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方法文章

体内检测与分析人细胞中Rb蛋白的SUMO化修饰

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DOI：

10.3791/56096

⸱

2017年11月2日

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Eye and ENT Hospital of Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小泛素样修饰蛋白（SUMO）家族蛋白可共价结合至靶蛋白的赖氨酸残基，从而调控多种细胞过程。本文介绍了一种在人源细胞中检测视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白在内源性和外源性条件下发生SUMO化修饰的实验方案。

摘要

蛋白质的翻译后修饰对于细胞内信号转导的精确调控至关重要。在这些修饰中，小泛素样修饰物（SUMO）是一种类似泛素的蛋白质，可共价结合到多种靶蛋白的赖氨酸残基上，从而调控基因转录、DNA修复、蛋白质相互作用与降解、亚细胞转运以及信号转导等细胞过程。检测蛋白质SUMO化最常用的方法基于在细菌中表达和纯化重组标签蛋白，以实现对SUMO化事件的分析 体外 一种简单且适用于解决机制问题的生化反应。然而，由于SUMO化过程的复杂性 体内在细胞内检测和分析蛋白质的SUMO化修饰具有较大挑战性，尤其是在内源性条件下。本文作者近期的一项研究发现，内源性的视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）蛋白——一种对细胞周期进程起负向调控作用的关键肿瘤抑制蛋白——在G1早期阶段会发生特异性的SUMO化修饰。本文介绍了一种在人源细胞中检测和分析Rb蛋白在内源性和外源性条件下SUMO化修饰的实验方案。该方案适用于在人源细胞中对Rb蛋白的SUMO化修饰进行表型与功能研究，同时也可广泛应用于其他多种SUMO化靶蛋白的相关研究。

引言

真核细胞中细胞周期进程的精确调控依赖于一个严密的调控网络，该网络确保特定事件按有序顺序发生1,2。该网络中的关键调控因子之一是视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白，这是首个被克隆的肿瘤抑制因子1,3。Rb蛋白被认为是一种细胞周期进程的负调控因子，尤其在G0/G1期向S期转换以及肿瘤生长过程中发挥重要作用4,5。Rb功能的缺失可直接导致儿童中最常见的眼内恶性肿瘤——视网膜母细胞瘤，或促进多种其他类型癌症的发生5。此外，Rb还参与多种细胞通路，包括细胞分化、染色质重塑以及线粒体介导的细胞凋亡3,6,7。

翻译后修饰在调控RB功能中起着关键作用8，9。磷酸化就是其中一种修饰，通常导致Rb失活。在静止的G0期细胞中，Rb处于活性状态且磷酸化水平较低。随着细胞进入G0/G1期，Rb被一系列周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs）和周期蛋白（如cyclin E/CDK2和cyclin D/CDK4/6）依次高度磷酸化，从而使Rb失活，并消除其抑制细胞周期相关基因表达的能力4，10。Rb还可被小泛素样修饰蛋白（SUMO）修饰11，12，13。

SUMO 是一种类泛素蛋白，可共价结合到多种靶蛋白上。它在多种细胞过程中起关键作用，包括细胞周期调控、转录、蛋白质的细胞定位与降解、转运以及 DNA 修复14,15,16,17,18。SUMO 共价修饰通路包括二聚体 SUMO E1 激活酶 SAE1/UBA2、单一的 E2 结合酶 Ubc9、多种 E3 连接酶以及特异性的 SUMO 蛋白酶。通常，新生的 SUMO 蛋白必须经过蛋白水解加工以生成成熟形式。成熟的 SUMO 由 E1 异源二聚体激活后转移至 E2 酶 Ubc9。最终，SUMO 的 C 末端甘氨酸共价连接至底物蛋白上的赖氨酸残基，该过程通常由 E3 连接酶促进。特异性的蛋白酶可将 SUMO 从修饰后的底物上切除。本文作者先前的研究表明，Rb 蛋白的 SUMO 化修饰可增强其与 CDK2 的结合，导致在 G1 早期阶段发生过度磷酸化，这一过程对细胞周期的推进至关重要13。我们还证明，Rb 蛋白 SUMO 化的缺失会导致细胞增殖能力下降。此外，最近的研究表明，Rb 的 SUMO 化修饰可保护其免遭蛋白酶体介导的降解，从而提高细胞中 Rb 蛋白的水平19。因此，SUMO 化修饰在 Rb 蛋白参与的多种细胞功能中发挥着重要作用。为了进一步研究 Rb SUMO 化修饰的功能后果及其生理相关性，建立一种有效的方法来分析人细胞或患者组织中 Rb 蛋白的 SUMO 修饰状态显得尤为重要。

