在超净台内的层流解剖罩中，将两个装有解剖培养基的10 cm培养皿置于冰上。针对每个需分离的脑区（例如，皮层、海马），准备一个15- mL离心管，内含14 mL解剖培养基，并置于冰上。将解剖工具（精细剪刀、Dumont #3和#5镊子）喷洒70%乙醇消毒后，放置于解剖显微镜旁的罩内。
2. 大鼠或小鼠脑解剖
注意：可使用小鼠和大鼠。也可使用出生8天以上（P8）的动物（我们测试至P12），但脑膜的去除将变得越来越困难。此外，细胞产量和活力会下降，因为来自较年老动物的脑细胞已形成复杂的突起和连接，在组织解离过程中可能断裂，导致细胞死亡增加。本文描述的是大脑皮层的制备方法，但其他脑区也可使用。
- 将0.05%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中。
- 安乐死动物（用于获取E19仔鼠的妊娠大鼠，或P0-P8动物），通过缓慢升高CO₂浓度实施2 浓度，并分离脑组织。以下步骤需采用无菌操作技术。
- 若使用胚胎组织，首先将胚胎从子宫中取出并打开胚囊，然后立即用剪刀剪下头部。待所有头部切除后，将其转移至预冷的解剖液中。
- 将头部浸入培养基后，用镊子切开皮肤和颅骨（幼年动物的皮肤和颅骨均较柔软），并夹除小脑。小心将余下的脑组织从颅腔中撬起并取出。
注意：2至4个E19胚胎可提供足够的组织，用于在解剖当天接种至少八块10 cm培养皿的皮层星形胶质细胞，每皿接种500,000个细胞。
- 将头部浸入培养基后，用镊子切开皮肤和颅骨（幼年动物的皮肤和颅骨均较柔软），并夹除小脑。小心将余下的脑组织从颅腔中撬起并取出。
- 对于新生或较大的幼鼠，使用剪刀剪下头部，并从后脑至鼻尖沿中线直线剪开皮肤以分离脑组织。将皮肤拨开，小心地左右剪开颅骨，然后抬起颅骨。切除小脑，再将剩余脑组织撬起并取出。
注意：2至3只P0-P8天的幼鼠可提供足量组织，用于至少 8 个以指定密度接种的 10 cm 培养皿，内含皮层星形胶质细胞 每皿500,000个细胞，用于解剖当天。 - 将大脑皮层与下方的中脑结构分离。将镊子插入两半球之间的纵裂，然后将镊子沿垂直于纵裂的方向插入一侧半球的皮层与中脑结构之间，夹住并分离该侧半球。
- 使用镊子去除每个半球（及其海马）的所有脑膜，然后分离海马。如果需要海马星形胶质细胞，将每个海马转移至预冷的含有14 mL解剖培养基的15 mL离心管中。
- 如果需要特定脑区，可从每个半球的皮层中进一步去除其他区域（例如，额叶皮层）。将用于生成星形胶质细胞的任何皮层组织切成不超过1 mm的碎块3将所有皮层组织样本收集到一个预先装有冰上放置的解剖液的15 mL离心管中。
3. 组织消化与解离
- 收集完所有组织块后，等待其沉降至管底，然后尽可能吸除上清培养基。
- 使用刻度移液管加入 2–3 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并将试管置于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。
注意：应迅速将胰蛋白酶-EDTA从移液管中释放，以混匀组织块，随后再次静置使其沉淀。 - 小心吸除胰蛋白酶-EDTA，尽量减少残留液体，使组织块保留在管底。
- 加入 5 mL 预冷的解剖培养基以去除残留的胰蛋白酶-EDTA。将移液管插入管子上部侧面进行吹打，以混匀组织块。
- 吸除解剖培养基，尽量减少残留液体。用预冷的解剖培养基重复此洗涤步骤两次。
- 最后一次洗涤后，使用 1,000 µL 移液枪头加入 1 mL 已恢复至室温的 DMEM+，通过上下吹打重悬组织，注意避免产生气泡。
注意：必须避免产生气泡，因为这可能改变溶液的 pH 值，而星形胶质细胞对 pH 变化非常敏感。 - 将一个 100 µm 细胞滤网置于 50 mL 管口，并用 4.5 mL 预冷的 DMEM+ 预先润湿滤膜。
- 将 1 mL 解离后的组织悬液通过移液枪加至细胞滤网上，并再加入 4.5 mL 预冷的 DMEM+，以冲洗细胞穿过滤网。
4. 通过传代培养进行星形胶质细胞富集的细胞接种
- 计数细胞， 例如通过将10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝稀释液混合，并将混合液移液至血细胞计数板上进行计数。
- 每10厘米培养皿中接种500,000个细胞于12 mL DMEM+培养基中。
注意：DMEM+ 对星形胶质细胞的生长有益，其效果优于对神经元或小胶质细胞。在摇床振荡过程中，作用于孔板内玻璃盖玻片上的物理力远强于作用于10 cm培养皿（无盖玻片）的力。若在24孔板上直接进行细胞振荡，细胞会变得不健康甚至死亡。仅在振荡结束后，方可将星形胶质细胞接种至24孔板。 - 将细胞培养物置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养2 七天。
- 第6天（即振荡传代细胞的前一天），按照步骤5所述方法制备PEI包被的培养板。
5. 细胞传代
- 传代前一天，用0.04% PEI包被细胞培养板。
- 进行免疫细胞化学、病毒转导或质粒转染时，使用24孔板或6孔板（每孔分别含有经灭菌的12 mm或25 mm玻璃盖玻片）。
- 将玻璃盖玻片在70%乙醇中孵育至少1 h以灭菌，然后用去离子蒸馏水洗涤三次，再将盖玻片放入孔板中。
- 每张12 mm盖玻片加入至少70 µL 0.04% PEI（置于24孔板中），每张25 mm盖玻片加入600 µL 0.04% PEI（置于6孔板中）。
- 对于蛋白质印迹或RNA测序分析，解剖后已含有细胞的10 cm培养皿可继续使用。只需轻轻晃动培养皿，随后用1x PBS洗涤细胞，并直接加入NB+H处理（无需转移至新的培养皿）。
- 第几天 体外 解剖后第7天，将含有细胞的10 cm培养皿置于含DMEM+的培养箱内，放在摇床上以110 rpm振荡6 h。
- 用去离子蒸馏水冲洗覆有PEI的盖玻片两次。向培养板中加入NB+H培养基（24孔板每孔500 µL，6孔板每孔2 mL）。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中预平衡2 同时振荡10 cm培养皿，或至少30分钟。
- 在6小时振荡结束前20-30分钟，将1×PBS、DMEM+、NB+H和0.25%胰蛋白酶-EDTA置于水浴中预热至37 °C。
- 摇晃6小时后，将培养皿从摇床取下，并立即用每皿10 mL预热的1×PBS更换培养基（该培养基含有脱落的神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞）。
注意：必须立即吸除含有脱落细胞的旧培养基，以防止非星形胶质细胞重新贴壁。 - 吸除 PBS，每皿加入 3 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA。将每皿置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 4 分钟。2.
