此处描述的AWESAM方案是快速、简便且经济地从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的最佳方法。AWESAM星形胶质细胞表现出自发性Ca2+ 与星形胶质细胞相似的信号传导、形态及基因表达谱 体内.
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摘要
摘要
AWESAM（a low-成本 e简单 s星状 a星形胶质细胞 m方法）方案提供了一种快速、简单且经济的方式，用于大量制备 体内类似的小鼠和大鼠星形胶质细胞单培养：可从不同脑区分离脑细胞，经过一周的细胞培养后，将培养皿置于摇床中，在培养箱内振荡6小时，以去除非星形胶质细胞。剩余的星形胶质细胞随后用星形胶质细胞特异性培养基（称为NB+H）传代至新培养板中。NB+H含有低浓度的肝素结合性表皮生长因子样生长因子（HBEGF），用于替代培养基中的血清。在NB+H中培养后，AWESAM星形胶质细胞呈现星状形态，并具有细长的突起。此外，这些星形胶质细胞具有更强的 体内-样基因表达，优于以往已发表方法生成的星形胶质细胞。Ca2+ 因此，可以对靠近膜的成像、囊泡动力学及其他事件在精细的星形胶质细胞突起中进行研究 体外, 例如，使用活细胞共聚焦显微镜或全内反射荧光显微镜进行观察。值得注意的是，AWESAM 星形胶质细胞也表现出自发的 Ca2+ 与星形胶质细胞类似的信号传导 体内.
引言
星形胶质细胞通过营养支持、血流调节、突触信号传递与可塑性以及细胞间通讯影响脑功能——这些机制均围绕星形胶质细胞的细小突起展开。本文所述的AWESAM方案可在无神经元及其他胶质细胞干扰的情况下研究这些突起，具有重要应用价值 例如，因为许多蛋白质的表达甚至Ca2+ 不同脑细胞类型间信号传导的重叠问题。此外，该方法克服了以往可用技术的局限性。特别是，本方案提供 体内-样形态（具有细长突起的星形星形胶质细胞）及基因表达，方法快速、简便且经济。
细胞形态、基因表达以及许多其他调控过程直接受到环境的影响。在培养皿中，这包括周围细胞释放的因子，也包括细胞生长的培养基。对于星形胶质细胞，既往已有报道指出，HBEGF 可诱导其形成星状形态。1 但还被发现可使星形胶质细胞去分化2然而，后续使用了较低浓度的HBEGF以生成更多的 体内通过两种不同方案的RNA测序鉴定出的类星形胶质细胞3,4此外，无论采用何种实验方案，星形胶质细胞的形态均会随培养基成分的变化而改变。4神经基础培养基中添加低浓度HBEGF是培养星形星形胶质细胞的最佳选择，而其他培养基成分（例如<....
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方案
此处描述的所有动物实验均按照德国动物福利指南进行。
注意：本方案的时间线和主要步骤如图1所示。
1. 准备工作
- 配制以下溶液。
- 配制用于培养多角形MD星形胶质细胞的DMEM+：含10%胎牛血清（FCS）、100 U青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基。
- 配制用于培养星状星形胶质细胞的NB+H：Neurobasal培养基，添加 5 ng/mL HBEGF、1× B-27补充剂、1×谷氨酰胺补充剂、100 U青霉素和100 µg/mL链霉素。
注意：可预先配制高浓度的HBEGF分装液，于-20 °C保存，使用时再加入培养基中。 - 配制解剖用培养基（含10 mM HEPES的HBSS溶液）。
- 在15 mL离心管中分装6–7 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液和6–7 mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。分装后可于-20 °C保存，使用前在37 °C水浴中解冻。
- 在开始实验前一天，用5 mL 0.04%聚乙烯亚胺（PEI）溶液分别包被10 cm组织培养处理过的培养皿。
- 次日，吸除PEI溶液，用去离子蒸馏水清洗培养皿....
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结果
星形胶质细胞与神经元共培养并在NB+培养基中生长，2周后呈现星状形态（图2）。除了NB+培养基外，共培养的星形胶质细胞还暴露于未知的神经元来源因子，这些因子可能有助于其存活和形态形成。相比之下，在DMEM+培养基中作为单层培养（传代前通过振荡去除其他细胞类型）的MD星形胶质细胞，2周后呈多边形。振荡后在NB+H培养基中培养的AWESAM星形胶质细胞，2周后则呈现具有许多细长突起的星状形态。
我们先前的研究表明，AWESAM 星形胶质细胞的 RNA 表达谱更接近于星形胶质细胞 体内 与MD和免疫筛选的星形胶质细胞相比4在星形胶质细胞特异性蛋白表达方面，皮层星形胶质细胞高表达 ALDH1L1，低表达 GFAP 体内12这也适用于AWESAM星形胶质细胞，ALDH1L1.......
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讨论
方案中的四个步骤至关重要：1）将HBEGF浓度精确配制为5 ng/mL，因为浓度的微小增加可能导致培养物不成熟， 例如，10 ng/mL HBEGF 可使星形胶质细胞去分化4；2）避免在含有组织或细胞的溶液中产生气泡，因为气泡可能改变pH值并影响星形胶质细胞的健康；3）预先平衡培养基，以达到培养健康星形胶质细胞所需的最适pH值和温度；4）每周仅更换一半培养基，因为当营养充足且培养基定期更换时，残留的小胶质细胞增殖的可能性较低8 （尽管到目前为止在AWESAM培养物中尚未发现小胶质细胞）。关于最后一点，需要注意的是，不应完全去除培养物中星形胶质细胞来源的因子，因为这些因子可能有助于星形胶质细胞的存活、分化和增殖。
必须使用DIV14或更早代次的培养物作为成熟星形胶质细胞的来源（但在转导或转染步骤中可使用较早代次的培养物），因为早于DIV14的星形胶质细胞仍具有神经干细胞潜能9。对于病毒转导，可在DIV7时对神经元与星形胶质细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢欧洲研究理事会（FP7/260916）、亚历山大·冯·洪堡基金会（Sofja Kovalevskaja）以及德国研究基金会（DE1951 和 SFB889）提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300054 | 使用前在 37 ºC 水浴中预热 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | 使用前在 37 ºC 水浴中预热 |
| B-27 添加剂 | Gibco | 17504-044 | 50X 储存液 |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X 储存液 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15070-063 | 50X 储存液；青霉素：5000 U/ml；链霉素：5000 µg/ml |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | 不含 L-谷氨酰胺 |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm 尼龙细胞筛 | BD | 352360 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| 实验室摇床 | Heidolph | Rotamax 120 | 置于细胞培养孵育箱内使用 |
| 离心机 | Eppendorf | 5810 R |
参考文献
- Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
- Puschmann, T. B., et al.
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