SUMO化是一种可逆且高度动态的过程。因此，通常很难在完全内源性条件下检测到SUMO修饰的蛋白质。本文介绍了一种检测内源性Rb蛋白SUMO化的方法。此外，还展示了如何检测外源性Rb蛋白的SUMO化，包括野生型Rb及其SUMO缺陷型突变体11。Jacobs 等 特别描述了一种通过Ubc9融合导向SUMO化（UFDS）特异性增强特定底物SUMO修饰的方法20。基于该方法，本实验方案详细说明了如何分析强制性Rb SUMO化及其功能后果。鉴于已有数百种SUMO底物被报道，并且许多基于蛋白质组学的实验已鉴定出更多潜在的SUMO底物，本方案可用于分析这些蛋白在人源细胞中的SUMO修饰情况。

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方案

1. 早G1期检测内源性Rb的SUMO化修饰

  1. 细胞培养与细胞周期同步化。
    1. 将 HEK293 细胞维持在含有杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、1% 青霉素-链霉素（Pen-Strep）和 10% 胎牛血清（FBS）的生长培养基中，于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
    2. 将 HEK293 细胞同步至 G0 期。
      1. 使用血细胞计数板对 HEK293 细胞进行计数，并在处理前 24 小时，将约 1.5 × 107 个细胞接种于含 25 mL 生长培养基的 15 cm 培养皿中。当细胞融合度达到 70%–80% 时，吸除培养基，并用 5 mL 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
      2. 加入含 1% 青霉素-链霉素的 25 mL DMEM，于 37 °C 培养 72 小时。用 3 mL 冰冷 PBS 将细胞从培养皿上洗下，转移至新的 5 mL 离心管中。
      3. 取少量细胞用于流式细胞术进行细胞周期分析（步骤 1.2）；将剩余大部分细胞在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集，并储存于超低温冰箱中，待进行 Rb SUMO 化分析。
    3. 为获得 G1 期细胞，在完成 G0 期同步化后，移除 DMEM 并重新加入新鲜生长培养基，使 HEK293 细胞重新进入细胞周期。随后在不同 G1 期时间点（早期 G1：30 分钟；G1：2 小时）收集细胞，用于细胞周期分析及进一步的 SUMO 化检测。
    4. 采用双胸苷阻断法将 HEK293 细胞同步至 S 期。
      1. 将 HEK293 细胞培养至约 50% 融合度，用预热 PBS 洗涤细胞，然后加入含 2.5 mM 胸苷的生长培养基，作用 18 小时（第一次阻断）。
      2. 移除含胸苷的培养基，用预热 PBS 洗涤细胞两次，再加入新鲜生长培养基释放细胞，培养 14 小时。
      3. 用移液器吸弃培养基，再次加入含 2.5 mM 胸苷的生长培养基，继续作用 18 小时（第二次阻断），随后进行细胞周期分析和 Rb SUMO 化检测。
    5. 对于 G2/M 期同步化，将约 1.5 × 107 个 HEK293 细胞接种于含 25 mL 生长培养基的 15 cm 培养皿中，培养 24 小时。然后向培养基中加入诺考达唑，使其终浓度为 400 ng/mL。最后于 37 °C 培养 16 小时，再进行细胞周期分析和 Rb SUMO 化检测。
  2. 通过流式细胞术进行细胞周期分析。
    1. 将同步化后的 HEK293 细胞重悬于 PBS 中，然后用冰上预冷的 70% 乙醇在 4 °C 固定 2 小时。注意：为尽量减少细胞聚集，应在轻柔涡旋条件下，将细胞悬液逐滴加入冰上预冷的 100% 乙醇中，以获得终浓度为 70% 的乙醇溶液。
