体内检测与分析人细胞中Rb蛋白的SUMO化修饰

摘要

小泛素样修饰蛋白（SUMO）家族蛋白可共价结合至靶蛋白的赖氨酸残基，从而调控多种细胞过程。本文介绍了一种在人源细胞中检测视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白在内源性和外源性条件下发生SUMO化修饰的实验方案。

摘要

蛋白质的翻译后修饰对于细胞内信号转导的精确调控至关重要。在这些修饰中，小泛素样修饰物（SUMO）是一种类似泛素的蛋白质，可共价结合到多种靶蛋白的赖氨酸残基上，从而调控基因转录、DNA修复、蛋白质相互作用与降解、亚细胞转运以及信号转导等细胞过程。检测蛋白质SUMO化最常用的方法基于在细菌中表达和纯化重组标签蛋白，以实现对SUMO化事件的分析 体外 一种简单且适用于解决机制问题的生化反应。然而，由于SUMO化过程的复杂性 体内在细胞内检测和分析蛋白质的SUMO化修饰具有较大挑战性，尤其是在内源性条件下。本文作者近期的一项研究发现，内源性的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）蛋白——一种对细胞周期进程起负向调控作用的关键肿瘤抑制蛋白——在G1早期阶段会发生特异性的SUMO化修饰。本文介绍了一种在人源细胞中检测和分析Rb蛋白在内源性和外源性条件下SUMO化修饰的实验方案。该方案适用于在人源细胞中对Rb蛋白的SUMO化修饰进行表型与功能研究，同时也可广泛应用于其他多种SUMO化靶蛋白的相关研究。

引言

真核细胞中细胞周期进程的精确调控依赖于一个严密的调控网络，该网络确保特定事件按有序顺序发生^1,2。该网络中的关键调控因子之一是视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白，这是首个被克隆的肿瘤抑制因子^1,3。Rb蛋白被认为是一种细胞周期进程的负调控因子，尤其在G0/G1期向S期转换以及肿瘤生长过程中发挥重要作用^4,5。Rb功能的缺失可直接导致儿童中最常见的眼内恶性肿瘤——视网膜母细胞瘤，或促进多种其他类型癌症的发生⁵。此外，Rb还参与多种细胞通路，包括细胞分化、染色质重塑以及线粒体介导的细胞凋亡^3,6,7。

翻译后修饰在调控RB功能中起着关键作用^8，9。磷酸化就是其中一种修饰，通常导致Rb失活。在静....

方案

1. 早G1期检测内源性Rb的SUMO化修饰

1. 细胞培养与细胞周期同步化。
   1. 将 HEK293 细胞维持在含有杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、1% 青霉素-链霉素（Pen-Strep）和 10% 胎牛血清（FBS）的生长培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
   2. 将 HEK293 细胞同步至 G0 期。
      1. 使用血细胞计数板对 HEK293 细胞进行计数，并在处理前 24 小时，将约 1.5 × 10⁷ 个细胞接种于含 25 mL 生长培养基的 15 cm 培养皿中。当细胞融合度达到 70%–80% 时，吸除培养基，并用 5 mL 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
      2. 加入含 1% 青霉素-链霉素的 25 mL DMEM，于 37 °C 培养 72 小时。用 3 mL 冰冷 PBS 将细胞从培养皿上洗下，转移至新的 5 mL 离心管中。
      3. 取少量细胞用于流式细胞术进行细胞周期分析（步骤 1.2）；将剩余大部分细胞在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集，并储存于超低温冰箱中，待进行 Rb SUMO 化分析。
   3. 为获得 G1 期细胞，在完成 G0 期同步化后，移除 DMEM 并重新加入新鲜生长培养基，使 HEK293 细胞重新进入细胞....

结果

为了检测细胞周期进程中内源性Rb蛋白的SUMO化修饰，本研究首先按照本文方案部分所述，将HEK293细胞同步于细胞周期的五个不同阶段（G0、早期G1、G1、S和G2/M）。通过使用碘化丙啶对核酸进行染色，并结合流式细胞术分析，确认了细胞同步化的质量（图1）。随后，收集细胞并用变性RIPA缓冲液裂解。实验中加入SUMO蛋白酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺，使其终浓度为20 mM，以在实验过程中维持天然的SUMO信号。在变性条件下对内源性Rb蛋白进行免疫沉淀，以阻断非共价的非特异性相互作用，再经抗SUMO1抗体进行后续的蛋白质印迹分析，结果特异性地在早期G1阶段检测到SUMO信号（图2）。尽管在S/G2/M阶段整体SUMO化水平升高，但在Rb蛋白发生SUMO化的时间点，其修饰水平并未发生变化（图2，上样对照面板）。该结果提示，Rb蛋白的SUMO化并非全局SUMO连接活性改变的简单结果。因此，这些结果表明，.......

讨论

本文介绍了一种在人类细胞中检测和分析内源性Rb蛋白SUMO化修饰的实验方案。由于该方法专门针对内源性Rb蛋白，且不改变整体SUMO相关信号，因此是在完全自然的生理条件下研究Rb蛋白SUMO修饰的重要工具。

为实现这一目标，需注意以下几点：1）尽管SUMO包含四种亚型（SUMO1-4，每种由不同的基因编码），但与泛素化相比，所有SUMO蛋白的丰度均显著较低；2）对于大多数SUMO靶蛋白而言，在稳态下仅有少量特定蛋白发生SUMO化修饰，这是SUMO连接酶与去连接酶之间持续竞争的结果^14,21；3）SUMO靶蛋白可经历快速的SUMO化与去SUMO化循环。例如，本文作者近期获得的数据表明，Rb-SUMO1仅在G1早期存在极短的时间窗口，这与SUMO化是一种可逆且高度动态的过程这一概念一致¹³。上述因素均使得直接检测特定蛋白的内源性SUMO化修饰具有挑战性。因此，成功检测该修饰的关键在于明确其发生的精确条件。例如，在本方案中，细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	26140079
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010023
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
胸腺嘧啶	Sigma	T9250
诺考达唑	Sigma	M1404
碘化丙啶	Thermo Fisher Scientific	P3566
Triton X-100	AMRESCO	694
核糖核酸酶A	Thermo Fisher Scientific	EN0531
N-乙基马来酰亚胺	Sigma	E3876
十二烷基硫酸钠（SDS）	AMRESCO	M107
Nonidet P-40 替代物（NP-40）	AMRESCO	M158
蛋白酶抑制剂	Roche	5892970001
小鼠免疫球蛋白G（IgG）	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Rb 抗体	Cell Signaling Technology	#9309
Protein A/G-Sepharose 琼脂糖珠	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
Lipofectamine-2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖珠	Qiagen	30230
咪唑	Sigma	I0250
4%-20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶	BIO-RAD	4561096
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Millipore	IPVH00010
Tween-20	AMRESCO	M147
微管蛋白抗体	Abmart	M30109
SUMO1 抗体	Thermo Fisher Scientific	33-2044
GFP 抗体	Abmart	M20004
辣根过氧化物酶（HRP）二抗	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
增强型化学发光（ECL）试剂盒	Thermo Fisher Scientific	32106