注意：若准备用于 Western blot 或 RNA-Seq 的样品，则不要加入胰蛋白酶-EDTA。相反，应将 PBS 替换为 12 mL 预热的 NB+H，随后可将培养物放回培养箱中继续培养。 - 向每皿3 mL胰蛋白酶-EDTA中加入5 mL预热的DMEM+，用5 mL血清移液管吹打使细胞脱离培养皿，并将细胞悬液收集至50 mL离心管中。
注意：从培养皿底部直接吸取——随着细胞脱落，培养皿底部会变得越来越清晰。必须使用含血清的培养基（替代 DMEM+），因为血清可使胰蛋白酶失活。 - 将细胞悬液在20 °C下以3,220 x g离心4分钟。
- 移除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL预热的NB+H中。
6. 星形胶质细胞终末培养的细胞接种
- 计数细胞。
- 在6孔板中每孔接种20,000个细胞（每孔加入2 mL NB+H培养基），或在24孔板中每孔接种5,000个细胞（每孔加入500 µL NB+H培养基）。
- 将细胞培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中，直至进行后续处理或分析。
- 每周更换一半培养基。
注意：在低营养环境中，星形胶质细胞停止增殖，但残留的小胶质细胞仍可增殖（尽管根据我们的经验，AWESAM培养物中未出现小胶质细胞）。每周更换一半培养基可防止任何可能残留的小胶质细胞富集8，且单层培养物可保持健康状态至少三周。
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结果
星形胶质细胞与神经元共培养并在NB+培养基中生长，2周后呈现星状形态（图2）。除了NB+培养基外，共培养的星形胶质细胞还暴露于未知的神经元来源因子，这些因子可能有助于其存活和形态形成。相比之下，在DMEM+培养基中作为单层培养（传代前通过振荡去除其他细胞类型）的MD星形胶质细胞，2周后呈多边形。振荡后在NB+H培养基中培养的AWESAM星形胶质细胞，2周后则呈现具有许多细长突起的星状形态。
我们先前的研究表明，AWESAM 星形胶质细胞的 RNA 表达谱更接近于星形胶质细胞 体内 与MD和免疫筛选的星形胶质细胞相比4在星形胶质细胞特异性蛋白表达方面，皮层星形胶质细胞高表达 ALDH1L1，低表达 GFAP 体内12这也适用于AWESAM星形胶质细胞，ALDH1L1...
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讨论
方案中的四个步骤至关重要：1）将HBEGF浓度精确配制为5 ng/mL，因为浓度的微小增加可能导致培养物不成熟， 例如，10 ng/mL HBEGF 可使星形胶质细胞去分化4；2）避免在含有组织或细胞的溶液中产生气泡，因为气泡可能改变pH值并影响星形胶质细胞的健康；3）预先平衡培养基，以达到培养健康星形胶质细胞所需的最适pH值和温度；4）每周仅更换一半培养基，因为当营养充足且培养基定期更换时，残留的小胶质细胞增殖的可能性较低8 （尽管到目前为止在AWESAM培养物中尚未发现小胶质细胞）。关于最后一点，需要注意的是，不应完全去除培养物中星形胶质细胞来源的因子，因为这些因子可能有助于星形胶质细胞的存活、分化和增殖。
必须使用DIV14或更早代次的培养物作为成熟星形胶质细胞的来源（但在转导或转染步骤中可使用较早代次的培养物），因为早于DIV14的星形胶质细胞仍具有神经干细胞潜能9。对于病毒转导，可在DIV7时对神经元与星形胶质细...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢欧洲研究理事会（FP7/260916）、亚历山大·冯·洪堡基金会（Sofja Kovalevskaja）以及德国研究基金会（DE1951 和 SFB889）提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300054 | 使用前在 37 ºC 水浴中预热 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | 使用前在 37 ºC 水浴中预热 |
| B-27 添加剂 | Gibco | 17504-044 | 50X 储存液 |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X 储存液 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15070-063 | 50X 储存液；青霉素：5000 U/ml；链霉素：5000 µg/ml |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | 不含 L-谷氨酰胺 |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm 尼龙细胞筛 | BD | 352360 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| 实验室摇床 | Heidolph | Rotamax 120 | 置于细胞培养孵育箱内使用 |
| 离心机 | Eppendorf | 5810 R |
参考文献
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