    2. 以 500 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，并用 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后重复离心步骤。
    3. 向细胞中加入含 50 µg/mL 核酸染料碘化丙啶（propidium iodide）、0.1% Triton X-100 和 1 µg/mL 核糖核酸酶 A（RNase A）的 500 µL PBS，充分混匀。于 37 °C 孵育 15 分钟。
    4. 将样品置于 4 °C 保存，待进行流式细胞术分析。
  3. 内源性 Rb 蛋白的免疫沉淀。
    1. 制备 HEK293 细胞裂解液。
      1. 通过将同步化后的 HEK293 细胞轻轻重悬于 1 mL 冰上预冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（表 1）中进行裂解，缓冲液中需新鲜添加 20 mM 的 N-乙基马来酰亚胺（N-Ethylmaleimide），该物质为异肽酶抑制剂，可抑制 SUMO 蛋白酶活性并稳定 SUMO 结合物。
      2. 在冰上进一步通过 Dounce 匀浆器、超声处理或使用连接 2 mL 注射器的 21 号针头反复吹打 10 次，使细胞充分均质化。随后将样品在冰上孵育 5 分钟。
        注意：RIPA 缓冲液中的阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）对于后续 Rb-SUMO 的检测至关重要，因其可消除 Rb 蛋白与其他非 Rb SUMO 化蛋白之间非共价相互作用所导致的非特异性 SUMO 信号。
    2. 在 4 °C 下以 18,000 × g 离心 30 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
      注意：本步骤可暂停。蛋白样品可在 -80 °C 下保存至少 6 个月。
    3. 为后续 Western blot 实验准备各样品的输入对照（input control），取上述上清液的一小部分保存于新管中，并在 -80 °C 下储存。
    4. 向上述上清液中加入 1 µg 与单克隆 Rb 抗体同种属、同亚型的非特异性小鼠免疫球蛋白 G（IgG），以及 20 µL 50% 蛋白 A/G-Sepharose 悬液。于 4 °C 轻柔旋转孵育 1 小时。
    5. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 3 分钟，小心收集上清液，避免扰动沉淀珠，转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。向每份样品中加入 5 µL Rb 一抗和 40 µL 50% 蛋白 A/G-Sepharose 悬液，于 4 °C 轻柔旋转孵育过夜。
    6. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 3 分钟收集沉淀珠，用移液器小心吸除上清液。注意：为避免珠子损失，切勿将珠子吸干。
    7. 用 1 mL RIPA 缓冲液洗涤珠子四次，每次均在 4 °C 下旋转混匀 15 分钟。每次洗涤后以 3,000 × g 低速离心 3 分钟收集珠子，并弃去上清液。
    8. 最后一次洗涤后，将珠子重悬于 30 µL 1× 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液（表 1）中，充分混匀。
      1. 将样品置于 100 °C 金属浴中加热 10 分钟。以 12,000 × g 离心 1 分钟使珠子沉淀。小心收集上清液，避免扰动珠子，转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    9. 通过 4%–20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶电泳和 Western blot 分析样品，或于 -20 °C 保存以备后续使用。

2. 人类细胞中6XHis标签外源Rb蛋白SUMO化修饰的分析

  1. 细胞培养与转染
    1. 接种约 6 × 106 在10 cm培养皿中培养HEK293细胞，在正常细胞培养条件下用生长培养基孵育24小时，使细胞融合度达到75%–85%。转染前，弃去生长培养基，加入6 mL预热的低血清培养基（参见 材料表然后将培养皿放回培养箱中。
    2. 对于Rb组成型SUMO化检测，分别在1.5 mL微量离心管中，向500 µL低血清培养基加入15 µg的6XHis标签Rb-Ubc9-WT、Rb-Ubc9-C93S、Ubc9-WT和Ubc9-C93S质粒。
      1. 为了分析野生型 Rb 及其 SUMO 化缺陷型突变体的 SUMO 结合情况，将 10 µg 的 6XHis 标签 Rb-WT 或 Rb-K720R 质粒与 GFP-SUMO1（10 µg）在 1.5 mL 微型离心管中加入 500 µL 低血清培养基中混合13.
    3. 同时，在另一个离心管中，混合50 µL转染试剂（参见 材料表在500 µL低血清培养基中重悬，并于室温孵育5 min。
    4. 将上述两种分别制备的溶液充分混合，室温孵育15分钟。将转染试剂/质粒复合物加入细胞中，在5% CO₂条件下继续培养8小时。2 和 37 °C。
    5. 将低血清培养基更换为完全培养基，转染后在正常培养条件下继续培养细胞48小时。
  2. 6XHis标签Rb蛋白的镍亲和沉淀
    1. 裂解转染的HEK293细胞，并按照第1.3.1节所述方法提取总蛋白。
    2. 在 4 °C 条件下，以 18,000 x g 离心细胞裂解液 30 分钟。小心收集上清液并转移至洁净的离心管中。
      注意：蛋白质可在 -80 °C 冻存超过 6 个月。
    3. 为后续的Western blot准备每个样本的输入对照，将上述上清液的一小部分保存至新管中，并于-80 °C保存。
    4. 在1.5 mL微量离心管中，每份样品用RIPA缓冲液洗涤25 µL的50%镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖珠两次。在4 °C下以3,000 x g离心3 min，收集珠子。
    5. 向每个样品中加入1 M咪唑，使其终浓度为10 mM。然后将每个样品加入含有已制备的Ni-NTA琼脂糖珠的离心管中。
    6. 将珠子与裂解液在 4 °C 下轻柔旋转孵育 2 小时。在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 3 分钟，然后用移液器小心吸除上清液。为避免珠子损失，请勿将珠子完全吸干。
    7. 用含有 20 mM 咪唑的 1 mL 洗涤缓冲液洗涤珠子（表1每次在4 °C下旋转混匀15分钟。在4 °C下以3,000 x g离心3分钟收集珠子，并弃去上清液。
    8. 最后一次洗涤后，加入含有 250 mM 咪唑的 30 µL 洗脱缓冲液（表1向每个样品中加入适量溶液并轻轻振荡混匀。然后在 4 °C 下孵育 20 分钟，以洗脱蛋白质。
    9. 将每个样品与6× SDS-PAGE上样缓冲液混合（表1然后，将试管置于加热块中在100 °C下孵育10分钟。
    10. 在12,000 × g离心1分钟以沉淀磁珠。小心收集上清液，避免扰动磁珠，并将样品转移至1.5 ml微量离心管中。样品可直接用于Western blot分析，或于-20 °C保存以备后续使用。

3. 蛋白质印迹

  1. 将此前步骤获得的免疫沉淀或拉下样品上样至4-20%梯度SDS-PAGE凝胶中，在120 V条件下电泳90分钟，以实现蛋白质分离。
  2. 采用槽式转移法，在4 °C、300 mA条件下电转印90分钟，将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液（表1）在室温下封闭PVDF膜1小时。
  3. 在含3%牛血清白蛋白（BSA）的抗体稀释缓冲液（表1）中，4 °C孵育一抗过夜。一抗工作浓度建议为：0.5 µg/mL（抗SUMO1抗体），或1:2000（抗Rb和抗Tubulin抗体），或1:5,000（抗GFP和抗His抗体）。
  4. 使用1×含Tween的Tris缓冲盐水（TBST）缓冲液（表1）洗涤膜3次，每次10分钟。将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的种属特异性二抗在含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液（表1）中按1:5,000稀释后孵育。再次使用1× TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
  5. 将膜与增强型化学发光（ECL）工作液孵育。用保鲜膜包裹膜，并根据信号强度决定曝光X射线胶片的时间。

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结果

为了检测细胞周期进程中内源性Rb蛋白的SUMO化修饰，本研究首先按照本文方案部分所述，将HEK293细胞同步于细胞周期的五个不同阶段（G0、早期G1、G1、S和G2/M）。通过使用碘化丙啶对核酸进行染色，并结合流式细胞术分析，确认了细胞同步化的质量（图1）。随后，收集细胞并用变性RIPA缓冲液裂解。实验中加入SUMO蛋白酶抑制剂N-乙基马来酰亚胺，使其终浓度为20 mM，以在实验过程中维持天然的SUMO信号。在变性条件下对内源性Rb蛋白进行免疫沉淀，以阻断非共价的非特异性相互作用，再经抗SUMO1抗体进行后续的蛋白质印迹分析，结果特异性地在早期G1阶段检测到SUMO信号（图2）。尽管在S/G2/M阶段整体SUMO化水平升高，但在Rb蛋白发生SUMO化的时间点，其修饰水平并未发生变化（图2，上样对照面板）。该结果提示，Rb蛋白的SUMO化并非全局SUMO连接活性改变的简单结果。因此，这些结果表明，...

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讨论

本文介绍了一种在人类细胞中检测和分析内源性Rb蛋白SUMO化修饰的实验方案。由于该方法专门针对内源性Rb蛋白，且不改变整体SUMO相关信号，因此是在完全自然的生理条件下研究Rb蛋白SUMO修饰的重要工具。

为实现这一目标，需注意以下几点：1）尽管SUMO包含四种亚型（SUMO1-4，每种由不同的基因编码），但与泛素化相比，所有SUMO蛋白的丰度均显著较低；2）对于大多数SUMO靶蛋白而言，在稳态下仅有少量特定蛋白发生SUMO化修饰，这是SUMO连接酶与去连接酶之间持续竞争的结果14,21；3）SUMO靶蛋白可经历快速的SUMO化与去SUMO化循环。例如，本文作者近期获得的数据表明，Rb-SUMO1仅在G1早期存在极短的时间窗口，这与SUMO化是一种可逆且高度动态的过程这一概念一致13。上述因素均使得直接检测特定蛋白的内源性SUMO化修饰具有挑战性。因此，成功检测该修饰的关键在于明确其发生的精确条件。例如，在本方案中，细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由上海市科学技术委员会（资助号：14411961800）和国家自然科学基金委员会（资助号：81300805）的资助项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific31985070
胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific26140079
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific10010023
胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
胸腺嘧啶SigmaT9250
诺考达唑SigmaM1404
碘化丙啶Thermo Fisher ScientificP3566
Triton X-100 AMRESCO694
核糖核酸酶A Thermo Fisher ScientificEN0531
N-乙基马来酰亚胺SigmaE3876 
十二烷基硫酸钠（SDS）AMRESCOM107
Nonidet P-40 替代物（NP-40）AMRESCOM158
蛋白酶抑制剂Roche5892970001
小鼠免疫球蛋白G（IgG）Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Rb 抗体Cell Signaling Technology#9309
Protein A/G-Sepharose 琼脂糖珠Santa Cruz Biotechnologysc-2003
Lipofectamine-2000 Thermo Fisher Scientific11668019
镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖珠Qiagen30230
咪唑SigmaI0250
4%-20% 梯度 SDS-PAGE 凝胶BIO-RAD4561096
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜MilliporeIPVH00010
Tween-20AMRESCOM147
微管蛋白抗体AbmartM30109
SUMO1 抗体Thermo Fisher Scientific33-2044
GFP 抗体AbmartM20004
辣根过氧化物酶（HRP）二抗Jackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
增强型化学发光（ECL）试剂盒Thermo Fisher Scientific32106

参考文献

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